葡萄酒的风味轮廓复杂,是一系列活性化合物(包括挥发性与非挥发性化合物)共同作用的结果[1];萜烯类物质是葡萄酒品种香气物质的典型代表,它们普遍嗅觉阈值较低,能够表现出葡萄品种典型的香气特征[2-5]。值得注意的是,萜烯类物质在葡萄酒中的挥发呈香受到多酚类物质基质效应的影响[6-7],酚类化合物与香气物质之间的分子互作成为葡萄酒风味化学的研究热点[8],但是该方面研究大多围绕在酚类对酯类、醇类及酮类等香气成分的表观基质效应层面[9-12],缺少对分子层面相互作用机制的深入探讨。相比之下,酚类物质如何影响萜烯这类重要香气化合物,相关探讨更显不足。在葡萄酒陈酿这一动态过程中,酚类与萜烯之间的相互作用机制尚未被充分揭示,其潜在影响也有待进一步阐明。

酚酸是葡萄酒酚类物质的重要组成部分,尤其在红葡萄酒中含量丰富,对葡萄酒的颜色、口感乃至香气均有重要贡献[13-14]。咖啡酸是一种典型的酚酸,具有酚羟基和丙烯酸两个功能基团。它能够增强并稳定红葡萄酒的色泽。近年来的研究也逐步揭示其通过分子内及分子间的反应调控着香气的形成与释放,进而影响葡萄酒的香气[15-16]。由于酚酸物质和香气化合物都是无色的小分子有机物,在真实实验环境中直接观测其相互作用是一项巨大挑战。这也使得解析酚酸互作机制变得困难。已有研究利用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)从化学成分角度,揭示了酚类基质效应对特定香气化合物的挥发性影响。例如,与对照溶液相比,酚酸(没食子酸等)降低了苯甲酸乙酯的香气挥发性[17]。通过分析热力学数据,能够从分子水平确定结合位点,并据此阐明相互作用的性质[18],通过紫外-可见光谱法分析发现,疏水作用是酚酸与乙酸乙酯之间相互作用的主要驱动力[19]。现代量子化学计算是解析微观分子相互作用的另一种方法,该方法擅长处理分子间的弱相互作用,能够为孤立及相互作用的超分子体系提供可靠的几何与电子结构信息,这使得利用量子化学计算描述酚酸与香气化合物的相互作用成为一种优越的选择,从而深化了对酚类基质效应及其潜在作用机制的理解[20-21]。然而,这些技术仅在分子水平上提供了有限的单一信息,不能完整解析混合物的相互作用机制。

本研究选取了葡萄酒中普遍存在的典型酚酸物质——咖啡酸为研究对象,通过仪器检测、感官分析、实验与理论计算相结合的方法,探究模拟葡萄酒体系中咖啡酸对萜烯挥发性的影响,阐明萜烯在咖啡酸基质中的嗅觉感知变化,从多维度解析咖啡酸与萜烯之间的相互作用机制。希望研究结果可为后续相关研究提供可参照的技术方法,同时也希望为理解酚酸-香气互作机理奠定初步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒石酸、氢氧化钠,分析纯,四川西陇科学有限公司。无水乙醇,色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;D-柠檬烯、里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇、香叶醇、橙花叔醇、C7～C40系列正构烷烃、咖啡酸、盐酸胍(guanidine hydrochloride,GuHCl)、丙二醇(propylene glycol,PG),色谱纯(纯度≥99.0%),德国Meker公司;同位素标准品α-萜品醇-d3与(±)-里哪醇-d3,加拿大CDN ISOTOPES公司。

1.2 仪器与设备

QP2020型GC-MS仪(配置AOC-6000型自动进样器、2.5 mL恒温气密注射器)、UV-3600i型紫外-可见分光光谱仪(UV-Vis)日本岛津公司;气相色谱柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm),美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 咖啡酸对陈酿期间萜烯类物质挥发性影响的测定

1)模拟葡萄酒样品的制备。在模拟葡萄酒体系(乙醇的体积分数为12.0%,酒石酸的质量浓度为5 g/L,用氢氧化钠水溶液调节pH值为3.5)中,参照红葡萄酒中常见平均质量浓度加入7种典型的萜烯标准品,初始质量浓度为0.9 μg/L D-柠檬烯、3.5 μg/L里哪醇、1.0 μg/L α-萜品醇、2.5 μg/L香茅醇、3.6 μg/L橙花醇、10.8 μg/L香叶醇、4.3 μg/L橙花叔醇。将模拟葡萄酒体系中加入不同质量浓度的咖啡酸。参考新酿红葡萄酒中咖啡酸常见含量(250 mg/L),以250 mg/L为100%,设置6个含量梯度:0%(CK组,0 mg/L)、25%(C1组,62.5 mg/L)、50%(C2组,125 mg/L)、100%(C3组,250 mg/L)、200%(C4组,500 mg/L)、300%(C5组,750 mg/L)。所有酒样于室温(25 ℃)避光条件下陈酿90 d。在陈酿期间,前120 h内每24 h取样进行分析,120 h后改为每15 h取样分析。每个处理组设置3次重复。

2)萜烯检测前处理。陈酿过程中产生的萜烯类物质,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)进行分析,并建立萜烯标准品的定量校正曲线。取8 mL模拟葡萄酒样品置于15 mL顶空瓶中,加入2 g氯化钠及氘代内标[20 μL质量浓度为0.016 g/L的α-萜品醇-d3或(±)-里哪醇-d3]。使用自动进样器进行萃取:样品于40 ℃下搅拌平衡15 min后,将DVB/CAR/PDMS萃取头在40 ℃、600 r/min振荡条件下暴露吸附30 min,随后于气相色谱进样口250 ℃解吸5 min。

3)色谱检测方法。色谱条件参照文献[22]的方法,色谱柱为DB-WAX毛细管柱。程序升温条件为起始温度40 ℃并维持3 min;随后以4 ℃/min的速率升至160 ℃;最后以7 ℃/min的速率升至220 ℃,并在此温度下保持5 min。电子电离质谱扫描范围为m/z35～350,扫描间隔0.2 s。

4)定性定量方法。萜烯化合物定性通过比对标准品的保留时间、保留指数及质谱图与NIST 17.0质谱库标准品数据进行。定量分析采用同位素内标-标准曲线法进行,具体信息见表1。

表1 萜烯化合物的定性与定量分析

Tab.1 Qualitative and quantitative analysis of terpene compounds

序号萜烯标准品CAS号t(保留)/min保留指数MS 特征离子标准曲线R2定量内标1D-柠檬烯99-86-515.691023121, 93, 136y=121.16x+0.09350.9981α-萜品醇-d32里哪醇78-70-628.62109793, 91, 79y=318.32x-0.53150.9969(±)-里哪醇-d33α-萜品醇98-55-533.55118993, 121, 91y=201.99x-0.06160.9981α-萜品醇-d34香茅醇106-22-935.17122059, 93, 121y=287.59x-0.30280.9988(±)-里哪醇-d35橙花醇106-25-236.34122471, 93, 55y=665.87x-0.11670.9986(±)-里哪醇-d36香叶醇106-24-137.45124269, 68, 67y=961.35x-1.27310.9961(±)-里哪醇-d37橙花叔醇7212-44-440.81152469, 68, 67y=112.18x-0.13630.9981(±)-里哪醇-d3

标准曲线中y表示真实质量浓度,x表示测试酒样的目标萜烯化合物峰面积/内标峰面积。

1.3.2 咖啡酸对萜烯在酒体与顶空气体中分配影响的测定

采用静态顶空-气相色谱-质谱法(HS-GC-MS)测定咖啡酸对萜烯在酒体与顶空气体中的分配系数,并计算咖啡酸与萜烯类物质在酒体中的结合率。

1)气相-基质分配系数的测定。采用相比变化法测定萜烯在咖啡酸基质中的气相-基质分配系数[23]。将浓度为0.1 mmol/L的各萜烯分别添加至溶解有咖啡酸的模拟葡萄酒中。咖啡酸设置6个质量浓度梯度:0、62.5、125、250、500、750 mg/L。分别吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL混合液置于20 mL顶空瓶中,获得气相/基质相比例(β)分别为199、99、39、19、9、3的样品组。于35 ℃振荡孵育12 h以达到释放平衡,随后采用HS-GC-MS进行测定。顶空条件如下:样品于35 ℃平衡40 min,使用2.5 mL恒温气密注射器抽取750 μL顶空气体进行进样。气相色谱-质谱分析条件与1.3.1节完全相同。按式(1)和式(2)计算分配系数。

=a×β+b ;

(1)

(2)

式(1)和式(2)中,A为色谱峰面积,β为气相/基质相比例,Ki为气相-基质分配系数。通过对1/A与β进行线性回归拟合,获得斜率(a)与截距(b)。

2)结合率的测定。按1.3.2节1)中方法配制萜烯-咖啡酸混合酒体溶液,取7 mL混合液转移至20 mL顶空瓶中,进行HS-GC-MS分析。通过计算不含咖啡酸与含咖啡酸溶液中萜烯化合物峰面积(S)的差值,得到萜烯的结合率[24]。

结合率

(3)

1.3.3 感官分析方法

1)感官品评小组培训。感官品评小组由19名参与者构成(女性10名,男性9名,年龄20～30岁,身体健康,无吸烟史)。感官培训首先系统介绍了品评的基本原理与操作方法,并重点围绕法国Le Nez du Vin的54种葡萄酒标准香气样品,展开了为期两个月的针对性记忆与描述训练。每日训练时长约为30 min,最终使全体小组成员对标准香气的辨识与描述准确率稳定在95%以上。所有正式的感官分析均在符合规范的专业实验室内完成。该实验室配备了彼此独立的评价隔间,并将环境温度恒定控制在20 ℃,以最大限度减少外部干扰对品评结果的影响。

2)感官差异性分析。三点选配法测试(3-AFC)依据ISO-13301标准[25]进行。所有待测溶液均含有一种溶解于模拟葡萄酒中的萜烯,其浓度为该萜烯阈值的2倍。每组3个样品中,第3个样品分别添加了5种质量浓度梯度的咖啡酸(62.5、125、250、500、750 mg/L)。感官评价前,样品于室温平衡30 min。 评价员需从每组3个样品中辨别出不同的那一个。每个样品以3位随机数字编号。判断结果的显著性参照文献[26]的方法进行评估。

1.3.4 热力学测定方法

参照文献[15]的方法并稍作修改,采用紫外-可见光光谱法测定酒体中咖啡酸与萜烯类物质的复合物——萜烯-咖啡酸分子的热力学性质。

在20 ℃下,将萜烯化合物标准品分别单独添加至溶解有咖啡酸的模拟葡萄酒中。咖啡酸设置6个质量浓度梯度:0、62.5、125、250、500、750 mg/L。在咖啡酸含量为250 mg/L时,分别于25、35、45 ℃下评估温度的影响。所有溶液均设置3个重复,于避光条件下平衡30 min。使用紫外-可见分光光度计,以1 cm光程石英比色皿和蒸馏水为参比,在恒定波长间隔(Δλ=1 nm)下记录所有样品在190～250 nm范围内的吸收光谱。反应的平衡常数(K)、标准吉布斯自由能变(ΔG°)、焓变(ΔH°)和熵变(ΔS°)通过式(4)、(5)、(6)、(7)计算。

(4)

ΔG°=-RT×lnK ;

(5)

ΔG°=ΔH°-TΔS° ;

(6)

(7)

式(4)至式(7)中,A0代表未添加咖啡酸时萜烯在特定波长下的最大可见吸光度值,而A则表示加入咖啡酸后萜烯在同一波长下的实测吸光度。参数C表示模拟酒中咖啡酸的添加含量,T为开尔文温度(实验以室温298.15 K为基准),R为气体常数(8.314 J/mol·K)。

1.3.5 量子化学计算方法

萜烯-咖啡酸复合物参照文献[27-28]提供的计算方法,采用量子化学计算研究萜烯-咖啡酸分子的化学机制,从热力学的角度解释萜烯-咖啡酸分子的相互作用的机理。

所有量子化学计算均使用Gaussian 16程序包和UltraEdit 26软件完成。采用添加了Grimme色散校正的B3LYP杂化交换相关泛函,结合6-31+G(d)基组,对咖啡酸、萜烯及其复合物进行几何结构优化。该方案亦用于振动频率分析,以确认势能面极小值点,并为热力学计算获取校正值。结合能的定义与文献[27]的建议相似。相互作用能计算中的基组重叠误差(BSSE)通过CAM-B3LYP-D3/aug-cc-pVDZ水平的均衡校正法进行修正。

1.3.6 分子间相互作用类型验证方法

参照文献[24]的方法并稍作修改,通过添加化学键破坏试剂,测定相互作用力强化或抑制后咖啡酸对萜烯类物质的结合率,从而验证萜烯-咖啡酸分子的相互作用类型。

按1.3.2节方法配制萜烯-咖啡酸混合液。分别以模拟葡萄酒为溶剂,配制体积分数为80%的PG溶液和4 mol/L的GuHCl溶液,并用酒石酸调节pH至3.5。将PG溶液、GuHCl溶液分别与萜烯-咖啡酸混合液按1∶2体积比混合,磁力搅拌1 h。结合率的测定同1.3.2节,以未添加PG和GuHCl的咖啡酸溶液作为对照。通过比较相关化学键被破坏前后,不同体系中萜烯结合率的变化,验证萜烯-咖啡酸相互作用的主要驱动力类型。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016进行所有数据的基础整理与初步统计。为检验不同样品组间的差异是否显著,采用了IBM SPSS Statistics 26.0(美国SPSS公司)进行单因素方差分析(ANOVA)。图表均使用Origin 2025(美国Origin Lab公司)软件绘制完成。

2 结果与分析

2.1 陈酿期间咖啡酸对萜烯挥发性的影响

通过对陈酿90 d的酒样进行HS-SPME-GC-MS分析,追踪了其中萜烯含量的动态变化,分析结果见图1和附录附表1～8。由图1可知,在模拟酒体系中检测到的萜烯包括里哪醇、α-萜品醇、D-柠檬烯、香茅醇、香叶醇、橙花醇和橙花叔醇,未发现其他萜烯类物质。分析发现,在陈酿过程中,不同萜烯表现出各异的变化规律:D-柠檬烯、α-萜品醇和香叶醇的含量随陈酿时间延长逐步下降,萜烯总量也呈降低趋势;与之相反,里哪醇与橙花醇的含量则逐渐上升;香茅醇呈现出先增后减的变化模式;而橙花叔醇在整个陈酿期间保持相对稳定,未见显著波动。这些差异可能源于萜烯的不同理化特性与转化路径。含量下降的D-柠檬烯、α-萜品醇和香叶醇,主要因挥发性逸失而导致减少;而里哪醇、橙花醇及香茅醇含量的增加,则可能与陈酿中发生的分子重排反应有关[5,29]。里哪醇、橙花醇和香茅醇可通过分子重排由其他游离态萜烯转化而来,这使得其最终含量甚至高于初始添加水平。

图1 陈酿过程中萜烯类化合物含量的动态变化
Fig.1 Dynamic changes of terpene content during aging process

分析图1数据可以发现,相较于只含有萜烯化合物的对照组(CK组),含有咖啡酸的处理组中萜烯的整体含量明显更高。这一结果支持了我们的推断,即在陈酿过程中,咖啡酸能够抑制萜烯的挥发,从而降低其逸散损失。该现象与既有文献的报道相符,例如多酚类物质可与香叶醇、橙花醇等成分结合,进而抑制它们从葡萄酒中挥发[30]。值得注意的是,不同浓度的咖啡酸对萜烯的保留效果呈现出差异性。对于D-柠檬烯、香茅醇、里哪醇和香叶醇这几种物质而言,咖啡酸的浓度越高,保留效果越显著。在陈酿90 d后,添加750 mg/L咖啡酸的处理组中,D-柠檬烯的含量达到CK组的192.46%,里哪醇、香茅醇和香叶醇的含量也分别达到CK组的123.10%、136.71%和141.56%。此外,α-萜品醇的表现与其他萜烯略有不同。在咖啡酸浓度较低时,其挥发性并未受到明显影响;然而,当咖啡酸浓度达到 250 mg/L及以上时,α-萜品醇的含量开始显著增加。在750 mg/L的处理中,其含量最高可增至CK组的128.70%。这表明咖啡酸对其挥发性的抑制同样存在一个浓度阈值。

咖啡酸对橙花醇挥发行为的影响,在陈酿的不同阶段呈现出有趣的变化模式。在陈酿初期,较高的咖啡酸含量反而与较低的橙花醇含量相关联;但随着陈酿进入后期,所有添加咖啡酸的处理组中,橙花醇的含量均反超了CK组。其中,当咖啡酸质量浓度为500 mg/L时,在陈酿90 d后的保留效果最为突出,橙花醇含量达到对照组的128.19%。与此形成对比的是,橙花叔醇在整个实验过程中表现得颇为独特,其含量变化并未受到咖啡酸添加的显著影响,各处理组间均未观察到统计学差异。从萜烯总量的角度来看,咖啡酸的保留效应在陈酿早期尤为明显。至陈酿90 d时,这种效应在高浓度处理中依然得以维持,在咖啡酸浓度为750 mg/L的条件下,萜烯总含量达到最高,约为对照组的113.42%。这一结果进一步印证了咖啡酸作为基质成分,对维持葡萄酒体系中香气物质保留的积极作用[30]。

2.2 咖啡酸对萜烯分配系数的影响

采用PRV方法计算了平衡条件下的气相-基质分配系数(Ki),以评价萜烯与咖啡酸之间的相互作用。通常,Ki值越低,表明体系对萜烯的亲和力越强,保留作用也越明显[22]。不同浓度的咖啡酸对萜烯释放程度的影响见表2。由表2可知,所有萜烯在不含咖啡酸的对照(CK)中Ki值均为最高,说明其在CK中的挥发性最强。而在添加咖啡酸的处理组中,各萜烯的Ki值均有所降低,保留程度相应提高,这证实了两者间确实发生了相互作用。从变化趋势来看,随着咖啡酸质量浓度的升高,里哪醇、D-柠檬烯、α-萜品醇、香叶醇和橙花叔醇的Ki值整体呈下降趋势。值得注意的是,橙花醇的Ki值表现为先降后升,而香茅醇的Ki值则经历了下降、回升、再下降的波动过程,并在咖啡酸质量浓度为750 mg/L时达到最低。具体到个别萜烯:在咖啡酸浓度较低时,D-柠檬烯的Ki值变化并不显著,但当质量浓度升至500 mg/L及以上时,其Ki值明显降低。类似的现象也出现在里哪醇、香叶醇和橙花叔醇中。α-萜品醇则表现出不同的特点:当咖啡酸质量浓度从125 mg/L增加至750 mg/L时,其Ki值未呈现明显差异。此外,橙花醇在不同咖啡酸浓度下均表现出较好的保留效果,其中在500 mg/L时Ki值最低,这也与2.1节中C4处理组橙花醇含量最高的结果相一致。这与之前的研究结果相一致,咖啡酸可以抑制香气化合物的挥发性,减缓葡萄酒体系中香气物质的挥发损失[30]。

表2 PRV法测定咖啡酸模型酒中萜烯的气相-基质分配系数

Tab.2 Gas-matrix partition coefficients of terpenes in model wines with caffeic acid by PRV method

序号萜烯化合物Ki/%CKC1C2C3C4C51D-柠檬烯12.73±1.23 a9.56±0.94 b8.74±0.62bc7.27±0.61c4.02±0.35d3.58±0.15d2里哪醇4.18±0.31 a3.19±0.27 b2.82±0.38 bc2.11±0.25 c1.16±0.18 d0.68±0.00 d3α-萜品醇5.14±0.90 a3.76±0.38 b2.11±0.24 c1.42±0.11 c1.30±0.20 c1.07±0.09 c4橙花醇5.37±0.35 a1.72±0.13 b1.63±0.12 b1.13±0.09 c0.52±0.09 d1.59±0.09 bc5香茅醇6.35±0.77 a4.24±0.32b1.84±0.16 cd2.36±0.10 c2.49±0.20 c1.19±0.08 d6香叶醇5.51±0.65 a5.40±0.61 a3.58±0.30b2.34±0.13c1.93±0.21c0.83±0.02 d7橙花叔醇6.78±0.64a4.31±0.41b3.68±0.26b2.61±0.21c1.29±0.18d0.78±0.04d

同行不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

2.3 咖啡酸对萜烯嗅觉感知与结合率的影响

采用3-AFC方法测定了不同含量的咖啡酸对萜烯的嗅觉感知影响,从感官层面评估咖啡酸与萜烯的相互作用,实验结果见图2。3-AFC测试结果见图2(a),当咖啡酸质量浓度为750 mg/L时,所有萜烯的嗅觉感知表现出高度的显著差异(P<0.01)。D-柠檬烯在C4和C5体系中表现出嗅觉感知的显著差异,在C1、C2和C3体系中没有任何显著变化。这一现象同样发生在里哪醇、香叶醇和橙花叔醇中。当咖啡酸质量浓度从250 mg/L增加至750 mg/L时,α-萜品醇嗅觉感知的显著性也逐渐增高。不同浓度的咖啡酸体系中均能引起橙花醇的嗅觉感知变化,而橙花醇仅在C2和C5体系中表现出显著的嗅觉感知差异。这与之前的研究结果一致,红葡萄酒中多种酚类物质如单宁、葡萄果皮单宁提取物、咖啡酸等会对香气物质的释放感知产生抑制作用[31-33]。

图2 萜烯与咖啡酸相互作用的感官差异性结果和结合率热图
Fig.2 Sensory differences and binding rate heatmap of interaction between terpenes and caffeic acid

咖啡酸对萜烯的结合率见图2(b)。将感官分析结果与咖啡酸对萜烯的结合率进行直接比较,结果显示两者之间存在相关性。值得注意的是,具有较强结合率的体系会导致香气感知发生非常显著的变化,这在所得到的热图中可以直观地看到。如当咖啡酸质量浓度为750 mg/L时,香叶醇的结合率为79.95%,嗅觉感知的差异显著性为0.00%。相反,当萜烯的结合率较弱时,向萜烯溶液中添加咖啡酸不会使香气感知产生任何明显的变化。如C1体系中D-柠檬烯的结合率为14.42%,感官分析的P值为64.81%,无显著性差异。因此,香气化合物的结合率适用于在分子水平上预测感官实验[34]。

2.4 咖啡酸与萜烯相互作用的热力学测定结果分析

为深入探究咖啡酸对葡萄酒萜烯类化合物释放的影响,并解析其与萜烯分子的相互作用机制,研究利用紫外-可见光谱对咖啡酸与7种代表性萜烯的热力学相互作用进行了表征,结果见表3。表3列出了模拟体系中7个反应体系的热力学数据(K、ΔG°、ΔH°、ΔS°)。

表3 不同萜烯-咖啡酸结合体系的热力学特性

Tab.3 Thermodynamic properties of different terpene-caffleic acid binding systems

序号萜烯化合物K/(mol/L)ΔG°/ (kJ/mol)ΔH°/ (kJ/mol)ΔS°/ (J/(mol·K))1D-柠檬烯3.11-2.817.8135.642里哪醇17.93-7.164.1737.983α-萜品醇23.48-7.823.3937.604橙花醇31.83-8.582.2936.465香茅醇7.15-4.871.6521.906香叶醇36.01-8.886.2250.647橙花叔醇22.07-7.6713.0069.31

从热力学参数来看,平衡常数K是表征咖啡酸与萜烯分子结合强度的直接指标,其数值大小可用于定量评估二者间的相互作用程度[14]。式(4)描述了溶液吸光度随咖啡酸添加量变化的关系,其函数形式与K相关。在7种萜烯类化合物中,香叶醇-咖啡酸体系的K值最高(36.01 mol/L),其后依次为橙花醇-咖啡酸体系(31.83 mol/L)、α-萜品醇-咖啡酸体系(23.48 mol/L)、橙花叔醇-咖啡酸体系(22.07 mol/L)、里哪醇-咖啡酸体系(17.93 mol/L)、香茅醇-咖啡酸体系(7.15 mol/L)和D-柠檬烯-咖啡酸体系(3.11 mol/L)。这一顺序在标准吉布斯自由能变(ΔG°)中也得到印证:所有体系的ΔG°均为负值(<0 kJ/mol),计算值处于-8.88至-2.81 kJ/mol之间,证实结合过程可自发进行,且ΔG°负值越小,结合趋势越强[15]。香叶醇依然表现最突出,其后依次为橙花醇、α-萜品醇、橙花叔醇、里哪醇、香茅醇、D-柠檬烯,可见,D-柠檬烯仍处于末位。然而,咖啡酸与萜烯类化合物之间的结合并非强共价键,而是一种结合强度稍弱的非共价相互作用[14-15],容易受客观环境影响。加热、机械搅拌或振荡均可破坏该作用,从而释放香气分子。这也解释了在感官分析和GC-MS测试中,添加咖啡酸的模拟酒样品往往表现出更强香气特征的原因。进一步分析焓变(ΔH°)与熵变(ΔS°)发现,所有体系的ΔH°与ΔS°均大于零。这一热力学特征提示,疏水效应在咖啡酸与萜烯的相互作用中起主导作用[35],也与多酚-香气分子间普遍存在疏水相互作用的已有研究结果相符[36]。

2.5 咖啡酸与萜烯相互作用的量子化学计算结果分析

为进一步探究咖啡酸与萜烯类化合物的相互作用机制,本研究采用量子化学计算方法,通过分析相互作用过程的热力学特征,评估其作用潜力与强度,解析相互作用的能量组成。具体针对咖啡酸与7种代表性萜烯类化合物的热力学相互作用进行了表征,结果见表4。 表4列出了通过计算得到的萜烯-咖啡酸结合物最优构象对应的热力学参数ΔG°、ΔH°、ΔS°、静电能(ΔEelectronic)、色散能(ΔEdispersion),内能(ΔEthermal)。量子化学计算结果表明,除D-柠檬烯外,其余所研究的萜烯均能与咖啡酸形成能量上稳定的复合物。经过量子化学构象筛选与结构势能面扫描,确定了各体系的最低能量构象,并选取其作为代表性构象。最优构象的结构展示见图3。从优化后的空间构型来看,这些复合物中萜烯的羟基倾向于靠近咖啡酸的芳香环平面,这样的排列方式有利于形成更强的分子间作用力。

蓝色区域代表氢键,绿色区域对应色散力。

图3 不同萜烯-咖啡酸结合体系中的共价相互作用可视化结果
Fig.3 Visualization results of non-covalent interactions in different terpene-caffeic acid binding systems

表4 不同萜烯-咖啡酸结合体系的理论热力学特性

Tab.4 Theoretical thermodynamic properties of different terpene-caffeic acid binding systems

序号萜烯化合物ΔG°/ (kJ/mol)ΔH° /(kJ/mol)ΔS°/ (J/(mol·K))ΔEthermal/(kJ/mol)ΔEdispersion/(kJ/mol)ΔEelectronic/(kJ/mol)1D-柠檬烯9.72-28.69-128.86-26.22-27.91-35.572里哪醇-8.03-56.21-161.60-53.73-30.02-64.333α-萜品醇-5.13-51.09-154.16-48.61-22.35-59.364橙花醇-13.98-59.31-152.07-56.84-15.54-68.0455香茅醇-5.14-60.96-187.23-58.48-35.51-69.276香叶醇-1.85-48.73-157.22-46.25-28.87-56.617橙花叔醇-6.89-59.98-178.05-57.50-39.32-68.81

从表4的热力学参数可以看出,在咖啡酸存在的情况下,除D-柠檬烯外,其余所研究的萜烯类化合物与咖啡酸结合的ΔG°均为负值(<0 kJ/mol)。这说明两者之间的结合是一个自发进行的过程[15],与实验观测结果一致。值得注意的是,其中橙花醇-咖啡酸体系表现出最强的相互作用趋势,其ΔG°低至-13.98 kJ/mol,其后依次为里哪醇-咖啡酸体系(-8.03 kJ/mol)、橙花叔醇-咖啡酸体系(-6.89 kJ/mol)、香茅醇-咖啡酸体系(-5.14 kJ/mol)、α-萜品醇-咖啡酸体系(-5.13 kJ/mol)、香叶醇-咖啡酸体系(-1.85 kJ/mol)。 但这个计算得出的顺序与实验测定结果并不完全吻合。D-柠檬烯的情况则最为特殊,计算结果显示其与咖啡酸结合的过程ΔG°>0 kJ/mol,表明这是一个非自发的吸热过程,意味着两者在常态下较难结合,需要外部能量驱动。这与实验结果存在明显分歧。一个可能的解释是,实验体系中所含的乙醇可能改变了分子间的相互作用模式,已有研究证实乙醇能够调节分子间作用力[10],这或许可以部分解释计算与实验之间的差异。

结合表3与图3的数据,发现所有萜烯与咖啡酸相互过程的ΔH°和ΔS°均为负值。这一热力学特征表明,色散相互作用与氢键在两者结合中扮演了关键角色[35],该结论与文献[33]的研究结果相符。图3进行了独立梯度模型(IGMH)分析,以sign(λ2)ρ值和δg值为横、纵坐标画出散点图。在散点图中δg值对应为0.5 a.u.(原子单位)等值线下方的散点区域,通过sign(λ2)ρ值可以直观观察到各体系的分子间弱相互作用类型:蓝色区域代表氢键,绿色区域则对应色散力,进一步揭示了复合物的稳定机制。对比6个体系发现,蓝色区域等值面面积均大于绿色区域。α-萜品醇-咖啡酸体系和橙花醇-咖啡酸体系的绿色等值面面积较小,而里哪醇-咖啡酸体系、香叶醇-咖啡酸体系、香茅醇-咖啡酸体系和橙花叔醇-咖啡酸体系的绿色区域明显更大。表3中的结果也证实了6个体系中色散能的绝对值均低于静电能的绝对值,意味着它们的结合主要依靠氢键驱动,色散作用的贡献相对有限。值得注意的是,理论计算与实验结果之间仍存在一定偏差。这种差异或许可部分归因于模拟酒体系中乙醇的存在。已有研究指出,乙醇可能干扰或调节氢键的形成[10],这或许使得实际体系中的相互作用比真空中的理论计算更为复杂。

2.6 咖啡酸与萜烯相互作用类型的验证

实验和理论计算得出的相互作用可以使用化学键破坏试剂来验证。针对性地向萜烯-咖啡酸体系中添加化学键破坏试剂,测定相互作用力强化或抑制后咖啡酸对萜烯的结合率,从而验证萜烯与咖啡酸的结合机制,结果见图4。丙二醇(PG)可以弱化疏水相互作用并强化氢键,盐酸胍(GuHCl)可以弱化疏水相互作用、抑制氢键相互作用[37]。由图4可以看出,萜烯-咖啡酸体系中添加PG后,里哪醇、橙花醇、香茅醇和橙花叔醇的结合率与对照组相比无显著差异(P> 0.05)。PG弱化了咖啡酸与里哪醇、橙花醇、香茅醇和橙花叔醇的疏水性结合,但这4种萜烯类化合物的吸附率没有显著降低,可能是咖啡酸通过被强化的氢键结合了部分萜烯,从而较好地维持了这4种萜烯类化合物在空气和咖啡酸基质两相的平衡分布,这在一定程度上证实了这4种萜烯-咖啡酸结合体系是疏水相互作用、氢键共同驱动的结果。此外,添加GuHCl后,里哪醇、橙花醇、香茅醇和橙花叔醇的结合率与对照和PG组相比都显著降低(P<0.001),说明疏水相互作用、氢键作用的抑制降低了咖啡酸捕获萜烯的能力,从而增加了这4种萜烯类化合物的释放强度。α-萜品醇和香叶醇的结合率排序为对照>PG>GuHCl,且每个处理组间均具有显著差异,氢键的强化并没有抵消疏水作用的弱化,这说明在α-萜品醇和香叶醇与咖啡酸的相互作用过程中疏水相互作用的贡献大于氢键的贡献,这与实验和理论计算结果一致。添加PG和GuHCl后,D-柠檬烯的结合率均显著降低,说明疏水作用的削弱增加了D-柠檬烯的释放。强化氢键的PG组和抑制氢键的GuHCl组无显著差异,说明D-柠檬烯和咖啡酸之间没有氢键作用,这与热力学和量子化学计算结果一致。

Control为萜烯-咖啡酸混合物体系,PG为添加了丙二醇的萜烯-咖啡酸混合物体系, GuHCl为添加了盐酸胍的萜烯-咖啡酸混合物体系。*表示组间数据有显著差异(P<0.05),**代表组间数据有极显著差异(P<0.01),***代表组间数据有极其显著差异(P<0.001)。

图4 化学键断裂对萜烯结合率的影响
Fig.4 Effect of chemical bond disruption on terpene binding percentages

3 结 论

通过综合应用GC-MS、感官分析、光谱技术及量子化学计算等多种方法,从不同维度揭示了模拟葡萄酒体系中咖啡酸与萜烯分子相互作用的分子机制。研究发现咖啡酸可抑制萜烯化合物的挥发性,抑制程度受到咖啡酸浓度的影响。热力学分析和量子化学计算结果表明咖啡酸与萜烯分子间的结合过程可自发进行,其中疏水作用和氢键提供了主要驱动力。结合机制验证实验证实了疏水作用和氢键在萜烯-咖啡酸复合物中的贡献。值得注意的是,感官分析结果与GC-MS数据呈现出明确的相关性,当咖啡酸对萜烯的结合率越高时,其香气的可感知变化也越显著,这从香气感知层面印证了咖啡酸与萜烯分子互作的实际影响。此外,不同萜烯化合物与咖啡酸的结合存在差异性,如结构中缺乏氧原子的D-柠檬烯与咖啡酸的结合程度就远低于其他含氧萜烯醇,这说明萜烯分子自身的官能团特性在相互作用中起着重要作用。

需要指出的是,研究是在模拟酒体系中完成的,真实葡萄酒中除了咖啡酸与萜烯类化合物,还存在大量其他多酚、多糖、蛋白质等成分,它们之间同样存在竞争或协同效应,可能会使相互作用更为复杂。尽管存在上述局限,研究仍从分子层面深化了对葡萄酒中多酚基质效应的理解,为萜烯类花果香气的调控提供了理论依据。未来的研究将聚焦在真实葡萄酒的复杂多组分体系中验证此机制,并将研究拓展至其他多酚与香气化合物之间的相互作用。

附录:补充数据

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Appendix:supplementary data

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Mechanism of Effect of Caffeic Acid on Terpene Volatility in Wine

SONG Hongcong1, WANG Yiqing1, FENG Lin1, LI Aihua2, WANG Xingjie1, TAO Yongsheng1,3,*

(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 3. Shaanxi Key Laboratory for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

Abstract： Terpenes are typical varietal aroma compounds in wine, and their volatilization and aroma expression are influenced by the matrix effect of phenolic compounds present in wine. Caffeic acid is a representative phenolic acid in wine and can affect the volatilization loss of terpene flavor compounds during wine storage. To elucidate the molecular interaction mechanism between terpenes and caffeic acid, a model wine system containing seven terpenes was prepared. Different concentrations of caffeic acid (0, 62.5, 125, 250, 500, and 750 mg/L) were added, and headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry was employed to monitor the changes in terpene concentrations during 90 days of storage at room temperature (25 ℃). Subsequently, sensory analysis was conducted to evaluate the effect of caffeic acid on the olfactory perception of terpenes in wine. Thermodynamic analysis and quantum chemical calculations were performed to investigate the terpene-caffeic acid interaction mechanism from both experimental and theoretical perspectives. Finally, chemical bond disruption experiments were carried out to validate the proposed interaction mechanism. The results showed that caffeic acid suppressed the volatilization of terpenes, with concentrations of 500 mg/L or higher exhibiting the most pronounced effect. After 90 days of storage, the total terpene content in the 750 mg/L caffeic acid treatment group was 113.42% of that in the control group, indicating a significant reduction in volatilization loss. Sensory analysis further corroborated these findings: compared with the control, the 750 mg/L caffeic acid treatment group induced highly significant differences (P<0.01) in the recognition rates of aroma perception changes for all seven terpenes. Thermodynamic parameters determined by ultraviolet-visible spectroscopy revealed that both ΔH° and ΔS° were positive, indicating that hydrophobic interactions constituted the primary driving force for the non-covalent interaction between terpenes and caffeic acid. In contrast, quantum chemical calculations yielded negative values for ΔH° and ΔS°, suggesting that hydrogen bonding was the key stabilizing factor in terpene-caffeic acid complexes. The chemical bond disruption experiments confirmed the synergistic presence of both hydrophobic interactions and hydrogen bonding in the terpene-caffeic acid system. It was concluded that the addition of caffeic acid at concentrations of 500 mg/L or higher during wine storage could mitigate the volatilization loss of terpenes, and that caffeic acid and terpenes could form stable complexes through hydrophobic interactions and hydrogen bonding. This study was expected to provide technical support and a theoretical basis for the regulation of terpene volatilization and aroma expression in wine, as well as the evaluation of the polyphenolic matrix effect.

Keywords： wine; terpene; caffeic acid; quantum chemical calculation; molecular interaction

doi：10.12301/spxb202600059

文章编号：2095-6002(2026)02-0054-13

引用格式：宋鸿聪, 王一清, 冯林, 等. 咖啡酸对葡萄酒中萜烯类物质挥发性影响的作用机制[J]. 食品科学技术学报,2026,44(2):54-66. SONG Hongcong,WANG Yiqing, FENG Lin, et al. Mechanism of effect of caffeic acid on terpene volatility in wine[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(2):54-66.

中图分类号： TS261.4

文献标志码： A

收稿日期： 2026-01-30

基金项目： 国家自然科学联合基金重点项目(U25A20736)。

Foundation： Key Project of Joint Fund of National Natural Science Foundation of China (NSFC)(U25A20736).

第一作者： 宋鸿聪,女,博士研究生,研究方向为葡萄酒酿造与风味化学。

*通信作者： 陶永胜,男,教授,博士,主要从事葡萄酒酿造与风味化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)