海洋源蛋白营养价值颇高,通过酶解工艺处理后得到的酶解液中,不仅含有丰富的生物活性肽,还蕴含多种风味物质。这些海洋源蛋白及其酶解产物,具备多重属性与作用,既能够作为功能性食品的重要组成成分,为食品赋予特定生理功能,也可充当营养保健成分,为人体补充所需营养、维护身体健康。海洋源蛋白及其酶解产物还拥有天然的抗氧化性能,以及防腐和抗菌功效,可在食品保鲜、品质维持等方面发挥积极作用[1]。Zhang等[2]的研究表明,大多数牡蛎富含必需氨基酸和omega-3长链多不饱和脂肪酸,其多糖具有抗癌、抗炎等多种生物活性。牡蛎作为海洋生物中极具代表性的一员,其蛋白含量丰富且营养结构优异,是海洋源蛋白的重要优质来源。基于牡蛎蛋白开发相关酶解产物,能充分发挥海洋源蛋白的多重优势。然而,当前牡蛎蛋白酶解加工中普遍存在水解不彻底、产物苦味重、功能活性未充分释放等问题,限制了其高值化利用[3]。因此,基于牡蛎蛋白开发高效酶解技术,既是响应海洋食品配料功能性开发的行业趋势,也能为高价值食品配料及营养保健产品研发提供重要理论支撑与实践参考。

蛋白酶解液制备,通常是使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等内切蛋白酶将大分子质量蛋白质水解为小分子多肽。但单一的内切蛋白酶水解效果不佳,故常结合外肽酶复配使用,如氨肽酶。氨肽酶可催化肽链N端疏水性氨基酸的水解,在提升酶解液水解度的同时,起到脱除苦味、改善风味的作用[3]。由氨肽酶和内切蛋白酶复配而成的风味酶制剂,已在蛋白酶解液制备中广泛应用。Zhang等[4]以巨牡蛎蛋白为模型,开发了一种基于计算机模拟酶解的氨肽酶挖掘方法,发现氨肽酶可降解巨牡蛎水解产物中的苦味肽。Shen等[5]将其自主筛选的氨肽酶bvLAP和商用氨肽酶进行复配使用,发现双酶消化产物抗氧化活性增强,苦味强度从9.65降低到6.93。

由于不同食物蛋白的氨基酸组成存在差异,经内切蛋白酶水解后暴露的疏水性氨基酸种类和数量各不相同,因此,开发具有广泛底物谱的氨肽酶具有重要的应用价值。不同底物谱的氨肽酶与内切蛋白酶组合,可适用于不同蛋白资源的深加工。然而,目前报道的氨肽酶仅针对部分氨基酸表现出较高的催化活性,限制了其在不同蛋白酶解液水解和风味提升中的应用。林颖等[6]以9种不同的氨基酸-对硝基苯胺为底物,发现重组枯草芽孢杆菌氨肽酶对Leu-pNA水解活力最强,对Arg-pNA、Lys-pNA也有较高水解活性,对酸性氨基酸组成的Glu-pNA无水解活力。刘冰心[7]以3种淡水鱼为原料,对其肌肉亮氨酸氨肽酶进行分离纯化,发现其为单体结构,对亮氨酸-MCA有较高切割效率,对其他氨基酸残基也有一定分解作用,而对内肽酶底物和大分子蛋白无分解作用。目前鉴定的氨肽酶活性主要对亮氨酸、丙氨酸等非极性氨基酸和酸性的精氨酸、赖氨酸具有水解作用。这些氨肽酶虽有助于提高氨基酸的水解度和脱除苦味,但其底物特异性仍限制了其在多样化蛋白资源深加工中的应用。

为解决氨肽酶底物谱狭窄的技术问题,本研究拟通过基因工程方法挖掘具有广泛底物谱的氨肽酶,并以牡蛎蛋白酶解体系为研究对象进行功能验证,希望为相关蛋白酶解液的工业化生产提供必要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用氨肽酶基因来源于本实验室保藏的抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens a2)。基因克隆宿主大肠杆菌DH5α、基因表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)均为实验室保藏。

LB培养基含10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L NaCl,固体培养基另加2.0 g/L琼脂粉,定容后灭菌备用。洗脱缓冲液由8.8 g/L NaCl、6.0 g/L Tris组成,用4 mol/L HCl调节pH值至8.0,定容至1 L。咪唑缓冲液母液(500 mmol/L)为34.0 g/L咪唑溶于洗脱缓冲液,使用前预冷。将咪唑缓冲液母液用洗脱缓冲液稀释以得到所需浓度的咪唑缓冲液。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)质量浓度为20 mg/mL,溶于无菌水后于-20 ℃保存。氨基酸对硝基苯胺底物溶液以二甲基亚砜为溶剂配制,终浓度50 mmol/L,避光保存。

显色底物氨基酸对硝基苯胺共9种。Leu-pNA、Glu-pNA,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Arg-pNA、Ala-pNA,南京莱昂生物科技有限公司;Met-pNA、Ile-pNA、Phe-pNA,上海麦克林生化科技股份有限公司;Val-pNA、Pro-pNA,上海源叶生物科技有限公司。硫酸卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、邻苯二甲醛,北京索莱宝科技有限公司。KOD FX高保真酶,TOYOBO公司;FastPure细菌DNA提取试剂盒、ClonExpress重组克隆试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;凝胶回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒,北京天根生化科技有限公司。木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶(20万U/g)及氨肽酶(2万U/g),南宁庞博生物工程有限公司。新鲜太平洋牡蛎肉,青岛市黄岛海鲜农贸市场;ACE2抑制剂筛选试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JY98-ⅢDN型超声波细胞破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C型pH计,上海精密科学仪器有限公司;FC酶标仪,赛默飞世尔科技有限公司;DYY-6C型电泳仪,北京六一生物科技有限公司;SpectraMax i3x型多功能酶标仪,美谷分子仪器有限公司;SA402B Plus-EX型电子舌,日本英特生有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 氨肽酶表达菌株的构建

取实验室冷冻保藏的A. radioresistens a2菌株划线于LB固体平板,37 ℃恒温培养过夜。挑取单菌落接种于50 mL液体LB培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养8 h。取1～5 mL菌液10 000 r/min离心1 min收集菌体,按照细菌DNA提取试剂盒说明书提取全基因组DNA。

以提取的基因组DNA为模板扩增氨肽酶基因APs(Ar)-3,并连接到pET-28a(+)载体上。目的片段扩增使用的引物为:APs(Ar)-3-F(5′-ACACATGCCTCAGCTGCAATGAATATTGCAGCACAACCTCC-3′)、APs(Ar)-3-R(5′-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATATTAAGCATGCTGCTTAAAGTTTCAGAT-3′)。根据扩增及纯化后的线性化载体和目的片段浓度,按载体与插入片段物质的量比1∶2(总体积5 μL)配制连接体系,于50 ℃孵育15～30 min,进行连接,并置于冰浴中5 min,冷却备用。

将E. coli DH5α感受态细胞于冰上解冻,加入10 μL目的基因扩增连接体系,通过热激转化法进行转化,并涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基,于37 ℃培养箱过夜培养(≤12 h),至单菌落长出。挑取单菌落进行PCR验证,并将条带位置正确的阳性克隆菌液送至生工生物公司测序,测序结果经SnapGene软件比对,确认序列正确连接后提取重组质粒,并最终将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中。

1.3.2 重组菌株的诱导表达与纯化

挑取平板上的阳性克隆子,接种至含50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB液体培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜。按质量分数为1%的接种量转接至新鲜的含相同浓度抗生素的LB培养基,37 ℃、200 r/min继续培养至菌体OD600值达0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L,于16 ℃条件下诱导培养16 h。

诱导培养结束后,11 000 r/min离心2 min收集菌体,弃上清液后加入适量缓冲液重悬,11 000 r/min离心2 min,彻底弃上清液。按1 g菌体加20 mL缓冲液的比例重悬菌体,4 ℃预冷后于冰上超声破碎10 min。破碎液经11 000 r/min、4 ℃离心20 min,分离上清液与细胞碎片,分别收集并4 ℃保存备用。

采用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体破碎液上清液中纯化APs(Ar)-3。用20 mmol/L咪唑缓冲液洗涤杂蛋白;用80 mmol/L咪唑缓冲液洗脱带组氨酸标签的重组氨肽酶,收集洗脱液,经30 kDa超滤管浓缩脱盐得纯酶液,通过SDS-PAGE验证纯化效果。以牛血清蛋白作为标准品,采用Bradford法[8]检测酶液中的蛋白质含量。

1.3.3 氨肽酶活性测定

氨肽酶可以催化氨基酸对硝基苯胺底物中酰胺键的断裂,生成游离呈黄色的对硝基苯胺(p-nitroaniline,pNA),引起405 nm处吸光度的增加。在特定条件下,每分钟催化底物形成1 μmol对硝基苯胺所需的酶量即为一个酶活单位。

测定方法:将20 μL酶液与460 μL Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH值为8.0)充分混匀,在设定温度下孵育5 min;加入20 μL 50 mmol/L的Ala-pNA底物溶液,混匀后反应5 min,立即加入500 μL冰醋酸终止反应。使用分光光度计在405 nm波长下测定反应液的吸光度,根据pNA标准曲线确定反应体系中pNA的浓度,酶活计算方法见式(1)。

氨肽酶酶活

(1)

式(1)中,氨肽酶酶活,U/mL;ΔOD405为扣除对照后的吸光值;V0为反应体系总体积,mL;k为标准曲线斜率;t为反应时间,min;V为酶体积,mL;138.12为对硝基苯胺相对分子质量。

1.3.4 氨肽酶底物特异性分析

以9种氨基酸对硝基苯胺(Leu-pNA、Arg-pNA、Met-pNA、Ala-pNA、Ile-pNA、Val-pNA、Pro-pNA、Phe-pNA和Glu-pNA)作为底物,按氨肽酶活性测定方法测定酶活,每组实验重复3次,将酶活最高组的活性定义为100%,计算其他组的相对酶活。

1.3.5 酶蛋白结构建模和分子对接模拟

将APs(Ar)-3的基因序列上传至AlphaFold服务器(https:∥alphafold.ebi.ac.uk),并选择同源性最高的不动杆菌属(Acinetobacter sp.)263903-1来源的氨肽酶N晶体结构作为模板(Gscore:90.97;plDDT:96.94)。将模板晶体结构对应的氨基酸序列提交至NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),通过与文献报道的氨肽酶活性中心序列进行比对分析,以明确结构域及活性位点。9种氨基酸对硝基苯胺底物的3D结构通过PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)网站获得:Ala-pNA(CID:150936)、Arg-pNA(CID:195970)、Phe-pNA(CID:7408126)、Leu-pNA(CID:2733285)、Pro-pNA(CID:7408106)、Glu-pNA(CID:90348)、Val-pNA(CID:7408190)、Ile-pNA(CID:57369829)和Met-pNA(CID:151396)。运用AutoDock软件(http:∥autodock.scripps.edu)将APs(Ar)-3三维结构与9种底物小分子进行分子对接模拟,以确定最合适的结合位置和方向。运用Pymol(http:∥pymol.org)和LigPlot软件(https:∥www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/)中受体配体相互作用工具进行分析并可视化对接结果。

1.3.6 氨肽酶APs(Ar)-3酶学性质测定

通过测量APs(Ar)-3在不同温度(25～60 ℃)条件下的活性,确定其最适反应温度。通过检测APs(Ar)-3在pH值为4.0～10.0(50 mmol/L pH值为4.0～6.0的柠檬酸盐缓冲液,50 mmol/L pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液,50 mmol/L pH值为8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液,50 mmol/L pH值为9.0～10.0的Gly-NaOH缓冲液)缓冲液中的活性,确定其最适反应pH值。每组实验重复3次,结果以最高酶活力为100%,计算并表示为相对酶活。

通过将APs(Ar)-3在不同温度(35、40、45、50 ℃)条件下孵育,评估氨肽酶的温度稳定性。在37 ℃条件下,通过将APs(Ar)-3在不同pH值的缓冲液中孵育,评估氨肽酶的酸碱稳定性。每组实验重复3次,结果以初始酶活为100%计算并表示为剩余酶活。

向反应体系中分别加入0.1 mmol/L和1.0 mmol/L的金属离子或螯合剂(Na2-EDTA、NaCl、KCl、CuCl2、CaCl2、CoCl2、BaCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2和NiCl2),温育1 h后测定残余的酶活性,评估金属离子对氨肽酶活性的影响。每组实验重复3次,结果以原始酶活力为100%,计算并表示为相对酶活。

1.3.7 氨肽酶在牡蛎蛋白中的酶解特性测定

对APs(Ar)-3重组氨肽酶进行大量诱导表达及纯化,纯酶液冻干后制成酶粉,于干燥器中保存。

新鲜牡蛎去除外壳后洗净,采用反复浸泡法进行脱盐处理降低其咸腥味:将牡蛎置于4 ℃的冰水混合物中浸泡30 min,连续重复此过程3次后用蒸馏水洗净、沥干,于破碎机中制成牡蛎肉匀浆,置于-20 ℃储存备用。称取牡蛎肉匀浆液5.00 g,按牡蛎肉匀浆液与蒸馏水质量比为1∶3,添加15 mL水制备底物液。按质量分数为1%添加量分别向底物液中加入木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶,保持牡蛎匀浆液自然pH值(6.5～7.0),40 ℃条件下酶解8 h。外加氨肽酶的实验组,在各蛋白酶单独酶解4 h后,按比例再加入0.05 g氨肽酶,保持反应条件不变,继续酶解4 h。反应结束后,于100 ℃处理10 min终止酶反应,随后冷却至室温,8 000 r/min离心10 min,收集上清液。以不添加任何外源酶的处理组作为对照,命名为水煮液组,每组实验设置3个平行。

采用邻苯二甲醛法(OPA)测定水解度[9]。将5 g牡蛎肉匀浆液与15 mL 6 mol/L HCl混合,在120 ℃条件下反应24～36 h,制成牡蛎肉匀浆处理液,使用时根据样品浓度进行适当稀释,设置3个平行样本。在96微孔板中,加入20 μL待测样品和150 μL OPA试剂,混合均匀后,在25 ℃条件下精确反应2 min,随后测定340 nm波长下的吸光值。按式(2)计算水解度。

水解度

(2)

式(2)中,ρ1为牡蛎酶解液中游离氨基的质量浓度,mg/mL;ρ0为空白(水);ρ2为牡蛎肉匀浆处理液(完全酸水解液)中游离氨基的质量浓度,mg/mL。

使用SA402B电子舌的AAE(鲜味)、C00(苦味)和AE1(涩味)3个传感器对各组酶解液样品进行测试,基准液为0.3 mmol/L酒石酸和30 mmol/L KCl的混合溶液。将200 μL内部液加入测试传感器内部后,置于参比溶液中进行活化;参比电极在加入内部液之后,需置于3.33 mol/L KCl溶液中完成活化。对于每个样品,需进行4次测定,选取后3次稳定的电子舌响应值,取其平均值以进行分析。

1.4 数据处理

所得数据使用GraphPad Prism 10.1.2及OriginLab Origin 2024软件进行绘图和统计分析。所有实验均重复3次,图表数据以平均数±标准差表示,P<0.05表示有显著差异。

2 结果与分析

2.1 重组氨肽酶的表达及底物特异性分析

本实验室保藏的抗辐射不动杆菌是一种从肉类加工厂土壤中筛选出的革兰氏阴性球杆菌,其生存环境中富含蛋白、脂质等物质,这使得该菌株极有可能含有高活性且具有广泛底物谱的氨肽酶。本研究从该菌株基因组中克隆表达得到了一种新型氨肽酶APs(Ar)-3,编码该氨肽酶的目的基因共2 604个碱基,理论分子质量为95 kDa。利用IPTG诱导表达培养后,采用SDS-PAGE分析验证,验证结果见图1。由图1可知,氨肽酶条带位置对应的相对分子质量与基于碱基数初步计算的分子质量相符,表明APs(Ar)-3的纯化效果良好,并将其用于后续研究。

M-蛋白分子质量标准(Marker);1-菌体破碎上清液;2-菌体破碎沉淀物;3-纯化后的重组氨肽酶。

图1 APs(Ar)-3纯化结果的SDS-PAGE分析
Fig.1 Analysis of SDS-PAGE of purification results of APs(Ar)-3

对APs(Ar)-3进行同源建模及活性位点预测,通过与NCBI数据库内的氨肽酶活性中心序列进行比对分析,发现氨肽酶APs(Ar)-3属于金属氨肽酶M1家族。图2为APs(Ar)-3的预测结构[10],明确了APs(Ar)-3的结构域分布及关键活性位点。由图2可知,该结构呈现典型的复杂三维折叠模式,由多个α-螺旋、β-折叠等二级结构组成具有特定功能域的空间构象;在APs(Ar)-3催化区域,H303、H307和E326氨基酸残基参与了活性中心Zn2+的结合;此外,E270、A268和E304氨基酸残基在底物的识别和定位中起关键作用。

粉色部分代表结构域,黄色部分代表酶活性位点,绿色部分代表Zn2+结合位点。

图2 APs(Ar)-3蛋白质结构预测及活性位点的局部结构
Fig.2 Protein structure prediction and local structure of active sites of APs(Ar)-3

结合分子对接结果对APs(Ar)-3进行底物特异性分析。APs(Ar)-3的底物特异性结果见图3。由图3可知,APs(Ar)-3对Ala-pNA(相对酶活100%)和Arg-pNA(相对酶活76.76%)展现出较高的催化活性,这一偏好与多数广谱型金属氨肽酶[11-12]的底物优先性趋势一致,此类酶通常对丙氨酸、精氨酸类底物表现出更强的识别能力,推测与这类底物侧链体积适中、易与活性中心形成稳定相互作用相关。APs(Ar)-3与9种对硝基苯胺底物之间的分子对接结果见图4。由图4(a)和(b)可知,Ala-pNA和Arg-pNA均能与氨肽酶活性中心的E270、A268以及E304氨基酸残基形成氢键,且小分子底物会被包裹在由H307、K325、H303、E326、Y387等氨基酸残基构成的疏水口袋当中,推测二者酶活的差异可能是氢键数量不同导致的。Simpson等[12]在金属氨肽酶催化机制的研究中也提出氢键数量与结合稳定性呈现正相关。与专一性氨肽酶(如仅识别脯氨酸的亚氨肽酶[13-14]、仅识别酸性氨基酸的天冬氨酰氨肽酶[15])仅识别单一类型氨基酸不同,APs(Ar)-3还具备对Met-pNA(相对酶活53.98%)、Leu-pNA(相对酶活52.75%)和Phe-pNA(相对酶活22.74%)等疏水性氨基酸的水解能力,体现出典型的广谱底物识别特征。这一特性与黑曲霉来源的An-APa氨肽酶[16]、嗜盐古菌来源的APhap氨肽酶[17]等已报道的广谱氨肽酶高度相似。这类酶均能同时识别多种疏水性氨基酸底物,为其在蛋白质水解等工业应用中提供了优势。其中,APs(Ar)-3对Met-pNA与Leu-pNA的水解活性差异极小,这一现象在已报道的广谱氨肽酶[16-17]中同样存在,与其疏水口袋对中等体积侧链的高包容性直接相关。结合图4(c)、图4(d)可知,Met-pNA和Leu-pNA与APs(Ar)-3活性中心的结合位点呈现出高度相似性,在氢键作用方面,二者与活性中心的Glu270、Glu304、Ala268等关键氨基酸残基形成了较为稳定且数量适宜的氢键,这些氢键为底物结合提供了较强的极性相互作用支撑,Colombo等[18]也提出金属氨肽酶活性中心的Glu、Ala残基是氢键结合的关键位点。由图4(f)可知,Phe-pNA与APs(Ar)-3活性中心形成的氢键,在数量和键长上(如部分氢键距离相对更远)都显示出与Met-pNA、Leu-pNA的不同,氢键作用的减弱会降低底物与酶结合的稳定性。在疏水相互作用上,Met-pNA和Leu-pNA的侧链结构与由H307、K325、Tyr387等氨基酸残基构成的疏水口袋契合度较高,能充分利用疏水作用稳定结合。但Phe-pNA由于自身苯环侧链的空间结构特点,在疏水口袋中的适配性稍差,疏水相互作用的强度和范围可能不及前两者,这与猪脾脏组织氨基肽酶仅能高效水解苯丙氨酸等大侧链疏水性氨基酸的特性形成对比[19],也进一步说明APs(Ar)-3的疏水口袋对不同体积疏水性侧链的包容性更强,体现其底物谱的广泛性。由图4(h)可知,对Ile-pNA(相对酶活4.88%)与Leu-pNA催化活性的差距说明氨基酸β-碳原子上的分支(D333、H303等)会显著影响酶的催化功能,这与苏云金芽孢杆菌IDO在催化L-Ile和L-Leu时表现出不同活性的情况类似[20]。此外,该酶对具有较大苯环结构的Pro-pNA(相对酶活24.41%)展现一定催化能力。由图4(e)可知,相较于其他小分子底物,Pro-pNA除了与氨肽酶活性中心的Glu304、Arg296等氨基酸残基形成常规氢键外,还与活性中心内Zn2+结合位点E326形成了氢键。这种与Zn2+结合位点氨基酸残基形成的额外氢键作用,可能在一定程度上增强了Pro-pNA与酶活性中心结合的特异性与稳定性,使得APs(Ar)-3对其具备了相应的催化能力,这与DNPEP氨肽酶中金属结合位点参与底物特异性调控的机制相似[15];但由于Pro-pNA自身较大的苯环结构,可能在疏水口袋中的空间适配性仍存在不足,所以整体相对酶活仍处于较低水平。由图4(g)可知,在氨肽酶APs(Ar)-3与Val-pNA(相对酶活6.75%)的结合中,R296与Val-pNA形成了两个氢键,这类氢键作用可能会对底物与酶活性中心的灵活结合产生限制,进而影响催化反应的高效进行,Basbous等[21]在嗜热球菌甘氨酰特异性氨肽酶研究中也认为过量氢键会限制底物构象灵活性,降低催化活性。APs(Ar)-3对Glu-pNA(相对酶活1.00%)表现出极低的活性,这与分子对接结果高度适配。由图4(i)可知,与Glu-pNA连接的氨基酸残基均不在蛋白质的活性中心区域,导致底物难以在活性中心实现有效结合与催化,这与多数广谱氨肽酶对强酸性氨基酸底物催化活性极低的共性特征一致[11,17],而专一性天冬氨酰氨肽酶则能高效催化酸性氨基酸底物[15],二者形成鲜明对比,进一步印证APs(Ar)-3的广谱底物特性。

图3 APs(Ar)-3的底物特异性
Fig.3 Substrate specificity of APs(Ar)-3

(a)至(i)图中的上图为3D结构,下图为2D结构。3D图上方数据为对接结合能,该值反映配体与蛋白的结合强度,结合能越低通常代表结合越稳定;2D图中,疏水相互作用由红色幅条弧线表示,氢键由绿色虚线表示。

图4 APs(Ar)-3与9种对硝基苯胺底物之间分子对接相互作用结果
Fig.4 Results of molecular docking interactions between APs(Ar)-3 and nine p-nitroaniline substrates

氨肽酶APs(Ar)-3具备广泛的底物谱,对不同底物的催化活性差异主要源于底物与酶活性中心氢键作用的数量和稳定性、疏水口袋的空间适配性以及与Zn2+结合位点的相互作用等因素的综合影响。该酶对Ala-pNA和Arg-pNA相对酶活较高,而含较大侧链或特殊空间结构的底物(Phe-pNA、Pro-pNA等)及带电荷氨基酸底物(Glu-pNA等)的催化活性则受到明显限制。

2.2 APs(Ar)-3酶学性质分析

APs(Ar)-3酶学性质分析的实验结果见图5。

图5 APs(Ar)-3的酶学性质
Fig.5 Enzymatic properties of APs(Ar)-3

2.2.1 最适温度及温度稳定性

由图5(a)可知,当反应温度为45 ℃时,催化酶活性最高,所以APs(Ar)-3最适反应温度为45 ℃。当反应温度在40～45 ℃时可保持最高酶活的90%以上。这一温度特征与多数细菌来源的氨肽酶相符,例如从地衣芽孢杆菌中分离的氨肽酶最适温度为40～50 ℃[22];与嗜热菌来源的氨肽酶(水生嗜热菌氨肽酶最适温度65 ℃[23])相比,APs(Ar)-3更适应中温环境。氨肽酶APs(Ar)-3的温度稳定性结果见图5(c)。由图5(c)可知,在温度稳定性方面,该酶在45 ℃以下保温8 h仍能保留50%以上活性,说明APs(Ar)-3具有较好的温度稳定性。

2.2.2 最适pH值及酸碱稳定性

酶的催化反应效率不仅受温度影响,还与环境酸碱度密切相关。由图5(b)可知,APs(Ar)-3的最适反应pH值为7.0;同时,该酶在pH值为6.0～9.0时均保持较高催化活性,而在pH<6.0(柠檬酸盐缓冲液)或pH>9.0(Gly-NaOH缓冲液)时活性显著下降。氨肽酶APs(Ar)-3酸碱稳定性实验结果见图5(d)。由图5(d)可知,APs(Ar)-3在pH值为6.0～8.0时保温8 h活性可保持60%以上,这可能与氨肽酶活性中心关键氨基酸(丝氨酸、组氨酸等)在中性至弱碱性环境中维持质子化平衡有关[24]。当pH值偏离此范围时,酶活显著下降,推测是极端酸度破坏了酶的活性中心构象:酸性条件可能阻碍催化位点组氨酸的质子化,碱性条件则可能影响金属离子结合位点的稳定性[25],这一现象与Aeromonas caviae氨肽酶的酸碱稳定性特征相似[26]。

2.2.3 金属离子特异性

金属离子对APs(Ar)-3活性的影响,实验结果见图6。由图6可知,金属离子对氨肽酶APs(Ar)-3的活性调控呈现出显著的特异性。结果表明,低浓度(0.1 mmol/L)的Co2+能够显著激活该酶活性,使其相对酶活由100%提升到281.95%,提升了约1.82倍;然而当Co2+浓度升高至1.0 mmol/L时,金属离子对酶活性却表现出明显的抑制效应。这种浓度依赖性的双相调节特征,与金属辅助因子在低浓度时参与催化中心构建,而高浓度时可能引起酶蛋白构象变化的典型机制相符[27]。在测试的其他金属离子中,Na+、K+、Ba2+、Ca2+和Mg2+对APs(Ar)-3活性均无明显影响,表明该酶对这些常见金属离子具有良好的耐受性[28]。而Zn2+和Cu2+在低浓度条件下(0.1 mmol/L)对酶活性有强烈抑制效应。其中,Zn2+可能通过高亲和力竞争性结合活性中心的保守锌结合位点(H303、H307、E326),从而破坏酶的正常催化功能[27,29]。在实际应用过程中,需要精确控制Co2+的添加浓度以发挥其最佳催化效果,同时必须避免Zn2+、Cu2+等抑制性金属离子的污染。

图6 金属离子对APs(Ar)-3活性的影响
Fig.6 Effects of metal ions on APs(Ar)-3 activity

新型氨肽酶APs(Ar)-3在酶学性质上与来源于Agarivorans gilvus WH0801并且同属于金属氨肽酶M1家族的APs(Ag)-1-ZMY(APs1)[30]呈现高度相似性。两种氨肽酶均在近中性pH值条件下表现出最高活性,并且有较为相似的最适温度。在金属离子特异性方面,APs(Ar)-3与APS1均对Co2+呈现浓度依赖性的双相调节效应,低浓度Co2+可显著提升酶活力;2种酶活性都受Zn2+和Cu2+的显著抑制。在结构方面,APs(Ar)-3与APs1活性中心参与Zn2+结合的氨基酸残基都为组氨酸和谷氨酸,二者在底物的识别和定位中起关键作用的氨基酸残基都包括谷氨酸,且关键基团数量较为接近。来源于地衣芽孢杆菌SQ1并在枯草芽孢杆菌WB600中表达的氨肽酶YwaD[31]也呈现类似的金属离子特异性,但在底物特异性方面,YwaD仅对Leu-pNA展现出较高催化活性,新型氨肽酶APs(Ar)-3则展现出更优异的广谱性质。综合来看,新型氨肽酶APs(Ar)-3不仅在核心酶学性质、金属离子响应及关键结构位点上延续了同家族酶的稳定特性,更凭借优于其余氨肽酶的广谱底物特异性,进一步凸显出其在相关应用场景中具备良好的适用性与潜力。

2.3 APs(Ar)-3在牡蛎蛋白酶解中的特性分析

2.3.1 不同酶解物的蛋白质水解度分析

不同蛋白酶对牡蛎蛋白的酶解实验结果见图7。由图7可知,随着木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的添加,牡蛎蛋白的水解度普遍高于不添加任何外源酶的水煮液组,显示出外源酶在优化牡蛎蛋白水解方面的有效性。添加氨肽酶的实验组水解度结果显示,APs(Ar)-3的添加可显著提高菠萝蛋白酶、胰蛋白酶组的水解度,分别达到57.86%和57.61%,是商品氨肽酶组(40.66%、46.92%)的1.42倍和1.23倍,而在木瓜蛋白酶组中促进作用不明显。表明APs(Ar)-3在内切蛋白酶将大分子蛋白降解为多肽后,能够有效发挥作用以提高牡蛎蛋白的水解程度,这是因为复合酶系协同作用可突破单一酶底物限制,提升水解效率[32];同时,不同酶组合中水解度的差异,也说明需适当选择和组合内/外切蛋白酶以满足对水解度的实际需求,从而有效提升牡蛎酶解液的品质。值得注意的是,商品化氨肽酶在提升牡蛎蛋白水解度时与空白对照组无明显差异,这与APs(Ar)-3的显著增效形成鲜明对比,核心原因在于商品化氨肽酶的底物特异性较窄,无法高效识别并降解木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶作用于牡蛎蛋白后产生的特异性多肽产物,难以与内切蛋白酶形成有效的协同水解效应。本研究表明,相较于商品化氨肽酶,新型氨肽酶APs(Ar)-3展现出更为卓越的牡蛎蛋白水解增效能力,尤其在与菠萝蛋白酶、胰蛋白酶复配时,能通过高效的酶系协同作用显著突破底物降解限制,大幅提升水解度;而商品氨肽酶因底物特异性的固有局限,难以发挥水解促进作用。这一结果充分证明APs(Ar)-3在牡蛎蛋白高效酶解工艺中具有显著的应用潜力,也可为海洋蛋白深加工领域的酶制剂选型与复合酶系构建提供实验依据。

图7 复合酶对牡蛎蛋白水解度的影响
Fig.7 Effect of composite enzymes on degree of hydrolysis of oyster protein

2.3.2 不同酶解物的电子舌测定结果分析

电子舌测定结果见图8。由图8可知,各组酶解液在苦味、涩味和鲜味值方面的整体差异相对较小,这可能与牡蛎蛋白酶解体系的复杂性有关。牡蛎蛋白本身含有多种呈味氨基酸、肽段及其他风味前体物质,酶解过程中不仅会产生鲜味相关的小分子肽和氨基酸,还可能释放出苦味肽或其他风味物质,多种成分的综合作用使得风味指标的差异被弱化[33]。在实际应用中,多个因素如酶的种类、底物特性和反应条件等也都会共同影响风味的形成,从而导致各组之间的风味差异有限。在木瓜蛋白酶组中,苦味值从水煮液的8.00降至7.56,且涩味值保持在7.73～8.04。与外加商品氨肽酶组相比,APs(Ar)-3处理组的苦味值为7.59,略高于商业氨肽酶组的7.66,差异不显著;而鲜味值提升更为明显,木瓜蛋白酶与APs(Ar)-3组合组的鲜味值为10.44,高于商品氨肽酶组合组的10.31,提升幅度约为1.26%,表明APs(Ar)-3在提升鲜味方面表现更优。鲜味值在菠萝蛋白酶和APs(Ar)-3的组合组中从水煮液的10.17提高至11.26,显著高于菠萝蛋白酶与商品氨肽酶组合组(10.47),前者较后者提升了约7.55%。菠萝蛋白酶具有较好的蛋白水解活性,能够释放出一定量的鲜味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等,而APs(Ar)-3作为一种外切型蛋白酶,通过进一步酶解菠萝蛋白酶组的水解物,生成了更多的鲜味物质,且其对涩味的改善能力优于商品氨肽酶[菠萝蛋白酶与APs(Ar)-3组合组涩味值为7.61,显著低于商品氨肽酶组合组的8.32],使得整体风味更协调。胰蛋白酶作为一种特异性较强的蛋白酶,主要水解精氨酸和赖氨酸羧基端的肽键,其水解产物中含有较多的鲜味氨基酸和鲜味肽。胰蛋白酶组的苦味和涩味值都变化不大,而鲜味值显著升至10.97;在与APs(Ar)-3复配后,苦味值从8.00降至7.04,显著低于商业氨肽酶复配组的7.23,脱苦效果提升约2.63%;同时涩味值控制在7.89,略优于商品氨肽酶组的7.91,进一步验证了APs(Ar)-3在风味改善方面的优势。本研究表明,尽管不同酶解组之间的苦味、涩味和鲜味值变化较小,但 APs(Ar)-3在提升鲜味、控制涩味及脱苦方面均优于商品氨肽酶,显示出更突出的改善酶解液风味的潜力,提示在未来的研究中需优化酶的选择与组合,以促进牡蛎蛋白的风味改善。在风味改善效果上,本研究制备的APs(Ar)-3酶在增鲜、控涩和脱苦方面均优于商品氨肽酶,具有更广阔的应用前景。

图8 电子舌风味雷达图
Fig.8 Electronic tongue flavor radar diagram

3 结 论

本研究从抗辐射不动杆菌A. radioresistens a2的基因组中克隆得到了一种新型氨肽酶APs(Ar)-3。重组APs(Ar)-3具有广泛的底物谱,其中对Ala-pNA和Arg-pNA的催化能力最强。APs(Ar)-3最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.0,0.1 mmol/L的Co2+可显著提高APs(Ar)-3的催化活性,而Zn2+和Cu2+则对APs(Ar)-3活性具有较高的抑制效果。通过对比APs(Ar)-3与商品氨肽酶在牡蛎蛋白酶解中的效果,系统评价了其在水解度及风味调控中的能力。结果表明,APs(Ar)-3的添加显著提高了菠萝蛋白酶、胰蛋白酶组的水解度,达到57.86%和57.61%,较之未添加氨肽酶组分别提升1.42和1.23倍;同时,APs(Ar)-3与菠萝蛋白酶的组合,也使酶解液的鲜味值提升至11.26,体现了APs(Ar)-3在提升蛋白水解度和改善酶解液风味中的潜力。本研究旨在为蛋白酶解液的制备提供一种具有广泛底物谱的新型氨肽酶,通过APs(Ar)-3与内切蛋白酶组合,期望实现蛋白资源的高值化利用。

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Identification of A Broad-Spectrum Aminopeptidase and Its Application in Efficient Hydrolysis of Oyster Proteins

PU Jiani1, CUI Yushan1, ZHANG Mingyue1, LI Ying1, SUN Jian’an1,2,3,4, MAO Xiangzhao1,2,3,4,5, DONG Hao1,2,3,4,*

(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China/State Key Laboratory of Marine Food Processing and Safety Control, Qingdao 266404, China; 2. Sanya Institute of Oceanography, Ocean University of China, Sanya 572000, China; 3. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China; 4. Qingdao Key Laboratory of Green Manufacturing of Marine Bioproducts, Qingdao Institute of Marine Bio-Manufacturing Industry, Qingdao 266071, China;5. Key Laboratory of Biological Processing of Aquatic Products, China National Light Industry, Qingdao 266404, China)

Abstract： Given the significant differences in amino acid composition among proteins from various sources, the development of aminopeptidases with broad substrate spectrum can effectively support the efficient and directional hydrolysis of proteins. To overcome the narrow substrate spectrum of existing aminopeptidases, a novel aminopeptidase gene APs(Ar)-3 was screened and identified from Acinetobacter radioresistens a2, which was heterologously expressed in Escherichia coli. Enzymatic properties of APs(Ar)-3 were identified, and it was applied to the hydrolysis of oyster proteins. The results showed that APs(Ar)-3 exhibited a broad substrate spectrum, displaying prominent catalytic activity towards Ala-pNA and Arg-pNA, and was also capable of hydrolyzing hydrophobic amino acids such as Met and Leu. The optimal reaction temperature was 45 ℃, and the optimal reaction pH was 7.0. The enzyme maintained good stability at temperatures below 45 ℃ and within the pH range of 6.0-8.0. Co2+ at 0.1 mmol/L could significantly activate the aminopeptidase activity of APs(Ar)-3, while Zn2+ and Cu2+ had inhibitory effects on the enzyme. In the enzymatic hydrolysis of oyster proteins, the degree of hydrolysis achieved by the synergistic action of APs(Ar)-3 with bromelain and trypsin were 57.86% and 57.61%, respectively, which were 17.2% and 10.69% higher than those of commercial aminopeptidases. Moreover, the addition of APs(Ar)-3 increased the umami taste value of the oyster protein hydrolysate and reduced its bitterness and astringency. This study aimed to provide an efficient aminopeptidase with a broad substrate spectrum for the preparation of protein hydrolysates, and offer theoretical reference and technical support for the directional hydrolysis of proteins and the high-value development and application of oyster resources.

Keywords： aminopeptidase; substrate specificity; enzymatic properties; oyster protein; flavor control

doi：10.12301/spxb202500438

文章编号：2095-6002(2026)02-0110-12

引用格式：普佳妮,崔雨珊,张铭月, 等. 一种广谱氨肽酶的鉴定及其在牡蛎蛋白质高效水解中的应用[J]. 食品科学技术学报,2026,44(2):110-121. PU Jiani, CUI Yushan, ZHANG Mingyue, et al. Identification of a broad-spectrum aminopeptidase and its application in efficient hydrolysis of oyster proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(2):110-121.

中图分类号： TS254.1; Q814.9

文献标志码： A

收稿日期： 2025-08-22

基金项目： 山东省重点研发计划项目(2024CXPT073);国家自然科学基金资助项目(32225039、32402021)。

Foundation： Key R&D Program of Shandong provine (2024CXPT073);National Natural Science Foundation of China (32225039, 32402021).

第一作者： 普佳妮,女,硕士研究生,研究方向为海洋食品酶挖掘与应用;

共同第一作者：崔雨珊,女,硕士研究生,研究方向为海洋食品蛋白质分析与检测。

*通信作者： 董 浩,男,副教授,博士,主要从事海洋食品酶与合成生物学方面的研究。

(责任编辑：叶红波)