金耳(Tremella aurantialba),又称金黄银耳,是一种由金耳菌与毛韧革菌复合共生而成的食药用真菌,在我国云南、四川及西藏等高海拔地区均有分布[1]。作为我国传统的滋补佳品,金耳不仅营养丰富、口感滑润,更因其卓越的营养与药用价值而素有“菌中黄金”之美誉[2]。现代药理学研究表明,多糖是金耳发挥生物活性的核心物质基础,具有显著的抗氧化、抗肿瘤及调节血糖血脂等功效[3]。然而,天然多糖的生物活性往往受限于其分子质量过大、溶解性不佳或缺乏特定活性基团等因素,导致其在实际应用中的生物利用度较低[4],难以充分满足现代医药与功能性食品开发的更高需求。因此,通过化学修饰手段对天然多糖进行分子结构改造,以提升其生物活性,已成为当前多糖研究领域的热点与前沿。

在众多化学修饰方法中,硒化修饰因能将生命必需微量元素硒与多糖有机结合而备受关注。硒被誉为“生命的火种”[5],是人体内谷胱甘肽过氧化物酶等多种抗氧化酶系的活性中心,在清除自由基、保护细胞膜结构、调节免疫功能及预防肿瘤等[6]方面发挥着不可替代的作用。无机硒虽然活性强,但毒性大且生物利用率低。通过化学合成将无机硒转化为有机硒多糖,不仅能有效降低硒的毒性,更可能利用多糖作为载体提高硒的生物相容性[7]。李瑾等[8]研究发现,金银花硒多糖能够显著提高小鼠巨噬细胞的增殖速率,并促进细胞因子分泌,其免疫活性明显高于未硒化的金银花多糖,证明硒多糖有助于降低某些癌症的风险。沈琴等[9]研究发现,硒化后的黑木耳多糖可不同程度地提高多糖的抗氧化能力及降血糖和血压的能力,证实了硒多糖可以从多个方面提供更加全面的保健功能。然而,与金银花、黑木耳等相比,目前针对金耳的研究相对滞后。现有报道多集中于粗多糖的提取工艺优化,关于金耳多糖的化学修饰及其衍生物的研究报道相对较少。

本研究拟通过液体深层发酵技术制备金耳多糖(TAP),并结合乙醇沉淀、Sevage 脱蛋白及膜分离法对其进行纯化,采用硝酸-亚硒酸钠反应体系对所得TAP进行硒化修饰,合成硒化金耳多糖(Se-TAP)。运用色谱和光谱技术,系统比较修饰前后多糖的分子质量分布、单糖组成、化学键合方式及空间构象的变化。在此基础上,将重点评估Se-TAP在体外的抗氧化能力,并考察其对肿瘤细胞的增殖抑制活性。本研究旨在阐明硒化修饰对金耳多糖结构与活性的影响规律,为开发高效、低毒的新型金耳硒多糖功能食品或抗肿瘤辅助药物提供理论依据与数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金耳子实体,购自四川、云南两地(品种为黄白金耳、中华金耳);葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂、正丁醇、MgSO4、KH2PO4、维生素B1、FeCl3、K3[Fe(CN)6]、三氟乙酸(色谱纯)、水杨酸、H2O2(质量分数为30%)、HCl、NaOH、乙醇、维生素C(Vc)等,国药集团化学试剂有限公司;马铃薯、黄豆粉,当地市场购买;1,1-二苯基-2-若基肼(DPPH),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;高糖DMEM培养基、胰蛋白酶-EDTA、青霉素、磷酸盐缓冲液(PBS),美国Hyclone公司;碘化丙啶染料(PI),钙黄绿素染料(Calcein),浙江天杭生物科技股份有限公司;胎牛血清,上海思洳生物科技有限公司;PDA固体培养基(质量分数分别为20%的土豆汁、4%的蔗糖、2%的琼脂、0.1%的KH2PO4 和0.05%的MgSO4),PDB液体培养基(质量分数分别为20%的土豆汁、4%的蔗糖、0.1%的KH2PO4和0.05%的MgSO4)实验所用试剂无特殊说明,均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

Synergy H4型酶标仪,美国BioTek公司;RE-52AA型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;7GI-16M型冷冻离心机、310型细胞培养箱、ICS-5000型离子色谱仪,美国赛默飞世尔科技公司;81-2型恒温磁力搅拌器,上海司乐仪器有限公司;PHS-3C型pH计,梅特勒-托利多国际股份有限公司;IVEXUS型傅里叶变换红外光谱仪,美国尼高力仪器公司;HC-NY15-1X型实验室膜分离系统,成都和诚过滤技术有限公司;SPX-250-Z型恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;Cytation型多功能成像仪,美国伯腾仪器有限公司;Agilent-1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技公司;1525EF高效液相色谱仪,美国沃特世公司。

1.3 实验方法

1.3.1 金耳菌株发酵

采用孢子弹射法从4颗金耳子实体中分离出乳白且表面光滑的金耳菌株[10],再筛选出1株高产多糖菌株,置于甘油管中,在-20 ℃低温环境下保藏备用。将保藏的高产菌株接种至PDA固体培养基,在25 ℃ 恒温条件下培养3～5 d,观察培养基,挑取豌豆大小、菌株形态饱满且表面光滑的单菌落接种至装有100 mL PDB液体培养基的250 mL锥形瓶中,继续在25 ℃条件下,200 r/min转速振荡培养至种子液呈乳白色。按照10%接种比例将种子液转移至发酵液中,置于25 ℃、转速200 r/min的摇床中,恒温振荡培养5 d,获得TAP发酵液。

1.3.2 TAP的提取与纯化

将发酵液进行离心(4 000 r/min,10 min),并用0.45 μm的水系滤膜进行抽滤处理,收集上清液,去除菌体等固体杂质。使用旋转蒸发仪将上清液浓缩至原体积的1/4,随后向浓缩液中缓慢加入4倍体积的无水乙醇,充分混匀后置于4 ℃冰箱中静置过夜,使多糖充分沉淀。离心收集多糖沉淀,用适量去离子水复溶后,采用Sevage法[11]去除蛋白质,再将TAP制备为1 mg/mL水溶液样品,通过HC-NY15-1X实验室膜分离系统进行纯化。每次取5 L稀释液,处理速度5 L/h,膜后压强小于0.1 MPa,温度低于30 ℃[12],过滤到最后截流液还有约1 L时,加超纯水洗脱,重复加水步骤,最终把截流液单独取样。将所得的组分旋转蒸发浓缩后,加入3倍体积的无水乙醇,4 ℃静置过夜,8 000 r/min离心10 min。将纯化后的多糖溶液转移至透析袋中,用蒸馏水透析24 h,去除溶液中的小分子盐类杂质。向透析后的多糖溶液中再次加入无水乙醇沉淀多糖,离心收集沉淀,经冷冻干燥处理后,得到纯化的TAP。

1.3.3 Se-TAP 的制备

参考Li等[13]的方法并稍加修改,制备Se-TAP流程如图1所示。称取0.5 g纯化后的TAP置于锥形瓶中,加入50 mL质量分数为0.5%的硝酸溶液,加热并持续搅拌至多糖完全溶解,得到质量浓度为10 mg/mL的TAP溶液。向多糖溶液中加入0.5 g亚硒酸钠,置于80 ℃恒温水浴中搅拌反应7 h,构建硒-多糖结合体系。反应结束后,待溶液冷却至室温,用质量分数为5.6%的碳酸氢钠溶液调节pH值至5～6,中和过量硝酸。将反应液离心(4 000 r/min,5 min)并抽滤,收集滤液。将滤液转移至透析袋中,用纯净水透析72 h,定期更换透析液,直至取少量透析液加入抗坏血酸显色检测无红色出现。

将透析后的溶液通过旋转蒸发浓缩至20 mL,经冷冻干燥后得到Se-TAP。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测得Se-TAP中硒质量分数为533.44 μg/g。

1.3.4 Se-TAP的结构表征

1.3.4.1 总糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定总糖含量[14]。配制不同质量浓度的葡萄糖标准溶液和TAP、Se-TAP溶液1 mL,依次加入质量分数为5%的苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL,室温下静置25 min后在490 nm处测其吸光度。

1.3.4.2 分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱仪,色谱柱为UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm×2 μm)[15]。 将TAP和Se-TAP样品用超纯水溶解并稀释至5 mg/mL,经0.22 μm滤膜过滤后上样。流动相为0.1 mol/L的硝酸钠,用示差析光法检测;流速为0.5 mL/min,柱温为45 ℃。以不同分子质量(10～1 000 kDa)的葡聚糖标准品校准色谱柱,通过保留时间与分子质量的对应关系,计算TAP和Se-TAP的数均分子质量(Mn)、重均分子质量(Mw)及分散系数(PDI=Mw/Mn)。

1.3.4.3 单糖组成测定

称取5 mg TAP和Se-TAP,加入2 mol/L三氟乙酸溶液,在120 ℃条件下密封水解4 h。水解结束后,采用氮吹仪去除残留三氟乙酸。将水解后的样品用超纯水稀释至50 mg/L,经0.22 μm滤膜过滤后,采用Thermo DIONEX ICS-5000+SP-5型离子色谱仪进行检测[16],色谱柱为CarboPac PA20(3 mm×150 mm),柱温30 ℃。流动相A为纯净水,流动相B为1 mol/L醋酸钠,流动相D为250 mmol/L氢氧化钠,流速0.5 mL/min。记录各单糖组分的保留时间与峰面积,对照标准品,确定TAP和Se-TAP的单糖组成及各单糖的相对质量分数。

1.3.4.4 红外光谱检测

用红外光谱仪在波数为400～4 000 cm-1范围内进行扫描,分析多糖分子中的特征官能团。

1.3.4.5 紫外光谱检测

称取适量TAP和Se-TAP粉末,用超纯水溶解并稀释至质量浓度为1 mg/mL的多糖溶液。在室温条件下,取200 μL溶液加入96孔板中,采用酶标仪在紫外波长为200～400 nm范围内进行全波长扫描。

1.3.4.6 三螺旋结构检测

取2 mL质量浓度为1 mg/mL的TAP和Se-TAP溶液,与2 mL浓度为80 mmol/L的刚果红溶液充分混合。向混合液中逐滴加入1 mol/L NaOH溶液,使体系中NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,混匀后静置10 min。以不加多糖的刚果红溶液为空白对照,在紫外波长为400～600 nm处测定各体系的紫外吸收光谱[17],记录最大吸收波长(λmax)。以NaOH浓度(mol/L)为横坐标,λmax为纵坐标,分别绘制TAP和Se-TAP-刚果红体系及刚果红空白对照的曲线。若样品曲线在特定NaOH浓度范围内λmax显著高于空白对照,则表明多糖具有三螺旋结构。

1.3.5 金耳多糖的体外抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除实验

参照刘子骐等[18]的方法并稍加调整。将1 mL的 DPPH 溶液(0.1 mmol/L)与1 mL的TAP或Se-TAP溶液(质量浓度为 0.25～4.00 mg/mL)混合,在黑暗中静置30 min。以蒸馏水为空白对照,等体积无水乙醇为样品空白,Vc (与样品浓度相同)为阳性对照,在517 nm波长下测定各体系的吸光度。

1.3.5.2 ABTS+ 自由基清除实验

参照Li等[19]的方法并稍加调整。取9 mL的ABTS工作液,与1 mL的TAP或Se-TAP溶液(质量浓度0.25～4.00 mg/mL)混合,避光反应5 min。以蒸馏水为空白对照,Vc (与样品浓度相同)为阳性对照,在734 nm波长下测定吸光度。

1.3.5.3 羟自由基清除实验

参照Chen等[20]的方法并稍加调整。将1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液与1 mL浓度为9 mmol/L的FeSO4溶液完全混合,再与1 mL的TAP或Se-TAP溶液(质量浓度为10～100 μg/mL)混合。向混合液中加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,混匀后置于37 ℃水浴中反应60 min。以蒸馏水为空白对照,Vc(与样品浓度相同)为阳性对照,在510 nm波长下测定各体系吸光度。

1.3.5.4 总还原力的测定

取0.2 mL 0.2 mol/L PBS(pH=6.6)和0.5 mL质量分数为1%的K3 [Fe(CN) 6] 溶液,与1 mL的TAP或Se-TAP溶液(质量浓度为0.25～4.00 mg/mL)混合,混匀后在50 ℃恒温水浴中反应20 min。反应结束后将混合液冷却至室温,加入1 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液,离心(3 000 r/min,10 min)。取1.5 mL上清液,依次加入0.2 mL质量分数为1%的FeCl3 溶液和3 mL蒸馏水,混匀后放置5 min。以蒸馏水为空白对照,Vc (与样品浓度相同)为阳性对照,在700 nm波长下测定吸光度。

各自由基(DPPH、ABTS+、羟自由基)的清除率(E)统一按式(1)计算。

(1)

式(1)中:A0为空白组吸光度(蒸馏水+对应的反应液);A1为样品组吸光度(样品液+对应的反应液);A2为样品空白吸光度(样品液+对应溶剂)。

1.3.6 金耳多糖的体外抗肿瘤活性测定

1.3.6.1 细胞培养与处理

1)细胞复苏与培养。从液氮罐中取出人源肿瘤细胞系(胃癌细胞HGC-27、胆管癌细胞RBE、胰腺癌细胞PANC-1),快速解冻后将冻存液转移至含质量分数为10%的胎牛血清完全培养基中(HGC-27和PANC-1为DMEM培养基,RBE为RPMI-1640培养基)。将培养基置于37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中培养[21],待细胞贴壁生长至对数期后,进行传代培养。

2)药物处理。将对数期生长的细胞以1×104个/孔的密度接种至96孔板,培养12 h后,分别加入不同浓度(50、100、200、500、1 000 μg/mL)的TAP与Se-TAP样品液。设置阳性对照组(加入含50 μmol/L 5-Fu的培养基)与阴性对照组(加入等量完全培养基),每组设置3个平行孔。继续培养24 h后,弃去培养基,用PBS洗涤细胞1次。

1.3.6.2 细胞增殖抑制率的测定

向接种过细胞的96孔板每孔加入100 μL质量分数为10%的CCK-8溶液,置于培养箱中避光孵育1～4 h。使用多功能酶标仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度[22]。根据式(2)、式(3)分别计算细胞存活率与增殖抑制率。

细胞存活率= (OD实验组-OD空白组)/
(OD阴性对照组-OD空白组)×100%;

(2)

细胞增殖抑制率=1-细胞存活率 。

(3)

1.3.6.3 细胞活性观察

弃去96孔板中的培养基,用PBS洗涤细胞1次。充分吸净残留液体后,每孔加入100 μL Calcein/PI检测工作液,置于培养箱中避光孵育30 min。 使用多功能成像仪观察细胞染色情况:活细胞因酯酶活性高,被Calcein标记为绿色荧光[23]最佳激发波长(Ex)和最佳发射波长(Em),分别为494 nm和517 nm;死细胞因细胞膜完整性丧失,被PI标记为红色荧光[24](Ex=535/Em=617 nm),记录并分析细胞存活与死亡情况。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析,通过Two-Way ANOVA比较不同组别数据的平均值,数据均以平均值±标准差表示,P<0.05表示数据间具有显著差异。采用Graph Pad Prism8软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 多糖的结构表征结果

2.1.1 总糖含量分析

通过苯酚-硫酸法绘制的葡萄糖标准曲线,见图2。 由图2可知,单糖浓度与吸光度呈显著线性相关,回归方程为y=0.009 43x+0.145(r 2=0.985,P<0.001),表明该检测方法在实验浓度范围内具有良好的线性响应。基于此方法测定的TAP和Se-TAP总糖质量分数分别为97.32%、97.58%,说明经Sevage法脱蛋白和膜过滤纯化处理后,多糖中的蛋白质杂质已大部分去除,纯化效果良好。

2.1.2 多糖分子质量分析

多糖分子质量分析结果见图3和表1。由表1可知,TAP和Se-TAP的保留时间分别为12.883、12.917 min,Mn分别为2.1×106、1.9×106 Da,Mw分别为4.6×106、3.9×106 Da,PDI分别为 2.22、2.03。由于PDI值小于 5,表明两种多糖的分子质量分布相对均匀。分子质量的适度降低主要归因于硒化反应过程中的部分酸水解效应。在高温和酸性介质的协同作用下,多糖主链或长支链上的部分糖苷键可能发生断裂,导致大分子链解聚为较小的片段[25]。

同时,较高的Mw与已有研究中 “重均分子质量大的多糖更易表现出较强抗肿瘤活性[26]” 的结论一致,推测TAP与Se-TAP也具有较强的抗肿瘤活性。

2.1.3 单糖组成分析

TAP和Se-TAP的离子色谱分析结果如图4所示。TAP和Se-TAP由多种单糖组成,各单糖的相对质量分数见表2。由图4可知,TAP经硒化修饰后,其单糖组成成分保持稳定,未出现新的单糖峰或原有组分的完全消失。这证实了硒化反应主要发生在多糖分子的羟基位点,未导致核心糖链骨架的解聚。TAP与Se-TAP均以葡萄糖和甘露糖为主要构成单糖。

各单糖组分的相对质量分数在硒化前后呈现出规律性变化。Se-TAP中半乳糖和葡萄糖醛酸的相对含量分别从TAP的3.63%和4.41%下降至2.01%和2.81%。这种变化主要归因于硒化反应所处的硝酸-亚硒酸钠高温酸性体系:一方面,处于多糖侧链末端的残基对酸较为敏感,易发生部分酸水解而脱落;另一方面,糖醛酸基团在高温强酸条件下不稳定,易发生脱羧反应或降解[27]。由于TAP硒化过程中处于高温强酸环境,从而导致Se-TAP中的半乳糖和葡萄糖醛酸含量的下降。

2.1.4 多糖与官能团化学键分析

图5为TAP和Se-TAP的红外光谱图。由图5可知,TAP与Se-TAP的光谱在大部分区域表现出高度的一致性,显示出典型多糖的特征吸收峰。3 295 cm-1附近的宽强吸收峰归属于O—H键的伸缩振动,表明多糖分子间及分子内存在强氢键作用;2 923 cm-1处的弱吸收峰对应于C—H键的不对称伸缩振动;1 615 cm-1处的吸收带主要归因于结合水的弯曲振动或糖醛酸中羧基的特征吸收;1 000～1 200 cm-1的指纹区(特别是1 015 cm-1和1 148 cm-1)出现了C—O—H 和C—O—C糖苷键的强伸缩振动峰,证实了吡喃糖环骨架的存在及β-型糖苷键连接方式。

图5中,与TAP相比,Se-TAP的光谱在指纹区出现了两个新的特征吸收峰。850 cm-1处的吸收峰归属于SeO的不对称伸缩振动,而750 cm-1处的吸收峰则对应于C—O—Se的伸缩振动。这两个新生峰的存在提供了化学证据,表明亚硒酸根离子已成功与多糖链上的羟基发生酯化反应,形成了稳定的亚硒酸酯键(—O—SeO2H)[28],而非简单的物理吸附。同时,Se-TAP的O—H吸收峰略有移动和强度变化,也侧面印证了部分羟基参与了取代反应。红外光谱结果证实,Se-TAP成功保留了金耳多糖的主链结构,并有效引入了活性硒基团。这说明硒以亚硒酸酯的形式与金耳多糖上的羟基结合生成硒化金耳多糖,进一步证明了TAP硒化修饰成功。

2.1.5 紫外光谱分析

图6为TAP和Se-TAP在200～400 nm波长处的紫外扫描结果。图6显示,在260 nm和280 nm处均无特征吸收峰,进一步证实了样品的高纯度,可用于样品活性研究。

2.1.6 三螺旋结构分析

图7为样品的刚果红染色实验结果。图7显示,当NaOH浓度低于0.2 mol/L时,TAP、Se-TAP与刚果红形成的复合物最大吸收波长(λmax)显著高于仅有刚果红的空白对照组。图7结果表明,多糖分子中的三螺旋结构为刚果红提供了特异性结合的疏水性空腔,二者通过疏水作用与范德华力形成稳定复合物[29]。当NaOH浓度大于0.2 mol/L 时,λmax迅速下降至接近空白对照水平,说明高浓度的NaOH破坏了多糖的三螺旋结构,使其解离为无规卷曲结构,无法再与刚果红稳定结合[30]。该结果证实了TAP和Se-TAP具有典型的三螺旋结构,说明硒的加入没有破坏TAP的三螺旋结构。三螺旋结构被认为是真菌多糖维持生物活性(抗肿瘤、免疫调节)的重要空间构象基础。

2.2 金耳多糖的体外抗氧化活性分析

TAP和Se-TAP在体外抗氧化实验中表现出显著且具有剂量依赖性的自由基清除能力与还原潜力,其中硒化修饰显著增强了其抗氧化活性,如图8所示。

由图8(a) 可知,在TAP和Se-TAP的质量浓度为4.00 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率分别为72.88%±4.81%和83.11%±5.91%,后者已接近阳性对照Vc的活性水平。Zhu等[31]制备的蛹虫草硒多糖在质量浓度为5 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率约为65%,显然本研究中TAP尤其是Se-TAP对DPPH自由基的清除效果更好。这可能是因为,硒化修饰在多糖骨架上引入的亚硒酸酯基团不仅能提供电子,还能通过螯合金属离子阻断芬顿反应,从而从源头上抑制自由基的生成[32]。由图8(b) 可知,Se-TAP同样表现优异,在质量浓度为4.00 mg/mL时,ABTS+自由基清除率达到85.78%±4.52%,显著高于 TAP的74.85%±4.12%。由图8(c) 可知,Se-TAP在 100 μg/mL时羟自由基的清除率为78.24%±1.47%,明显优于TAP的71.63%+3.87%。图8(d)的结果进一步证实了Se-TAP的抗氧化优势,其在4.00 mg/mL时的吸光度为1.01±0.15,显著高于TAP的0.62±0.06,表明Se-TAP中丰富的含硒官能团能够更有效地提供电子,将 Fe3+还原为Fe2+,从而表现出更强的综合还原能力。本研究表明,硒化修饰显著提升了金耳多糖的体外抗氧化能力,这为其作为功能食品或抗氧化剂辅料的开发提供了实验依据。

2.3 金耳多糖的抗肿瘤活性分析

2.3.1 细胞增殖抑制率分析

采用CCK-8法测定了3种癌细胞系的增殖抑制率,实验结果如图9所示。由图9可知,TAP与Se-TAP对HGC-27、RBE、PANC-1 3种癌细胞系均表现出显著的增殖抑制作用,且抑制率随浓度升高而增加,并呈现剂量依赖性,其中Se-TAP的抑制活性普遍优于TAP,且对HGC-27胃癌细胞系的抑制效果最为显著。

通过Se-TAP对HGC-27细胞抑制率的结果进行特别是对胃癌HGC-27细胞。在低质量浓度(50～200 μg/mL)时,两者差异尚不明显;但随着多糖质量浓度提升至500 μg/mL 以上,Se-TAP组的癌细胞存活率急剧下降,与TAP组形成显著差异。值得注意的是,在1 000 μg/mL的高质量浓度下,Se-TAP对HGC-27细胞的抑制率达到58.60%[图9(c)],通过计算得到IC50值,为652.95 μg/mL。Se-TAP对HGC-27细胞的杀伤效果甚至优于阳性对照药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)。相比之下,Se-TAP对RBE和PANC-1细胞的抑制作用虽优于TAP,但整体效果弱于HGC-27细胞,表明Se-TAP可能对胃癌细胞具有一定的靶向特异性。

普通多糖主要通过免疫调节间接发挥抗肿瘤作用,而硒化多糖在此基础上,增加了硒元素的直接抗肿瘤途径(硒可以抑制血管内皮生长因子的表达与信号传导)[33]。结合荧光染色分析结果,Se-TAP对肿瘤细胞的杀伤机制可能涉及多靶点调控。Liu等[34]在研究硒多糖抗肿瘤活性时发现,硒基团的引入能促使多糖在线粒体膜上打孔,导致线粒体膜电位下降,进而激活内源性凋亡途径,切断肿瘤细胞的营养供应,同时诱导癌细胞凋亡,从而显著提升其抗肿瘤活性。

2.3.2 Calcein和PI双染色观察结果分析

HGC-27细胞的染色观察结果如图10所示。由图10可见,阴性对照组(仅含培养基)细胞呈现强烈的绿色荧光,细胞形态舒展、贴壁良好,仅见极少量红色荧光(死细胞),表明细胞活性正常;阳性对照组(5-Fu)细胞呈现大量红色荧光,绿色荧光几乎消失,表明癌细胞大量死亡;低质量浓度(50～200 μg/mL)TAP与Se-TAP处理组中,绿色荧光细胞数量减少,出现少量散在红色荧光,部分细胞呈现绿红叠加色,表明细胞开始出现损伤;高质量浓度(500～1 000 μg/mL)处理组中,绿色荧光基本消失,视野中布满密集红色荧光,细胞形态皱缩、圆浮(典型凋亡形态),表明发生大规模细胞死亡,且Se-TAP处理组的红色荧光强度高于同浓度的TAP组。该结果直观证实了TAP与Se-TAP对癌细胞的杀伤作用,且Se-TAP的杀伤效果更强,这与CCK-8法测定结果一致。

3 结 论

本研究证实,通过硝酸-亚硒酸钠体系的化学修饰,可有效将活性硒基团引入金耳多糖骨架,构建出具有稳定三螺旋结构的Se-TAP。光谱与色谱分析结果表明,这种硒化修饰不仅实现了亚硒酸酯键(SeO 与C—O—Se)的定点接枝,还通过适度的酸解效应重塑了多糖的理化性质,使其分子质量分布更趋均一。这些结构层面的优化对金耳多糖生物活性的提高发挥了较大的作用。

功能评价结果进一步显示,Se-TAP提高了天然多糖的活性,表现出良好的自由基清除能力及对肿瘤细胞的抑制作用。特别是Se-TAP对胃癌HGC-27细胞展现出较好的抑制效果(但本研究仅限于体外实验),证实了硒多糖在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有良好的表现。本研究表明,Se-TAP具备作为新型高效抗氧化剂及抗肿瘤辅助功能食品开发的潜质,本研究旨在为金耳资源的深层次开发和高值化利用提供理论参考。

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Preparation, Structural Characterization, and Biological Activities of Selenized Tremella aurantialba Polysaccharides

ZHU Peng, GU Qiuya, LÜ Beibei, YU Xiaobin*

(School of Biological Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214000, China)

Abstract： To investigate the structural characteristics and biological activity differences between Tremella aurantialba polysaccharides (TAP) and selenized Tremella aurantialba polysaccharides (Se-TAP), TAP was prepared using liquid fermentation technology and purified through ethanol precipitation, Sevage deproteinization, and membrane separation. Se-TAP was synthesized by reacting TAP with sodium selenite and nitric acid at 80 ℃ for 7 h. Structural characterization results indicated that both TAP and Se-TAP were primarily composed of glucose and mannose, featuring a β-type glycosidic linkage and a triple-helix structure. Characteristic absorption peaks for Se-TAP were observed in the infrared spectrum at 850 cm-1and 750 cm-1, confirming the successful introduction of selenite ester groups (SeO and C—O—Se), with a measured selenium content of 533.44 μg/g. Due to acid hydrolysis in the reaction system, Se-TAP underwent side-chain trimming, with the weight-average molecular weight decreasing from 4.62×106 Da (TAP) to 3.94×106 Da, and the PDI decreasing from 2.22 to 2.03, indicating a more uniform molecular weight distribution. In vitro bioactivity assays demonstrated that Se-TAP exhibited significantly enhanced antioxidant capacity compared to TAP, with improved scavenging rates against DPPH, ABTS+, and hydroxyl radicals, as well as increased total reducing power. In terms of antitumor activity, Se-TAP showed dose-dependent inhibitory effects on gastric cancer (HGC-27), cholangiocarcinoma (RBE), and pancreatic cancer (PANC-1) cells. Notably, against HGC-27 cells, Se-TAP achieved an IC50 value of 652.95 μg/mL and an inhibition rate of 58.60% at a concentration of 1 000 μg/mL, outperforming the positive control 5-fluorouracil. Fluorescence staining confirmed that its mechanism involved inducing cancer cell apoptosis. The findings indicated that selenization modification retained the backbone structure of TAP while significantly enhanced their antioxidant and antitumor activities through structural optimization. This study aimed to provide a theoretical reference for expanding the application of TAP and Se-TAP in the functional food sector.

Keywords： Tremella aurantialba polysaccharide; selenization modification; structural characterization; antioxidant activity; antitumor activity

doi：10.12301/spxb202600023

文章编号：2095-6002(2026)02-0135-11

引用格式：朱鹏, 顾秋亚, 吕蓓蓓, 等. 硒化金耳多糖的制备、结构表征及生物活性[J]. 食品科学技术学报,2026,44(2):135-145. ZHU Peng, GU Qiuya, LÜ Beibei, et al. Preparation, structural characterization, and biological activities of selenized Tremella aurantialba polysaccharides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(2):135-145.

中图分类号： TS201.4

文献标志码： A

收稿日期： 2026-01-11

基金项目： 轻工技术与工程国家一级学科项目(LITE2018-11)。

Foundation： National First-Class Discipline Project of Light Industry Technology and Engineering (LITE2018-11).

第一作者： 朱 鹏,男,硕士研究生,研究方向为食用菌发酵及多糖活性。

*通信作者： 余晓斌,男,教授,博士生导师,主要从事发酵食品,植物、中草药高值化转化等方面的研究。

(责任编辑：叶红波)