山茶(Camellia oleifera Abel.)是世界四大木本油料作物之一,我国山茶油年产超过100万t,同时产生300万t以上的山茶籽饼副产物。但目前山茶籽饼的开发利用程度较低,这不仅造成农业资源浪费,还会带来环境污染等问题[1]。山茶籽饼除存在残余油脂外,还富含蛋白质、多糖,以及皂苷、多酚和维生素等活性成分[2]。目前,山茶籽多糖和皂苷等已有较多研究,而其蛋白质开发相关的研究还相对缺乏[3]。山茶籽饼中的蛋白质含量高达15%～21%,蛋白质经水解后得到的茶籽多肽具有抗氧化、降血糖、降血压等生物活性,这种富含蛋白质的农业副产物在生物活性多肽的开发和应用领域具有广阔的前景[4-5]。

蛋白质和肽在膳食营养中占有重要地位[6]。从植物资源中获得生物活性多肽最常用的方法是酶解和微生物发酵技术[7-8]。采用单酶或复合酶酶解因反应条件温和、可控,且肽键断裂位置明确,而具有易规模化、可预见性强等优点,是制备活性肽的有效方法[8-9]。和酶解法相比,微生物发酵制备植物蛋白多肽避免了使用昂贵的蛋白酶而具有成本优势,且发酵过程中产生的多肽种类和数量更具多样性[8-9]。传统发酵食品中存在的乳酸菌、芽孢杆菌等细菌以及酵母、曲霉等真菌是发酵制备植物多肽中常用的微生物菌种[9-10]。

山茶籽多肽在功能性食品和医药产品中具有较高的开发价值[4-5, 11-12]。多肽的规模化生产是制约其应用的主要因素,通过生物反应器发酵实现规模化制备多肽是活性多肽可持续生产的重要途径。现有山茶籽发酵多肽研究多停留在实验室小试阶段,发酵放大工艺优化与多维度活性评价方面的研究不足。为拓展山茶籽蛋白的高值化利用,本研究以抗氧化活性为指标,评估不同菌种发酵山茶籽多肽的抗氧化能力并对发酵菌种进行筛选。在此基础之上,通过5 L生物反应器对山茶籽多肽的实验室规模发酵放大进行参数优化,旨在为山茶籽来源生物活性肽的工业化发酵生产及其在功能性食品等领域的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山茶籽饼,心族(上海)农业科技有限公司;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1(NO.29154)、枯草芽孢杆菌2(NO.29155),分离自酸面团,保藏于中国微生物保藏中心(CGMCC)。植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum),分离自纳豆发酵物;米曲霉(Aspergillus oryzae),分离自酱油发酵残渣;毛霉1(Mucor rouxianus),分离自发酵腐乳;毛霉2(Mucor racemosus),分离自发酵豆豉,均由本实验室保藏。MRS培养基、PDA培养基,青岛海博生物;LB固体培养基、LB液体培养基,北京索莱宝科技有限公司;消泡剂,上海迈瑞尔生化科技有限公司;Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品(98.00%),美国Sigma-Aldrich公司;2,2′-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),阿拉丁试剂有限公司(中国上海);其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME104E型分析天平,梅特勒-托力多仪器(上海)有限公司;GL-21M型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Blue pard培养箱、THZ-100B型恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-2F型超净台,苏州安泰空气技术有限公司;T&J-IntelliFermA/type A型台式玻璃发酵罐,迪必尔生物工程(上海)有限公司;A51119600型酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 山茶籽饼原料预处理

参照文献[1],发酵之前采用有机溶剂对山茶籽饼原料进行脱脂。将山茶籽饼经粉碎处理并过60目筛,过筛的山茶籽饼粉加入正己烷(5 mL/g)室温浸泡6 h,过滤后的残渣用体积分数90%的乙醇在室温超声辅助提取30 min,以去除皂苷和类黄酮等小分子,再次过滤后残渣置通风处晾干,所得脱脂山茶籽饼粉密封后4 ℃保存备用。

1.3.2 发酵菌种活化及山茶籽多肽的发酵菌种筛选

菌种活化及孢子液制备:植物乳杆菌用MRS肉汤培养基于37 ℃培养48 h,活化后转接培养至对数生长期,制成1×108 CFU/mL的种子菌悬液,备用。米曲霉、毛霉接种至PDA平板上于28 ℃培养4～6 d活化,使用无菌水冲洗收集孢子于锥形瓶中,调节孢子浓度至1×108 CFU/mL备用。枯草芽孢杆菌活化后接种至LB培养基于37 ℃培养24 h,调节菌液浓度至1×108 CFU/mL备用。

山茶籽饼粉的摇瓶发酵及菌种筛选:称取0.8 g蔗糖和7 g山茶籽饼粉充分混匀,装入500 mL锥形瓶中并加入200 mL蒸馏水,于121 ℃灭菌20 min。待培养基冷却后将活化好的菌悬液或孢子悬液按15%体积比接种至培养基中,混合均匀后置于摇床以180 r/min进行振荡培养发酵24 h,细菌(植物乳杆菌、芽孢杆菌)培养温度为37 ℃,真菌(米曲霉、毛霉)培养温度为28 ℃,发酵后离心取上清液,采用体外抗氧化活性评价方法评估不同菌种发酵山茶籽多肽的抗氧化活性,筛选抗氧化能力最强的菌株进行后续研究。

1.3.3 基于筛选菌株的山茶籽饼粉摇瓶发酵优化

在1.3.2节的基础上,采用筛选出的菌株进行摇瓶发酵制备山茶籽多肽。将筛选的微生物培养种子液以一定比例接种至无菌发酵培养基,以180 r/min 振荡培养24 h,考察底物浓度、接种量及发酵温度等因素对多肽得率的影响。发酵完成后灭菌,发酵液4 ℃离心弃除菌体及未消化的底物,上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后冷冻干燥即得发酵山茶籽多肽,-20 ℃下保存备用。

1.3.4 山茶籽多肽5 L反应器发酵工艺优化

1.3.4.1 单因素实验设计

在摇瓶发酵条件确定的基础上,利用5 L生物反应器进行实验室规模的初步放大并优化发酵工艺参数。固定底物浓度为60目粉碎的山茶籽饼粉30 g/L和蔗糖4 g/L,在121 ℃灭菌20 min后,接种优化菌株种子液于35.5 ℃条件下进行发酵,考察发酵转速(120、150、180、210、240 r/min)、装液量(30%、40%、50%、60%、70%)、通气量(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 vvm,即1 min通气量为发酵液体积的0.20、0.25、0.30、0.35、0.40倍)和接种量(7%、11%、15%、19%、23%)对山茶籽多肽得率的影响。

1.3.4.2 正交试验设计

山茶籽多肽的5 L反应器发酵采用正交试验法进行工艺参数优化,通过四因素三水平的正交试验考察发酵转速(A)、装液量(B)、通气量(C)和接种量(D)对山茶籽多肽得率的影响,每个因素参考摇瓶发酵的结果选取高、中、低3个水平,以获得山茶籽多肽反应器发酵的优化工艺参数并进行验证。山茶籽多肽5 L反应器发酵正交试验因素与水平见表1。对优化后发酵过程中pH值、溶氧值(DO)、残糖和多肽含量等指标每隔2 h进行一次监测,以获得发酵过程中底物消耗及产物生成的动力学变化。

1.3.5 山茶籽饼粉及其发酵产物成分含量测定

山茶籽饼粉及其发酵产物的总蛋白含量采用Bradford方法测定,使用牛血清白蛋白绘制蛋白含量检测的曲线[13]。总糖含量采用苯酚硫酸法测定,以葡萄糖为对照绘制总糖检测的标准曲线[14]。山茶籽饼粉及其发酵产物中多肽的含量检测参照文献[15-16]报道的方法进行。首先,以四肽标准品Gly-Gly-Tyr-Arg进行山茶籽多肽的含量测定,取1.5 mL不同含量的标准品溶液分别与1 mL双缩脲试剂混合,室温下反应20 min后,在540 nm处记录标准品溶液的吸光度并绘制标准曲线。在山茶籽饼粉发酵产物的多肽含量检测中,取2.5 mL发酵上清液加入等体积质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)水溶液混匀并静置10 min,然后8 000 r/min室温下离心20 min脱除蛋白,离心上清液参照标准曲线测定的方法在540 nm处进行多肽含量的测定。山茶籽饼粉发酵产物的多肽得率按式(1)计算。

w=ρV/m×100%。

(1)

式(1)中,w,单位质量山茶籽饼粉发酵的多肽得率,%;ρ,发酵上清液多肽质量浓度,mg/mL;V,发酵液体积,mL;m,发酵中使用的山茶籽饼粉质量,mg。

1.3.6 山茶籽饼粉发酵前后分子质量分布测定

山茶籽饼粉发酵前后分子质量分布根据Wang等[17]的方法采用HPLC法测定。山茶籽饼粉及其发酵产物经5 000 r/min离心15 min,取离心后的上清液进行分析,样品采用0.45 μm水系膜过滤后进样。色谱条件:采用TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)色谱柱进行分离,柱温为40 ℃,流动相为乙腈/水/三氟乙酸(体积比为45∶55∶0.1),紫外检测器检测波长为220 nm,流动相流速为0.5 mL/min,进样量为10 μL。

1.3.7 山茶籽蛋白及多肽的体外抗氧化活性测定

山茶籽多肽抗氧化活性测定以谷胱甘肽(GSH)为阳性对照,通过体外DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除实验进行评价[18]。DPPH自由基清除实验:不同浓度的山茶籽蛋白及发酵多肽样品溶液与DPPH溶液(0.1 mmol/L)混合,室温下避光反应30 min后,在517 nm测量吸光度并计算清除率。ABTS+自由基清除实验:7 mmol/L的ABTS+溶液用无水乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.02,与不同含量样品溶液避光反应6 min后在734 nm测量吸光度并计算清除率。羟自由基清除实验:将等浓度(3 mmol/L)的FeSO4溶液和水杨酸乙醇溶液加入不同含量的样品溶液中混匀,然后加入等体积的H2O2(3 mmol/L)溶液于37 ℃反应30 min,在510 nm处测定吸光度并计算自由基清除率。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归分析生成剂量反应曲线,计算清除自由基的IC50[19]。

1.3.8 山茶籽蛋白及多肽的透明质酸酶抑制活性测定

透明质酸酶抑制活性的测定采用文献报道方法并适当修改[20]。首先,取样品溶液0.5 mL于A、B试管,超纯水0.5 mL于C、D试管,在A、C试管加入400～1 000 U/mL透明质酸酶溶液0.5 mL,B、D管中加入pH=5.6的醋酸缓冲液0.5 mL,4支管中各加入2.5 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL,于37 ℃反应20 min;然后向A、C试管中加入0.4 mg/mL的透明质酸钠溶液2 mL,B、D试管中加入pH=5.6的醋酸缓冲液2 mL,37 ℃反应40 min后放置室温。4支管中各加入乙酰丙酮溶液1 mL,沸水浴15 min后冷却至室温,向各试管中各加入埃尔利希溶液1 mL并充分振荡,加3 mL无水乙醇稀释并放置30 min显色,在520 nm测定吸光度。透明质酸酶抑制率计算方法见式(2)。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归分析生成剂量反应曲线,计算抑制透明质酸酶活性的IC50[19]。

透明质酸酶抑制率=[1-(ODA-ODB)/(ODC-ODD)]×100%。

(2)

式(2)中,ODA为样品溶液管的吸光度;ODB为空白溶液管的吸光度(缓冲液代替样品溶液);ODC为对照溶液管的吸光度(缓冲液代替酶溶液);ODD为对照空白溶液管的吸光度(缓冲液代替样品溶液及酶溶液)。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次,结果用平均值±标准偏差表示;采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析,采用Origin 2021软件处理实验数据并绘图。

2 结果与分析

2.1 山茶籽饼粉发酵菌种的筛选结果

植物蛋白发酵法生产多肽的关键因素包括微生物菌种、发酵方式和工艺参数等,通常具备GRAS(generally recognized as safe)安全特性的酵母、真菌和细菌是食品发酵中优先使用的菌种[21]。本研究基于不同微生物发酵山茶籽饼粉的多肽得率及抗氧化活性,对6种微生物的多肽发酵性能进行了评估(图1)。由图1可知,6株菌种均可有效地降解蛋白质产生小分子多肽,枯草芽孢杆菌1、枯草芽孢杆菌2及毛霉1发酵样品的多肽得率显著高于其他样品。从发酵产物的多肽含量结果看,选取的菌株都表现出对山茶籽蛋白的显著降解能力,表明这些微生物可以分泌某些特定的蛋白酶对蛋白进行水解。其中,枯草芽孢杆菌1发酵样品的多肽含量显著高于其他菌株,其次为枯草芽孢杆菌2,这可能与文献报道的芽孢杆菌通常具备较强的蛋白酶分泌能力有关[12]。

在抗氧化活性方面,枯草芽孢杆菌1、枯草芽孢杆菌2及米曲霉发酵后山茶籽饼粉样品的DPPH自由基清除率相比对照组(未发酵)显著提高(P<0.05),分别为76.35%、50.60%和59.45%,以枯草芽孢杆菌1的清除率(76.35%)最高。在ABTS+自由基清除实验中,6株菌种发酵后样品清除率均较对照组显著提高(P<0.05),分别为54.90%(植物乳杆菌)、66.25%(米曲霉)、69.25%(毛霉1)、50.20%(毛霉2)、80.55%(枯草芽孢杆菌1)、61.30%(枯草芽孢杆菌2),同样以枯草芽孢杆菌1发酵的样品清除率(80.55%)最高。在羟自由基清除实验中,枯草芽孢杆菌1、2发酵样品的清除率较对照组显著提高(P<0.05),分别为55.10%和61.60%,且高于其他微生物菌株的发酵样品。此外,植物乳杆菌、米曲霉和毛霉发酵样品的羟基自由基清除作用相比对照组无显著变化或降低,说明有些微生物可能消耗基质中的抗氧化活性物质进行生长繁殖,从而导致发酵产物的自由基清除率下降。

不同菌种发酵山茶籽饼粉的结果表明,山茶籽饼粉发酵样品的多肽得率和抗氧化活性因采用的菌种不同而不同(图1)。6株菌种中,枯草芽孢杆菌1发酵样品的多肽得率最高且抗氧化活性提升最显著,因此筛选该菌种用于山茶籽多肽发酵。在前期山茶籽饼粉发酵的研究中,样品发酵前后的分子质量分布存在明显变化,发酵后分子质量小于3 kDa的组分占比升高,说明山茶籽蛋白在发酵过程中可被微生物降解为小分子多肽[22-23]。基于筛选的菌种,根据文献[22]采用了摇瓶发酵的方式对山茶籽饼粉发酵的基本参数进行了单因素实验考察,以多肽得率为指标优化后的发酵条件为山茶籽30 g/L、蔗糖4 g/L、接种量19%、发酵温度35.5 ℃,此条件下多肽得率为11.68%。为考察山茶籽多肽发酵工艺放大的可行性,在后续实验中,以此条件对实验室规模的5 L反应器发酵进行了评估和优化。

2.2 山茶籽多肽5 L反应器发酵优化结果

2.2.1 单因素实验结果

山茶籽多肽5L反应器单因素实验结果见图2。由图2(a)可知,当转速为180 r/min时,多肽得率达到最大值。这可能是因为搅拌速度的增加为菌体生长提供了足够的溶氧,加速了山茶籽蛋白的水解。随着转速继续增加,过快的剪切力会对菌体造成伤害,因此多肽得率呈现下降趋势[24]。由图2(b)可知,随着装液量的增加,多肽得率呈现先上升后下降的趋势。装液量通过影响发酵体系中的溶氧量来影响菌株的生长[24],因此优化装液量为50%。通气量直接影响发酵体系中的溶氧量,由图2(c)可知,当通气量为0.25 vvm时,多肽得率达到最高,继续增加通气量,反应器内氧气充足,菌体生长过快反而不利于山茶籽多肽的积累。由图2(d)可知,随着接种量的增加,多肽得率呈现先升高后下降的趋势。当接种量过低时,反应器内发酵不充分,影响多肽的产生,当接种量过高时,水解所得多肽优先供菌株自身生长发育,导致多肽得率降低[12],因此选择优化接种量为19%。

2.2.2 正交试验结果

枯草芽孢杆菌5 L反应器发酵制备山茶籽多肽的正交试验考察了发酵转速(A)、装液量(B)、通气量(C)和接种量(D)对24 h发酵山茶籽多肽得率的影响,结果见表2。由表2可知,各因素对多肽得率的影响由强到弱依次为A2、A3、A1,B2、B1、B3,C3、C2、C1,D2、D3、D1,极差由大到小依次为RD、RC、RB、RA。因此,接种量为影响多肽得率的主要因素,其次分别为通气量和装液量,转速影响最小,优化后的工艺参数组合为A2B2C3D2,即转速180 r/min、装液量50%、通气量0.30 vvm、接种量19%。在此条件下,3次验证实验测得发酵后多肽平均得率为12.15%。在5 L反应器发酵过程中,蛋白质含量、多肽含量、总糖含量、pH值和溶氧值(DO)随时间的变化如图3。由图3可知,枯草芽孢杆菌在发酵初期生长较为缓慢,DO无显著变化,在6 h后DO逐渐减小,表明菌体生长加快。同时,总糖在发酵过程中作为碳源被菌株消耗而逐渐减少,6 h后消耗速度加快直至发酵结束。作为氮源的山茶籽蛋白变化情况与碳源变化相类似,在发酵6 h后蛋白质消耗加快。山茶籽多肽产物合成方面,随着发酵的进行,蛋白质被降解为小分子多肽,多肽含量逐渐增加,在22 h时达到最高。随着发酵时间继续增加,24 h时的多肽含量呈下降趋势,可能是因为多肽被微生物优先消耗进一步形成氨基酸等产物,因此获得山茶籽多肽的优化发酵时间为22 h。

2.3 山茶籽饼粉发酵产物分子质量分布及其抗氧化活性测定结果

山茶籽饼粉发酵前后分子质量分布及其抗氧化活性分析见图4。由图4(a)可知,未发酵山茶籽蛋白分子质量主要在10 kDa以上;发酵产物分子质量主要在3 kDa以下,占比74.01%,与发酵前相比,低分子质量组分显著增加(P<0.05)。 发酵前后山茶籽饼粉分子质量分布的变化表明,枯草芽孢杆菌发酵过程中大部分的高分子质量蛋白质被降解为小分子肽。这个结果和采用枯草芽孢杆菌发酵豆粕报道的现象类似,该研究观察到低分子质量组分(<3 kDa)在发酵过程中迅速增加并成为最终发酵豆粕的主要产物[25]。由于小分子多肽往往具有较好的生物活性,因此对山茶籽饼粉发酵产物的体外抗氧化活性进行了评价。

生物机体的氧化反应会产生损害细胞的自由基,主要包括活性氮RNS(reactive nitrogen species)和活性氧ROS(reactive oxygen species),因此体外自由基清除实验是筛选抗氧化活性物的一种简便有效的方法[26]。发酵山茶籽多肽对活性氮自由基DPPH自由基的清除率如图4(b)。质量浓度为0.5～2.5 mg/mL时,未发酵的山茶籽蛋白和发酵制备的山茶籽多肽对DPPH自由基清除率随质量浓度的增大而增大。在质量浓度为2.5 mg/mL时,摇瓶发酵山茶籽多肽和5 L反应器发酵山茶籽多肽对DPPH自由基清除率分别达到75.11%和80.61%,显著(P<0.05)高于未发酵山茶籽蛋白的清除率。通过拟合方程计算,摇瓶发酵和反应器发酵山茶籽多肽清除DPPH自由基的IC50分别为1.18、0.72 mg/mL,低于之前报道的采用商业酶酶解制备的山茶籽多肽的IC50(1.33～3.37 mg/mL)[27]。此外,反应器发酵山茶籽多肽的DPPH自由基最高清除率(80.61%)与文献报道混菌发酵制备茶籽多肽的数值接近(85.5%)[11]。近年来,针对植物种籽蛋白制备的多肽的DPPH自由基清除能力研究较多,如酶解制备的西瓜籽多肽清除DPPH自由基的IC50为0.763 mg/mL,其数值高于本研究发酵山茶籽多肽的IC50[28]。由此可见,枯草芽孢杆菌发酵是制备高抗氧化活性山茶籽多肽的有效方法,而且在5 L反应器发酵放大的多肽得率比摇瓶发酵更具优势,因此采用微生物发酵是极具潜力的山茶籽活性肽规模化制备途径。

ABTS+自由基清除实验通常用于评价亲水性和亲脂性化合物的抗氧化活性[29]。由图4(c)可知,发酵山茶籽多肽对ABTS+自由基的清除效果与清除DPPH自由基的趋势一致,其清除率随样品质量浓度增加而上升。相同质量浓度下,摇瓶发酵和5 L反应器发酵山茶籽多肽的ABTS+自由基清除能力无显著差异,但都显著(P<0.05)高于未发酵样品,对应的IC50分别为0.65、0.52 mg/mL,显著(P<0.05)低于未发酵样品的IC50(1.63 mg/mL)。由此说明,经发酵获得的多肽具有更好的ABTS+自由基清除能力。摇瓶发酵和5 L反应器发酵山茶籽多肽的ABTS+自由基清除率在1 mg/mL时分别达到61.85%和67.54%,同等浓度下其清除率高于文献报道的棉籽水解多肽产物[29]。有研究表明,山茶籽蛋白中富含色氨酸,其所含的苯环结构能够为自由基提供质子,减缓自由基的链式反应,山茶籽蛋白经微生物分解后的多肽可能含较多暴露的色氨酸残基,进而形成ABTS+自由基的高清除活力[1,4]。

羟自由基为活性氧自由基,可与生物体内的大多数生物分子发生反应,因此羟自由基清除能力在抗氧化活性评估中至关重要[30]。由图4(d)可知,发酵山茶籽多肽对羟自由基的清除作用表现出剂量相关性,随着质量浓度的增加而上升。未发酵、摇瓶发酵和反应器发酵山茶籽样品的IC50分别为2.71、1.18、0.85 mg/mL,其中反应器发酵山茶籽多肽IC50显著(P<0.05)低于摇瓶发酵,且远低于已报道的混菌发酵茶籽多肽的IC50(3.54 mg/mL)[12]。前期文献报道的蛋白酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶)酶解大豆蛋白结果表明,碱性蛋白酶酶解获得的大豆多肽具有最强的羟基自由基清除活性,其IC50为2.06 mg/mL,高于本研究发酵的山茶籽多肽的IC50[31]。多肽的抗氧化能力主要取决于氨基酸侧链基团和肽序列,例如蛋氨酸和酪氨酸是提高抗氧化肽的活性以及稳定性的重要氨基酸[26]。本研究中,发酵山茶籽多肽表现出优越的抗氧化能力,可能是由于微生物分泌的蛋白肽充分水解山茶籽蛋白,使其暴露更多的生理活性氨基酸,从而具有更多的电子和氢供体并提供更多的自由基反应位点[32]。因此,后续研究需要针对发酵多肽的氨基酸组成及序列进行鉴定以进一步阐明其抗氧化机制。

2.4 山茶籽多肽的透明质酸酶抑制活性分析

透明质酸在调节机体皮肤和组织细胞间各种成分平衡中起重要的缓冲作用,透明质酸酶能够分解体内的透明质酸变成低分子质量寡聚糖,并引起组胺释放,诱导机体产生敏感症状,因此,可通过透明质酸酶抑制剂筛选抗皮肤衰老、抗炎和抗过敏等作用的活性成分[33-34]。透明质酸酶抑制结果见图5,相同质量浓度时,摇瓶和反应器发酵山茶籽样品对酶的抑制作用显著(P<0.05)高于未发酵样品。在2.0～10.0 mg/mL时,2个发酵样品对透明质酸酶的抑制作用随质量浓度增加而上升,当质量浓度为8.0 mg/mL时,摇瓶发酵和反应器发酵山茶籽多肽对酶的抑制率分别达63.12%和67.89%,优于文献报道的鱼皮多肽的抑制作用(56.67%)[35],表明发酵山茶籽多肽具有较好的透明质酸酶抑制能力。在植物种籽蛋白制备的多肽中,小麦和玉米来源的多肽已被报道具有一定的透明质酸酶抑制活性[36]。摇瓶发酵和反应器发酵山茶籽多肽抑制透明质酸酶的IC50分别为4.58、4.17 mg/mL,可见在发酵工艺放大过程中的山茶籽多肽得率及生物活性有增强的趋势。因此,枯草芽孢杆菌CGMCC NO.29154有望成为规模化发酵制备山茶籽活性多肽的优良候选菌种。通过微生物发酵山茶籽饼在开发功能性多肽制备领域具有广阔的应用前景,而且也可为其他食品工业副产物的资源高值化利用提供参考[37]。

3 结 论

研究以山茶籽饼为原料,采用植物乳杆菌、米曲霉、毛霉和枯草芽孢杆菌6株不同菌种,考察了微生物发酵法制备山茶籽多肽的多肽得率及抗氧化活性,筛选出枯草芽孢杆菌CGMCC NO.29154,应用于山茶籽多肽的发酵制备。在摇瓶发酵的基础上,通过正交试验优化了5 L反应器发酵山茶籽多肽的工艺参数。在基质质量浓度为山茶籽饼粉30 g/L和蔗糖4 g/L,发酵转速180 r/min、装液量50%、通气量0.30 vvm和接种量19%的条件下,优化山茶籽多肽得率为12.15%。此外,生物活性评价表明,发酵山茶籽多肽具有较好的体外抗氧化和透明质酸酶抑制活性,而且在5 L反应器发酵放大中,山茶籽多肽的得率和生物活性比摇瓶发酵略有提高。因此,枯草芽孢杆菌CGMCC NO.29154应用于山茶籽多肽规模化生产具有潜在的可行性。本研究旨在为山茶籽多肽的工业化生产提供一定的科学依据,也为后续深入探究发酵山茶籽多肽的结构特征及生物活性作用机制奠定物质基础。

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Fermentation Preparation of Camellia Seed Peptides and Their Antioxidant and Hyaluronidase Inhibitory Activities

HUANG Qingru1, WANG Huatian1, SUN Min1, YUE Heng1, FENG Tao1, TONG Chuanwang2, YAO Lingyun1,*

(1.Faculty of Flavour Fragrance and Cosmetics, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China; 2.School of Food and Biological Engineering, Wuhu Vocational Technical University, Wuhu 241033, China)

Abstract：Camellia seed cake is an underutilized by-product derived from the Camellia oil refining process, which is a rich source of plant proteins that has not yet been fully exploited. In this study, Camellia seed cake was employed as the raw material for the production of Camellia seed peptides through microbial fermentation. The Bacillus subtilis CGMCC NO.29154 strain was identified as the optimum fermentation strain for Camellia seed peptides by evaluating the peptide yield and antioxidant activity of the fermentation products. An orthogonal experiment was conducted to optimize the fermentation parameters of the peptides in a 5 L bioreactor. The results demonstrated that the highest peptide yield of 12.15% was achieved following 22 h of fermentation at a substrate concentration of 30 g/L Camellia seed cake powder (60 mesh), 4 g/L sucrose, a fermentation rotational speed of 180 r/min, a liquid loading rate of 50%, an aeration volume of 0.30 vvm (the aeration rate for 1 min was 0.30 times the volume of the fermentation broth), and an inoculum volume of 19%. Furthermore, the fermented Camellia seed peptides demonstrated notable antioxidant and hyaluronidase inhibitory activities. The IC50 values for DPPH, ABTS+ and hydroxyl radical scavenging were 1.18, 0.65 and 1.18 mg/mL for shake flask culture and 0.72, 0.52 and 0.85 mg/mL for bioreactor culture, respectively. The IC50 values for hyaluronidase inhibition were 4.58 mg/mL for shake flask culture and 4.17 mg/mL for bioreactor culture. All of these values were significantly (P<0.05) superior to those of unfermented Camellia seed cake. The present study indicated that Bacillus subtilis CGMCC NO.29154 had good application potential for preparing bioactive peptides from fermented Camellia seed cake. Further optimization of the fermentation process, including scale-up, could enhance the yield and quality of these peptides, which could in turn lay a scientific foundation for the high-value utilization of Camellia seed cake and the industrial production of Camellia seed peptides.

Keywords：Camellia seed; bioactive peptides; Bacillus subtilis; antioxidant activity; hyaluronidase inhibitory activity

中图分类号：TS210.9

文献标志码：A

收稿日期：2024-12-25

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32102123)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China(32102123).

第一作者：黄情茹,女,硕士研究生,研究方向为食源性生物活性肽。

*通信作者：姚凌云,男,副教授,博士,主要从事天然产物资源生物炼制方面的研究。

doi：10.12301/spxb202400811

文章编号：2095-6002(2026)01-0082-11

引用格式：黄情茹,王化田,孙敏,等.山茶籽多肽的发酵制备及其抗氧化和透明质酸酶抑制活性[J]. 食品科学技术学报,2026,44(1):82-92. HUANG Qingru, WANG Huatian, SUN Min, et al. Fermentation preparation of Camellia seed peptides and their antioxidant and hyaluronidase inhibitory activities[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(1):82-92.

(责任编辑：张逸群)