α-亚麻酸(ALA)是人体必需脂肪酸,在代谢过程中可以转化为二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。ALA含3个不饱和双键,具有维持细胞结构和功能、调节脂质代谢、抗炎、调节免疫系统、促进大脑发育等生理功能[1]。然而,ALA对光、热和氧气敏感,水溶性有限,从而限制了人体对ALA的吸收与利用。目前,乳液递送体系由于制备相对简单且生产成本较低,已成为功能性脂质的常用载体。乳液递送体系是由表面活性剂、油相和水相组成的热力学稳定体系[2],能通过包埋ALA提升其储存稳定性与生物利用率。其中,蛋白质和磷脂因良好的亲水亲油性,常作为乳液的乳化剂和稳定剂;多酚则常用作天然抗氧化剂,增强乳液的抗氧化能力。

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶叶中多羟基酚类化合物的总称,主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素和酚酸等,其中儿茶素类占TP总含量的60%～80%,具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗菌等多种生理活性[3]。然而,TP因多酚羟基结构极性高、水溶性强而脂溶性差、稳定性低,且带有苦涩味,在食品工业中的应用受到限制。乳清分离蛋白(whey protein isolate, WPI)是纯度较高的优质球状蛋白,乳化性和生物利用度良好[4]。大豆卵磷脂(soy lecithin,SL)是两性乳化剂,兼具乳化与抗氧化功效。已有研究表明,多酚与蛋白质、磷脂与多酚、蛋白质与磷脂之间均可通过非共价作用(疏水相互作用、静电作用、氢键等)形成复合物,且这些复合物的功能特性均比单一成分更优[5-8]。例如,TP与WPI结合可增强乳液物理稳定性,磷脂与TP结合能提升生物活性物质生物利用度,WPI与磷脂结合可增强乳液乳化能力,这为构建WPI-SL-TP三元复合体系提供了理论依据。目前,WPI、SL、TP三者形成三元复合物的作用机制研究较少,复合物结构与功能特性之间的关系、复合物对ALA包埋率及稳定性的影响也缺乏系统研究。因此,本研究拟构建WPI-SL-TP三元复合物,考察TP添加量对其结构及功能特性的影响,并基于该复合物制备ALA乳液,探究复合物对ALA包埋率及乳液稳定性的影响,旨在为开发高效的ALA乳液递送体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶多酚(纯度98%)、乳清分离蛋白(纯度90%)、大豆卵磷脂(纯度99%)、α-亚麻酸(纯度60%),上海源叶生物科技有限公司;实验所用其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL-104型精密电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;78-1型磁力加热搅拌器,金坛市金城国胜试验仪器厂;F-7000型荧光光谱仪,日本Hitachi公司;MOS450型圆二色谱仪,法国Bio-Logic公司;VERTX70型傅里叶变换红外光谱仪,德国Bruker公司;UV-2600型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;Multiskan TM型全波长多功能酶标仪,美国Bio-Tek公司;IKA-digitalT18型乳化剪切机,德国徕卡仪器有限公司;XMTD-204型恒温水浴锅,上海比朗仪器有限公司;LGJ型冷冻干燥机,北京亚星仪器科技有限公司;Nano-ZS90型粒径电位分析仪,英国马尔文公司;OCA-15EC型光学接触角计,德国Data Physics Instruments;S-3400N型钨灯丝扫描电子显微镜,日本日立公司;SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Deltavision OMX SR型共聚焦激光扫描显微镜,美国通用电气医疗集团;UGC-24M型氮吹仪,北京优晟联合科技有限公司;78920B型气相色谱仪,美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 WPI-SL-TP三元复合物的制备

将WPI和SL溶于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.4),质量浓度为10 mg/mL,使用磁力搅拌器搅拌60 min,保证WPI与SL充分溶解。将0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的茶多酚分别溶于WPI和SL溶液中并在室温下磁力搅拌2 h,使WPI、SL、TP充分混合互作,4 ℃冷藏过夜,制备WPI-SL-TP三元复合物溶液。

1.3.2 WPI-SL-TP三元复合物的结构表征

1.3.2.1 整体构象测定

荧光光谱的测定参考Chen等[9]的方法并进行适当修改。样品质量浓度稀释到0.2 mg/mL,使用荧光光谱仪测定不同温度下样品的内源荧光强度,于298、303、308 K温度条件下水浴30 min,设置激发波长280 nm、发射波长300～500 nm、狭缝宽度5 nm、扫描速度1 200 nm/min。

三元复合物的荧光猝灭。TP对WPI-SL复合物的作用机制有2种,分别是动态猝灭和静态猝灭。利用Stern-Volmer方程[式(1)]确定TP与WPI-SL复合的荧光猝灭模式[10]。

=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q] 。

(1)

式(1)中,F和F0分别为WPI-SL-TP和WPI-SL复合物的荧光强度;[Q]为猝灭剂(TP)浓度,mol/L;KSV为Stern-Volmer猝灭常数;Kq为双分子猝灭速率常数;τ0为无猝灭剂时的荧光团寿命,生物大摩尔分子的平均寿命,约为10 -8 s。

三元复合物的结合常数Ka和结合位点数n可由式(2)计算。

(2)

根据热力学参数(ΔG、ΔH、ΔS)的大小和正负,可以预测三元复合物的相互作用力类型。ΔH表示分子间键能的增加,ΔS表示结合过程中系统的无序变化[11]。蛋白质与配体之间的相互作用通常包括静电力、氢键、疏水力和范德华力等。物质之间的作用力类型可以通过热力学参数的正负和大小判断。当ΔS>0时,可能为疏水及静电作用力;当ΔS<0时,可能为氢键和范德华力;当ΔH>0且ΔS>0时,即为典型疏水作用力;ΔH<0且ΔS<0时,为氢键和范德华力;ΔH≈0或很小且ΔS>0时,为静电作用力;ΔH<0时,静电作用为主要作用力[12]。结合过程的热力学参数,可根据式(3)、式(4)计算ΔH、ΔS、ΔG的变化。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS 。

(4)

式(3)、式(4)中,R为理想气体常数,8.314 J/(mol·K);T为温度,K。

1.3.2.2 圆二色谱法二级结构测定

根据Abadía等[13]的方法并进行适当修改。稀释样品至蛋白质质量浓度为0.10 mg/mL,光谱扫描范围190～260 nm,扫描速度1 nm/s,狭缝宽度1 nm。 在实验中通入持续流量为5 L/min的氮气保护光源,室温下每个样品重复测定3次。

1.3.2.3 红外光谱法二级结构测定

参考Yi等[14]的红外压片法,用冷冻干燥机将样品冻干制成粉末,样品与溴化钾质量比为1∶50,样品1.2 mg,扫描范围4 000～400 cm-1,扫描64次。

1.3.2.4 三级结构测定

在室温条件下,将样品稀释为0.2 mg/mL的均匀溶液,利用紫外可见分光光度计测定复合物的蛋白空间结构展开情况。设定波长范围为240～600 nm。

1.3.2.5 微观结构观察

采用真空喷雾法对样品进行处理。将样品放置在离蒸发源10～15 cm的样品台上喷金。用扫描电子显微镜观察其结构,工作电压为5 kV,放大倍数为1 000倍[15]。

1.3.3 WPI-SL-TP三元复合物功能特性的测定

1.3.3.1 表面疏水性的测定

利用疏水性ANS荧光探针检测WPI-SL-TP三元复合物的表面疏水性(H0)。稀释样品至质量浓度为0.125～2.000 mg/mL,激发波长为390 nm、发射波长为470 nm。通过荧光强度与蛋白质含量的线性回归方程,确定初始阶段斜率,即为H0[16]。

1.3.3.2 接触角的测定

利用光学接触角计测定样品在油水界面的接触角θ。采用座滴法测量,将冻干的样品粉末压制成圆柱形薄片(直径10 mm、厚度1 mm),通过特定的高精度注射器将2 mL去离子水滴到薄片上。液滴图像由摄像机拍摄,液滴轮廓由Advance软件自动拟合并计算样品的接触角。每个样品重复测量3次。

1.3.3.3 乳化性的测定

参考姜来等[17]的方法并稍加修改,测定乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)。用高速均质机将2 mL大豆油与18 mL复合物溶液12 000 r/min均质2 min,制成粗乳液。分别在均质结束后0、10 min从底部取50 μL乳液,并用0.1 mg/mL SDS溶液稀释。通过分光光度计在500 nm检测稀释液的吸光度,并分别根据式(5)和式(6)计算EAI(m2/g)和ESI(min)。

(5)

(6)

式(5)、式(6)中,A0为0 min时乳液吸光度;N为稀释倍数;ρ为复合物质量浓度,g/mL;L为比色皿的光程,1 cm;φ为油相体积分数:A10为10 min时乳液吸光度。

1.3.4 ALA乳液递送体系的制备及性能测定

1.3.4.1 递送体系的制备

将ALA以9∶1的水油体积比加入三元复合物溶液中,用剪切均质机以10 000 r/min混合5 min,再以400 W的功率超声6 min。

1.3.4.2 递送体系粒径及Zeta电位的测定

参考Yan等[18]的方法,将乳液用去离子水稀释100倍,测定样品的粒径和Zeta电位。粒子和分散剂的折射率分别为1.480和1.33,吸收参数为0.001。上样量为1 mL,测量温度为25 ℃,温度平衡时间为2 min。

1.3.4.3 递送体系显微结构的测定

乳液的显微结构用激光共聚焦显微镜测定,参照Pan等[19]的方法并进行适当修改。取1 mL乳液,加入10 μL尼罗红和10 μL尼罗蓝染色液,在黑暗条件下避光染色60 min。染色完成后,取10 μL乳液滴在载玻片上,盖上盖玻片,在共聚焦显微镜20倍镜下观察。激发波长为488 nm(尼罗红)及638 nm(尼罗蓝),扫描频率为100 Hz。

1.3.4.4 递送体系包埋率的测定

乳液中ALA的包埋率采用气相色谱-质谱联用法测定。采用透析法分离出乳液中游离的ALA。将乳液置于预处理后的透析袋(MWCO,10 kDa)中,在4 ℃下用1 000 mL超纯水透析48 h,每8 h更换透析液。取10 mL透析后的乳液和未透析的乳液与20 mL氯仿-甲醇(体积比为2∶1)、10 mL氯化钠溶液(质量分数为0.73%)进行混合,超声10 min后离心10 min(4 ℃,4 000 r/min)。收集下层有机相,重复萃取步骤。合并2次有机相,氮吹后超低温储存备用。向含有ALA的试管中加入1 mL正己烷,在25 ℃条件下,超声3～5 min,再添加1 mL甲醇和1 mL氢氧化钾-甲醇溶液(1 mol/L),继续超声1 min。 将混合物水浴加热(60 ℃,30 min),水浴期间每隔5 min振荡摇匀1次。水浴结束后,加入1 mL正己烷和4 mL超纯水,静置分层后,吸取1 mL上层有机相,向其中加入0.5 g无水硫酸钠。在25 ℃、4 000 r/min条件下离心5 min,取200 μL上清液加入4 mL正己烷稀释,加入40 μL水杨酸甲酯溶液(5.905 mg/mL),过0.22 μm有机滤膜,然后进行气相分析计算乳液中ALA质量浓度(mg/mL),并按式(7)计算包埋率。

包埋率

(7)

式(7)中,w1为透析后乳液中ALA的质量浓度,w2为未透析乳液中ALA的质量浓度。

1.3.4.5 递送体系物理稳定性的测定

乳液的物理稳定性通过热稳定性和pH稳定性表征。热稳定性:将乳液置于不同温度(50、60、70、80、90 ℃)条件下保温1 h,然后将样品冷却至 25 ℃,分析液滴粒径和Zeta电位。pH稳定性:将新鲜制备的乳液pH值调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,在 25 ℃下孵育1 h,分析pH值对粒径和Zeta电位的影响。

1.4 数据处理

样品重复测定3次,结果以平均值±标准偏差表示。统计分析均采用SPSS Statistics 27和Origin 2021软件,显著水平为0.05,其中,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 WPI-SL-TP三元复合物的结构分析

2.1.1 整体构象分析

荧光光谱可直观反映小分子与蛋白质的结合特性,揭示二者结合方式、结合常数及作用力类型等关键信息。在280 nm激发波长下,WPI的荧光信号主要来自芳香族氨基酸的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基;其中Tyr的激发能可转移至Trp,导致Tyr荧光猝灭、Trp荧光增强[20]。不同温度条件下WPI-SL-TP三元复合物的荧光光谱见图1。由图1可知,不同温度条件下,随TP质量浓度的升高,复合物的荧光强度均呈显著下降趋势,且最大发射波长发生红移。这一现象表明,TP与WPI-SL复合物发生了相互作用,从而引起了荧光猝灭[21],同时证实复合物的三级结构发生了改变。TP对WPI-SL复合物的荧光猝灭曲线见图2。通过直线斜率计算可获得不同温度下的Stern-Volmer猝灭常数(KSV)及双分子猝灭速率常数(Kq),结果见表1。由表1可知,KSV随温度升高呈下降趋势,且各温度下的Kq均显著高于最大散射碰撞猝灭常数[2.0×1010 L/(mol·s)]。 这一结果表明,WPI-SL-TP三元复合物的荧光猝灭机制为静态猝灭,其本质是TP与WPI-SL形成了稳定的复合物。

结合位点数(n)和结合常数(Ka)可反映相互作用的强度与模式,具体结果见表1。由表1可知,不同温度下结合位点n分别为0.868 1、0.913 0、1.055 7,均接近1,WPI-SL上有一个与TP结合的位点。结合常数Ka随温度升高呈上升趋势,298、303、308 K时分别为1.93×104、2.05×104、4.85×104 L/mol,数量级稳定在104,证实TP与WPI-SL间存在较强且紧密的相互作用。温度升高导致Ka和n值升高,证实了疏水相互作用参与了复合物的结合过程[22]。

蛋白质与配体的相互作用力类型可通过热力学参数(ΔG、ΔH、ΔS)判断。WPI-SL-TP三元复合物的热力学参数见表2。由表2的热力学参数可知,TP与WPI-SL的复合体系ΔG<0,表明二者的结合为自由能降低的自发过程。同时,焓变ΔH>0、熵变ΔS>0,符合疏水相互作用的典型热力学特征。

2.1.2 圆二色谱法二级结构分析

WPI-SL-TP三元复合物的圆二色光谱和蛋白质二级结构含量见图3、表3。圆二色光谱可表征蛋白质二级结构,其中208 nm与222 nm处的负峰为α-螺旋的特征吸收峰[23]。由图3和表3可见,加入TP后,WPI-SL在208 nm和222 nm处的峰强度显著升高,对应的α-螺旋相对含量从12.70%±0.64%增至19.07%±0.56%,β-折叠相对含量从41.62%±1.44%降至30.36%±0.99%,同时无规则卷曲含量略有变化。这一结构转变与氢键的断裂及重组直接相关,TP与WPI-SL的结合首先导致蛋白质原有链内氢键断裂,使β-折叠结构解离,随后分子间相互作用重塑,促使其向α-螺旋及无规则卷曲转化。这种结构变化可能暴露了WPI分子中的负电荷残基,进而影响复合物的稳定性[24]。

2.1.3 红外光谱法二级结构分析

傅里叶变换红外光谱可通过特征吸收峰的位置与强度变化表征分子间相互作用及分子结构特征。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物的红外光谱见图4。如图 4所示,WPI-SL-TP三元复合物在1 600～1 700 cm-1(酰胺Ⅰ波段,CO伸缩振动)、1 500～1 600 cm-1(酰胺Ⅱ波段,C—N与N—H振动叠加)、3 300～3 500 cm-1(酰胺A波段,N—H伸缩振动)及2 800～3 100 cm-1(C—H拉伸振动)等特征波段均出现吸收峰[25],且峰值低于WPI-SL二元复合物。TP的加入使三元复合物特征峰偏移,酰胺Ⅰ、Ⅱ、A波段峰位分别从1 655.50、1 542.96、3 292.80 cm-1移至1 651.24、1 542.55、3 292.59 cm-1,表明TP与WPI-SL之间存在氢键相互作用[26]。这与圆二色光谱中“β-折叠向α-螺旋转化”的结果一致,因为β-折叠结构的稳定依赖于分子间氢键,氢键的重构直接导致二级结构变化。此外,C—H拉伸波段特征峰从2 924.38 cm-1偏移至2 924.03 cm-1,表明SL与WPI的相互作用可能降低了复合物的整体疏水性[14]。

2.1.4 三级结构分析

紫外光谱可通过芳香族氨基酸残基的吸收特征反映蛋白质空间构象变化,表征蛋白质与小分子之间的相互作用。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物的紫外光谱见图5。图5显示,随着TP质量浓度的升高,复合物在280 nm(Trp、Tyr残基的特征吸收峰)附近的吸光度逐渐增大,且最大吸收波长发生红移[27]。吸光度增强可能源于多酚的增色效应,TP的酚羟基提升了体系摩尔吸光系数;而红移则表明TP进入WPI的疏水结构域,与芳香族氨基酸残基通过疏水相互作用形成疏水腔,导致残基周围微环境极性增加。这一结果与荧光光谱中的静态猝灭机制及热力学参数分析中的疏水相互作用占主导作用的结论一致,证实了TP与WPI-SL通过非共价作用形成了三元复合物[28]。

2.1.5 微观结构分析

扫描电镜可直观观察复合物的微观结构。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物的微观结构见图6。由图6可知,WPI-SL二元复合物主要呈片层结构与球状结构,整体结构相对完整;而WPI-SL-TP三元复合物表面破碎性增强,呈现更松散、粗糙的形貌特征。不同TP添加量复合物的微观形貌存在显著差异,TP添加量为0.2 mg/mL时,复合物表面开始出现少量孔隙,结构仍相对致密;TP添加量增至0.6 mg/mL时,孔隙数量增多,片层结构更明显;TP添加量达到0.8 mg/mL及以上时,复合物表面孔隙进一步增多,棒状结构和裂缝更显著,整体结构更松散。 该结构变化可能源于TP与WPI-SL间的非共价相互作用,氢键与疏水力的共同作用破坏了WPI-SL复合物原有的致密结构,使球状聚集体在重排过程中发生收缩与破碎,削弱了分子间的聚集强度,促使TP分子嵌入WPI的疏水口袋,最终表现为WPI-SL-TP三元复合物形貌破碎、孔隙增多[29]。

2.2 WPI-SL-TP三元复合物的功能特性分析

2.2.1 表面疏水性分析

表面疏水性(H0)反映了蛋白质分子表面暴露的疏水基团数量,直接影响蛋白质的乳化、发泡等功能特性[30]。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物的表面疏水性见图7。从图7可知,不同TP添加量对复合物表面疏水性的影响不同。TP添加量为0.2 mg/mL时,表面疏水性较未添加TP组略有下降;TP添加量增至0.6 mg/mL时,表面疏水性显著降低;TP添加量达到0.8 mg/mL时,表面疏水性降至较低水平;继续增加TP添加量至1.0 mg/mL,表面疏水性平稳下降到最低。这表明,TP添加量为0～0.8 mg/mL时,其对复合物表面疏水性的降低作用逐渐增强;超过0.8 mg/mL后,调控作用趋于饱和。复合物表面疏水性下降的原因可能是TP 分子通过疏水作用嵌入WPI的内部疏水区域,占据了大量的疏水点位,导致ANS的结合数量减少。β-折叠结构通常位于蛋白质的疏水区域[31],其含量降低直接导致了蛋白质表面疏水性的下降,这与圆二色光谱的分析结论一致。

2.2.2 接触角分析

接触角可评价材料的亲疏水性,影响油水界面的稳定性[32]。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物的接触角见表4。由表4可知,所有样品的接触角均小于90°,表明WPI-SL-TP三元复合物具有亲水性,可稳定水包油(O/W)型乳液。随着TP添加量的增加,接触角均呈现下降趋势。当添加量增至0.6 mg/mL时,接触角迅速降至36.48°;继续增加至1.0 mg/mL时,接触角下降至28.97°,变化趋于平稳。这一变化表明,随着TP添加量增加,复合物亲水性逐渐增强,接触角持续降低。这可能是由于TP分子中富含羟基,其引入增加了体系亲水基团数量,从而增强复合物亲水性、降低其接触角[33]。该结果与表面疏水性分析结论一致,进一步印证了TP的引入可增强复合物的亲水性。

2.2.3 乳化活性分析

乳化活性指数(EAI)反映蛋白质在油水界面的吸附能力,乳化稳定性指数(ESI)反映乳液的长期稳定性。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物乳化活性见图8。由图8(a)可知,与WPI-SL复合物相比,WPI-SL-TP三元复合物的EAI随TP添加量增大而显著升高。TP添加量为0.2 mg/mL时,EAI较未添加TP组显著升高(P<0.05);TP添加量增至0.6 mg/mL时,EAI持续平稳升高;TP添加量达到1.0 mg/mL时,EAI增幅趋缓并达到最大值。EAI的升高与TP引起的蛋白质结构伸展、柔韧性增加有关[34],TP的引入通过非共价相互作用诱导WPI-SL复合物发生二级结构转变,促使蛋白质分子由有序、致密的结构向更伸展、松散的构象转变,分子柔韧性显著提高,有利于疏水基团充分暴露,增强了蛋白质在油水界面的吸附与铺展能力,从而提高乳化活性EAI。由图8(b)可知,与WPI-SL复合物相比,WPI-SL-TP三元复合物的ESI呈现先降低后升高的趋势。TP添加量为0.2 mg/mL时,ESI略有降低;TP添加量增至0.6 mg/mL时,ESI略有上升;TP添加量达到1.0 mg/mL时,EAI平稳上升。ESI的降低可能与高TP质量浓度时较强的分子间静电斥力妨碍了界面蛋白膜的紧密堆积有关[35],这导致界面膜机械强度略有下降。结果表明,由WPI-SL-TP三元复合物稳定的乳液虽易于形成但长期储存会发生界面重排或絮凝。

2.3 基于WPI-SL-TP三元复合物的ALA乳液递送体系性能分析

2.3.1 ALA乳液递送体系显微结构分析

通过激光共聚焦显微镜观察乳液的显微结构,结果见图9。油相和水相用尼罗红和尼罗蓝染色,分别显示为红色和绿色区域。如图9所示,油相被水相包裹,表明WPI-SL-TP三元复合物成功包埋 α-亚麻酸,形成了稳定的液滴。不同TP添加量对乳液显微结构的影响不同,TP添加量为0.2 mg/mL时,乳液液滴出现少量聚集,ALA分散不均;TP添加量增至0.6 mg/mL时,聚集现象最为明显,不利于ALA的均匀递送;TP添加量达到0.8 mg/mL时,液滴分散均匀,无明显聚集,ALA可被均匀包埋并稳定递送;继续增加TP添加量至1.0 mg/mL,液滴分散状态无明显变化。

2.3.2 ALA乳液递送体系包埋率分析

包埋率是衡量乳液递送生物活性物质效率的核心指标。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物乳液的包埋率见图10。由图10可知,未添加TP时,包埋率约为65%;TP添加量为0.2 mg/mL时,包埋率增至72%;TP添加量达到0.8 mg/mL及以上时,包埋率则稳定在80%左右。这表明TP添加量为0～0.6 mg/mL时,对包埋率的提升作用逐渐增强;添加量达到0.8 mg/mL后,包埋率趋于稳定,此时乳液对ALA的包埋效果较优(约80%)。包埋率提高的原因是三元复合物α-螺旋结构与疏水相互作用共同形成了致密的液滴界面膜,有效抑制了ALA渗漏。

2.3.3 ALA乳液递送体系粒径和Zeta电位分析

乳液的粒径与Zeta电位可表征乳液的分散性、均匀性与物理稳定性。不同TP添加量的WPI-SL-TP三元复合物乳液的粒径和Zeta电位见图11。由图11可知,不同TP添加量对乳液的粒径和绝对电位均有显著影响。TP添加量为0.2 mg/mL时,乳液粒径增大,Zeta电位绝对值减小;TP添加量增至0.6 mg/mL时,粒径达到最大,Zeta电位绝对值降至最低,液滴聚集明显;TP添加量达到0.8 mg/mL时,粒径显著减小至最低值(411.37 nm),Zeta电位绝对值显著增大(15.93 mV);继续增加TP添加量至1.0 mg/mL,粒径及Zeta电位均无明显变化。

低剂量TP作用下,复合物结构变化有限,表面电荷增加不明显(Zeta电位绝对值小),且可能因部分疏水基团暴露而促进液滴间疏水聚集[1]。这一结果与扫描电镜观察到的结构特征相符,低TP复合物结构较为致密。当TP添加量达到0.8 mg/mL时,复合物的二级结构发生转变(α-螺旋增加、β-折叠减少),表面携带大量负电荷(Zeta电位绝对值增大),这些变化增强了复合物在液滴表面吸附层的稳定性,通过强烈的静电排斥和可能的空间位阻效应[6],有效抑制了液滴聚集,从而获得分布更均匀的乳液体系。这也与该条件下复合物具有较高乳化活性(EAI)的结果一致。

2.3.4 ALA乳液递送体系物理稳定性分析

高温环境下乳液的粒径、Zeta电位如图12。高温环境下,乳液粒径较常温环境均显著增大,且温度越高,粒径越大;乳液Zeta电位也同步发生波动。这主要是因为高温加速液滴运动,同时促使WPI 疏水氨基酸残基暴露,加剧乳液聚集不稳定性;Zeta电位的变化可能是由于WPI结构的改变导致内部和外部基团的重新分配,乳液液滴表面电荷的特性发生了改变[1]。

2.3.4.1 热稳定性

TP的添加显著提升了乳液的热稳定性,不同TP添加量对热稳定性的影响存在差异。TP添加量为0.2 mg/mL时,粒径增长幅度有所减小;TP添加量增至0.6 mg/mL时,粒径增长幅度进一步减小;TP添加量达到0.8 mg/mL时,粒径增长幅度最小,90 ℃加热后粒径仅达到755 nm,热稳定性较佳;继续增加TP至1.0 mg/mL,热稳定性无明显提升。TP的引入可能通过分子间相互作用稳定了蛋白质的构象,延缓了高温下的展开与聚集。高TP质量浓度(0.8 mg/mL)的复合物形成的乳液稳定性更佳,这归因于其更小的初始液滴尺寸[图12(a)]与更高的界面电荷[图12(b)],有效地抑制了热致聚集。 因此,TP质量浓度为0.8 mg/mL时的乳液表现出较佳的热稳定性。

2.3.4.2 pH稳定性

酸性环境下乳液的粒径、Zeta电位如图13。在酸性环境下,乳液粒径均较中性环境显著增大,尤其在pH值为3～5时,粒径甚至超过1 000 nm,这主要是因为WPI在等电点附近发生聚集并从油水界面解吸,破坏了乳液体系稳定性[36];而乳液Zeta电位无明显变化。经TP改性的三元复合物稳定的乳液,其酸性条件下的稳定性优于未添加TP的WPI-SL体系。这可能是由于TP与蛋白质结合后改变了WPI的表面电荷分布,增强了油滴间静电斥力,从而提升了乳液的pH稳定性。其中TP添加量为0.2 mg/mL时,乳液的缓冲能力较弱;TP添加量为0.4 mg/mL时,乳液的缓冲能力随之增强;继续增加TP至1.0 mg/mL时,乳液的缓冲能力趋于稳定。

3 结 论

本研究为构建ALA高效食品级乳液递送体系,探究了TP添加量对WPI-SL-TP三元复合物结构和功能特性的影响,并研究了基于该复合物的ALA乳液微观结构、包埋效果及递送稳定性。结果显示,TP通过疏水相互作用与WPI-SL以静态猝灭方式结合,诱导蛋白质二级结构从β-折叠向α-螺旋转变。随着TP质量浓度的增加,三元复合物表面疏水性降低、亲水性增强,乳化活性提升但乳化稳定性略微下降。三元复合物的结构与性质直接影响了ALA乳液的性能。TP添加量为0.8 mg/mL时,制备的ALA乳液性能较优,其包埋率高(约80%)、粒径小(411.37 nm)、Zeta电位绝对值高(15.93 mV)、热稳定性优异,能实现对ALA的高效包埋与稳定递送。本研究旨在为ALA的高效利用开辟新途径,也为设计和构建基于蛋白-磷脂-多酚复合物的新型食品级递送体系提供理论依据。

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Structural Characterization of Whey Protein Isolate-Soy Lecithin-Tea Polyphenols Ternary Complex and Stability of Its Emulsion Delivery System of α-Linolenic Acid

ZHANG Zhixing, XU Min, GENG Yimeng, REN Ruiqi, XU Jinglong, XU Jiayu, LIU Lu*

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract： To construct an efficient emulsion delivery system for α-linolenic acid (ALA), tea polyphenols (TP), whey protein isolate (WPI), and soy lecithin (SL) were used as raw materials. The WPI-SL-TP ternary complex was synthesized by varying the mass concentration of TP (0-1.0 mg/mL), followed by the encapsulation of ALA to prepare the emulsion dilivery system. The effects of TP mass concentration on the structural and functional properties of the complex, as well as on the encapsulation efficiency and stability of the ALA emulsion were analyzed. The findings indicated that TP combined with WPI-SL through a static quenching mechanism, primarily driven by hydrophobic interactions, which facilitated the reorganization of the protein secondary structure. With the increase of TP mass concentration, the surface hydrophobicity of the complex decreased, leading to a reduction in the contact angle and an enhancement of emulsifying activity. These structural and property changes directly influenced the performance of the emulsion. The addition of TP increased the encapsulation efficiency of ALA from 65% to approximately 80%. When the TP mass concentration was lower than 0.6 mg/mL, the complex structure remained inadequately developed, resulting in aggregated emulsion droplet, increased particle size, decreased absolute Zeta potential, and reduced ALA encapsulation efficiency. When the mass concentration of TP reached 0.8 mg/mL and above, the complex exhibited enhanced electrostatic repulsion and steric hindrance due to the increased binding of TP. This interaction resulted in the formation of an emulsion characterized by smaller particle size (411.73 nm), higher absolute Zeta potential (15.93 mV), and more uniform dispersion, thereby significantly improving the encapsulation efficiency of ALA. Stability assessments indicated that the emulsion achieved optimal thermal stability at the TP mass concentration of 0.8 mg/mL. This study aimed to provide a theoretical foundation for the design of efficient delivery systems for active lipids, based on the synergistic effects of proteins, phospholipids, and polyphenols.

Keywords： whey protein isolate; soy lecithin; tea polyphenols; interaction mechanism; α-linolenic acid; delivery system

doi：10.12301/spxb202600025

文章编号：2095-6002(2026)03-0068-14

引用格式：张智星, 许敏, 耿艺萌, 等. 乳清分离蛋白-大豆卵磷脂-茶多酚复合物结构表征及其α-亚麻酸乳液递送体系稳定性[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):68-81.

ZHANG Zhixing, XU Min, GENG Yimeng, et al. Structural characterization of whey protein isolate-soy lecithin-tea polyphenols ternary complex and stability of its emulsion delivery system of α-linolenic acid[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):68-81.

中图分类号： TS252.1

文献标志码： A

收稿日期： 2026-01-12

基金项目： 黑龙江省自然科学基金优秀青年基金项目(YQ2023C019)。

Foundation: Heilongjiang Natural Science Foundation Outstanding Youth Project (YQ2023C019).

第一作者： 张智星,男,硕士研究生,研究方向为乳品科学。

*通信作者： 刘 璐,女,副教授,博士,主要从事乳品科学与技术方面的研究。

(责任编辑：张逸群)