黑芥子酶(myrosinase, EC 3.2.1.147),又称硫苷水解酶,能够催化硫代葡萄糖苷水解生成葡萄糖和糖苷配基,而结构不稳定的糖苷配基在特定环境中,会自发经过洛森重排反应生成异硫氰酸盐等物质[1]。黑芥子酶主要存在于十字花科植物中[2],同时在以十字花科植物为食的蚜虫、细菌和真菌中相继被发现[3-4]。黑芥子酶通常以同工酶的形式存在,分子质量在45～150 kDa,最适pH值为4.0～9.0,最适温度为30～70 ℃[5-6]。该酶作为一种生物催化剂,在食品、饲料和医药等领域具有重要的应用价值。例如,候海亮等[7]发现,添加西蓝花黑芥子酶能够使菜品恢复原有的风味,可以解决部分蔬菜的风味损失问题。丁艳等[8]发现,油菜籽来源的黑芥子酶是降解油菜籽饼粕的最好酶源,其降解产物中的腈类、恶唑类有害物质最少。解帼轩等[9]利用白芥种子提取的黑芥子酶催化恰玛古水解,其酶解产物恰玛古异硫氰酸酯不仅能够抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,还可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗癌作用。

黑芥子酶以植物提取为主,但由于重金属离子干扰、氧化还原环境失衡和植物基质复杂等原因,提取较为困难[1]。采用异源表达的方法生产黑芥子酶具有重要意义。迄今,已有多种黑芥子酶在不同宿主中实现了异源表达。Chen等[10]首次将甘蓝型油菜黑芥子酶MYR1在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达,其最适pH值为6.0～7.0,最适温度在36～60 ℃。Härtel等[11]将MYR1在毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115中表达,纯化后酶活力为175 U/mg。Rosenbergová等[12]将拟南芥黑芥子酶TGG1在K. phaffii中表达,高密度发酵后测得酶活力为27 U/mL,最适pH值和温度分别为7.0和45 ℃。Wang等[13]将拉恩氏菌(Rahnella inusitata)黑芥子酶Rmyr在大肠杆菌中表达,酶活为12.73 U/mg,最适pH值和温度分别为7.0和40 ℃。与植物来源的黑芥酶相比,微生物来源的黑芥酶酶活相对较高,但其胞外表达尚未见相关研究。例如:Cebeci等[14]将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)黑芥子酶Cmyr在大肠杆菌中表达,酶活达到47.31 U/mg,但研究只分析了酶的基本酶学性质,未对该酶的胞外表达和催化应用进行研究。大肠杆菌为胞内表达,工业应用不便。因此,进一步对该酶进行胞外表达并提高其表达水平具有重要意义。

萝卜红色素是一种从红心萝卜中提取的天然色素,主要成分为葡萄糖苷衍生物[15]。由于萝卜红色素能够迅速且均匀地分散于食品基质中,赋予产品鲜艳且稳定的色泽,因此常作为食品着色剂应用于食品工业[11]。在制备萝卜红色素时,部分萝卜硫苷会被内源黑芥子酶水解,形成有异味的含硫化合物[16]。在储存萝卜红色素时,残存的萝卜硫苷在高温、酸性和碱性条件下发生降解,产生“返味”现象,且储存时间越久,“返味”越严重。异味的存在降低了产品品质,严重制约了萝卜红色素在食品工业中的应用[17]。目前,去除萝卜红色素异味的方法主要有水蒸气蒸馏法、膜分离法、超临界CO2萃取等方法,但这些方法面临着能耗大、生产成本高等问题[16]。经过处理后的萝卜红色素中仍可能残留少量萝卜硫苷,在储存过程中逐渐降解,产生硫化物等挥发性物质,继续“返味”[18]。传统的酶法脱除萝卜红色素异味以淀粉酶,果胶酶和纤维素酶为主,但此类酶不是专一性酶,不能从根本上脱除异味[16]。关于黑芥子酶脱除萝卜红色素异味的研究尚未见报道。在色素提取过程中如果加入外源性黑芥子酶,则能完全水解萝卜硫苷,避免后期出现“返味”现象。因此,发掘酶学性质优良的黑芥子酶可以为工业化脱除萝卜红色素异味提供更多的选择。

本研究拟从Citrobacter sp.中克隆黑芥子酶基因Cmyr,在K. phaffii GS115中分泌表达。进一步研究其酶学性质和对萝卜红色素异味的脱除作用,希望为黑芥子酶在萝卜红色素异味的脱除应用中提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.) (CICC 21596),中国工业微生物菌种保藏管理中心;红心萝卜、萝卜红色素E60,河南中大恒源生物科技股份有限公司;K. phaffii GS115菌株,美国Invitrogen公司;pPICPK质粒(P0214),武汉淼灵生物科技有限公司。

黑芥子硫苷酸钾水合物(Sinigrin),德国Sigma-Aldrich公司;3,5-二硝基水杨酸、痕盐(PTM1),上海源叶生物科技有限公司,实验所用试剂均为分析纯。

培养基配方。发酵基础盐(BSM)培养基1 L:K2SO4 27.3 g、CaSO4·2H2O 1.0 g、(NH4)2SO4 11.1 g、MgSO4·7H2O 16.6 g、甘油40 g,质量分数为85%的磷酸12 mL。缓冲甲醇复合(BMMY)培养基1 L:酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、甲醇5 g、生物素 4×10-4 g,1 mol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH值为6.0)100 mL。缓冲甘油(BMGY)培养基1 L:酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、甘油10 g、生物素 4×10-4 g,1 mol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH值为6.0)100 mL。酵母浸出粉胨(YPD)培养基 1 L:酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g,固体培养基加入20 g琼脂粉。最小葡萄糖(MD)培养基:葡萄糖20 g、YNB 3.4 g,固体培养基加入20 g琼脂粉。

1.2 仪器与设备

3-18KS型高速冷冻离心机,德国Sigma公司;MicroPulser型电穿孔仪、MyCycler型PCR扩增仪,美国Bio-Rad公司;BLBIO-XGL型5 L玻璃生物反应器,百仑生物科技(江苏)有限公司;TU-1950型双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柠檬酸杆菌黑芥子酶Cmyr的序列分析

利用在线软件ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析基因编码的氨基酸、蛋白质的分子质量及等电点等;使用在线软件Alpha Fold3(https://alphafoldserver.com/)对蛋白质进行三级结构预测;使用ClustalX 1.83软件进行多序列比对分析,并利用在线软件(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)制作序列比对图。

1.3.2 柠檬酸杆菌黑芥子酶基因克隆和表达

以黑芥子酶Cmyr(GeneBank: ALM58466.1)为目的基因,通过SignalP 4.1预测其相应的信号肽序列。使用软件DNAMEN确定其限制性酶切位点SnaB I和Not I;使用软件Primer Premier 5.0设计引物。以Citrobacter sp.基因组DNA(细菌基因组DNA提取试剂盒提取)为模板,利用上游引物Cmyr-F:AGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAAGTATT CAGAGTGCTCAGCAACCC和下游引物Cmyr-R:TGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTCAGCGTG TCAGTCCGAATCC扩增去除信号肽(1-24 aa)的黑芥子酶基因Cmyr。PCR反应体系(50 μL):10×TransStart Fast Pfu Buffer 5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL,Cmyr-F和Cmyr-R各1 μL,模板DNA 1 μL,Fast Pfu DNA聚合酶1 μL,补足蒸馏水至50 μL。PCR扩增条件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,34个循环,72 ℃ 10 min。PCR产物胶回收后,通过无缝克隆连接至pPIC9K质粒,构建重组质粒pPIC9K-Cmyr,并转化至大肠杆菌DH5α菌株中,筛选阳性转化子并验证。pPIC9K质粒中含有醇氧化酶AOX1启动子,是甲醇诱导的强启动子,在K. phaffii表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用[19]。

阳性转化子接种于LB液体培养基中,37 ℃和220 r/min条件下振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pPIC9K-Cmyr。Sal I线性化重组质粒,并醇沉回收。毕赤酵母(80 μL)感受态细胞与线性化的pPIC9K-Cmyr(约10 μg)充分混合后,转移至电转杯(0.2 cm)中冰浴5 min。电击转化(电压1.5 kV,电阻200 Ω,电容25 μF,电击时间4～10 ms)至毕赤酵母GS115感受态细胞,立即加入冰预冷的1 mol/L山梨醇溶液(1 mL),即得重组菌株。收集重组菌株,涂布在MD平板上。 30 ℃ 培养3～5 d后,收集所有菌株,均匀涂布在含有不同质量浓度(100、300、500、1 000 μg/mL)遗传霉素的YPD固体培养基上,30 ℃培养3～5 d,直至长出菌落。

筛选获得的重组毕赤酵母工程菌株,接种至BMGY培养基中,30 ℃振荡培养48 h,按照体积分数5%的接种量转接至BMMY培养基中。30 ℃继续诱导培养5 d,每24 h补加甲醇1次,使其终体积分数为0.5%。分别在每次加甲醇之前取样,测定培养上清液的黑芥子酶活性。

1.3.3 毕赤酵母高密度发酵产Cmyr与纯化

选择摇瓶发酵产酶水平最高的菌株,接种至150 mL YPD培养基中,30 ℃和200 r/min条件下培养至OD600为10.0左右。基础培养:将种子液按照体积分数为10%的接种量接种到5 L发酵罐中(装有1.5 L BSM培养基),采用体积分数为28%的浓氨水调节溶液pH值为5.0,加入体积分数为4.35×10-3的痕盐溶液(PTM1),转速600 r/min,温度30 ℃。甘油流加:待BSM培养基中的甘油消耗完全,采用间歇式流加方式补料,补料培养基为质量分数为50%的甘油。控制发酵液的温度为30 ℃和pH值为5.0,全程监控溶氧(DO)并保持发酵罐中的溶氧值大于15%,流加时间为8～10 h。待菌体湿重达到200～250 g/L,停止流加甘油,并维持3 h左右。甲醇诱导:流加100%甲醇诱导,转速调节至800 r/min,监控溶氧大于15%,控制温度为30 ℃和pH值为6.0,直至发酵结束。发酵过程中取样测定菌体湿重、蛋白含量和酶活力。

将高密度发酵获得的发酵液离心(10 000 r/min,5 min,4 ℃),收集上清液。取50 mL上清液置于Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L,pH值为7.0)中透析过夜,透析结束后离心(10 000 r/min,5 min),获得粗酶液。用缓冲液A(Tris-HCl,20 mmol/L,pH值为7.0)平衡Q-Sepharose阴离子交换层析柱5～10个柱体积,收集的酶液以0.5 mL/min流速上样,用缓冲液A与缓冲液B(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl, pH值为7.0)线性洗脱至OD280<0.1,收集具有黑芥子酶活力的组分,透析得到纯化后表达产物,采用SDS-PAGE检验其纯度。

1.3.4 黑芥子酶活力和蛋白浓度测定

参考Wang等[20]的方法进行黑芥子酶活力测定。取350 μL Sinigrin底物(2 mg/mL)置于离心管中预热,加入50 μL适当稀释的酶液,于35 ℃反应10 min,最后加入600 μL DNS,沸水浴10 min,冷却后在540 nm处测定反应液中还原糖含量。酶活力单位定义:在pH值为7.0和温度为35 ℃条件下,每分钟水解Sinigrin生成1 μmol葡萄糖所需的酶量,为一个酶活力单位(μmol/min)。

按文献[21]的方法测定蛋白浓度,以牛血清蛋白为标准蛋白质制作标准曲线。

1.3.5 萝卜红色素色价测定

按照GB 25536—2010《食品添加剂 萝卜红》中方法测定萝卜红色素的色价。准确称取0.2 g萝卜红色素样品,用pH值为3.0的柠檬酸盐缓冲液定容至100 mL,并混匀。取此试样液置于1 cm比色皿中,以柠檬酸盐缓冲液做空白对照,用分光光度计测定波长为(514±5) nm的吸光度值。计算方法如式(1)。

(1)

式(1)中,为试样质量分数为1%,用1 cm比色皿,在最大吸收波长(514±5) nm处测得的色价;A为实际测定试样液的吸光度;ρ为被测试样液的质量浓度,g/mL。

总色价计算方法如式(2)。

E总

(2)

式(2)中,E总为萝卜色素样品的总色价;m为萝卜色素样品的总质量,g。

1.3.6 Cmyr的酶学性质测定

1.3.6.1 最适pH值测定

在不同pH值缓冲体系下,按照1.3.4方法测定Cmyr的酶活力,以最高酶活力为100%,分别计算不同pH值下的相对酶活力。所用缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液(pH值为3.0～6.0)、磷酸盐缓冲液(pH值为6.0～8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH值为7.0～9.0)、2-环己胺基乙磺酸缓冲液(pH值为9.0～10.5)、甘氨酸-氢氧化钠(pH值为10.0～11.0)。

1.3.6.2 酸碱稳定性测定

将酶液分别用缓冲液稀释至适宜浓度,于40 ℃孵育30 min后,立即冰水浴30 min,在最适条件下测定残余酶活力,以未经处理的酶液作为对照。

1.3.6.3 最适温度测定

在25～60 ℃条件下按照1.3.4方法测定Cmyr的酶活力,以最高酶活力为100%,分别计算各温度下的相对酶活力。

1.3.6.4 热稳定性测定

用Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L,pH值为7.0)稀释酶液至适宜浓度,在25～60 ℃内孵育30 min后,立即冰水浴30 min,在最适条件下测定残余酶活力,以未经处理的酶液作为对照。

1.3.7 Cmyr脱除萝卜红色素异味验证实验

1.3.7.1 验证实验

选取3 kg品质优良的红心萝卜,洗净后切成1 cm左右的丁状。加入3 kg pH值为3.0的柠檬酸水溶液,用破壁机制成萝卜匀浆液。在匀浆液里加入黑芥子酶进行酶解反应,反应结束后,加入6 kg pH值为3.0的柠檬酸水溶液,室温条件下浸泡2 h。使用板框将萝卜溶液过滤至澄清,澄清的萝卜红色素溶液泵入LX-T28大孔树脂吸附柱,流速为1 L/h。保持流速不变,依次用pH值为3.0柠檬酸水溶液、质量分数为30%和80%的乙醇分阶段洗脱,并收集过滤后的流出液,检测色价。将质量分数为30%乙醇洗脱的流出液用超滤膜浓缩过滤。滤液用泵送入真空蒸发器浓缩,控制温度,待萝卜红色素液浓缩至原体积的1/10时停止。浓缩液进行喷雾干燥,进口温度为190 ℃,出口温度为90 ℃。

酶解条件优化:在萝卜匀浆液中加入黑芥子酶,以味觉评价得分为标准,依次对黑芥子酶添加量(0.1～0.5 U/g)、反应温度(25～60 ℃)、反应pH值(4.0～9.0)和酶解时间(3～10 h)进行优化。确定最适单因素条件后,组合优化反应条件,确定最适酶解条件。

1.3.7.2 萝卜红色素味觉评价方法

在最适酶解条件下得到的萝卜红色素,于55 ℃烘箱中放置30 d,每隔7 d取出一部分配制成质量分数为3%的萝卜红色素溶液,进行味觉评价。

萝卜红色素的味觉评价参考文献[16]的方法。由13名经过培训的专业人员组成评估小组,以萝卜红色素的萝卜味、酸味和异味作为评估指标,设定4个等级,每项指标满分10分,以平均分为最终结果。具体评分标准如表1所示。

2 结果与分析

2.1 Cmyr基因克隆和表达结果分析

黑芥子酶Cmyr基因的克隆与表达结果见图1。

以Citrobacter sp.基因组DNA为模板,通过特异性引物Cmyr-F和Cmyr-R成功扩增Cmyr基因序列,得到长度为1 902 bp的片段[图1(a)]。扩增后的序列通过无缝克隆连接至pPIC9K质粒,得到重组载体pPIC9K-Cmyr[图1(b)],并通过菌落PCR验证阳性转化子[图1(c)]。经Sal I线性化后的重组质粒转化至毕赤酵母GS115中,通过转化子筛选,高产菌株摇瓶发酵酶活最高为16 U/mL。

Cmyr基因序列全长1 974 bp,编码657个氨基酸,N端含有一个长度为24个氨基酸的信号肽。Cmyr的预测分子质量为69.27 kDa,等电点为5.89。Cmyr的蛋白结构预测与蛋白多重序列比对,分析结果见图2。由图2(a)可知,该酶由24个α螺旋和13个β折叠组成,整体呈现新月形结构。由图2(b)可知,大多数植物来源的芥子酶属于GH1家族,其中谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)分别作为亲核氨基酸和质子供体发挥作用[13];而柠檬酸杆菌黑芥子酶Cmyr属于GH3家族,含有一段保守的活性氨基酸序列SDW,其中天冬氨酸是一种亲核氨基酸[13]。

2.2 Cmyr高密度发酵与纯化分析

Cmyr重组菌株的高密度发酵结果见图3。由图3(a)可知,发酵132 h后发酵液中酶活力最高达到433.2 U/mL,蛋白质质量浓度和细胞的质量浓度分别为6.8 mg/mL和420 mg/mL。由图3(b)可知,随着发酵时间的延长,SDS-PAGE电泳中的目标条带逐渐变粗,发酵液中的蛋白含量逐渐增加。经 Q-Sepharose 阴离子交换层析柱进一步纯化,得到电泳级纯酶[图3(c)],分子质量70 kDa左右,与预测分子质量相近。重组黑芥子酶Cmyr的纯化结果见表2。表2显示,该酶的回收率为58.6%,纯化倍数为1.5倍,比酶活为146 U/mg。

a表示酶活力的测定是在20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH值为7.0)中,以2 mg/mL黑芥子硫苷酸钾水合物(Sinigrin)为底物,40 ℃反应10 min;b表示蛋白质含量用Lorry法[21]测定,以牛血清蛋白为标准。

迄今为止,植物源提取的黑芥子酶研究较多,但提取率低,纯化困难,异源表达是提高该酶产量的有效手段之一[1]。目前已报道的异源表达策略所得酶活力虽有所提高,但仍然较低。拟南芥黑芥子酶ATGG1在K. phaffii中表达,高密度发酵164 h后,酶活力为27 U/mL[12]。甘蓝蚜虫来源的黑芥子酶BMYR在K. phaffii中表达,甲醇诱导120 h后,酶活力仅为0.64 U/mL[1]。拟南芥黑芥子酶AtTGG4在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达,高密度发酵108 h后,酶活力为44.84 U/g(细胞干重)[20]。酶活的低水平表达,限制了其在工业上的应用。本研究利用K. phaffii表达Cmyr,比酶活为146 U/mg,大大高于R. inusitata来源的Rmyr(最高酶活为12.73 U/mg)[13]和波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)来源的Myr-37(最高酶活为6.95 U/mg)[22]。本研究中重组菌株发酵产胞外酶活为433.2 U/mL,为目前已报道最高的黑芥子酶活力,高水平的表达,可为后续脱除萝卜红色素异味奠定基础。

2.3 Cmyr的酶学性质分析

Cmyr的酶学性质研究结果见图4。由图4(a)和图4(b)可知,Cmyr在20 mmol/L Tris-HCl,pH值为7.0的缓冲液下酶活力最高,在pH值为6.0～8.0的缓冲液中处理30 min后仍能保持80%以上残余酶活力。由图4(c)和图4(d)可知,Cmyr的最适温度为35 ℃,在40 ℃以下处理30 min后仍能保持80%以上残余酶活力。

大多数黑芥子酶的最适温度为30～50 ℃,在中性或者偏酸性条件下酶活力更高[23],如A. thaliana来源黑芥子酶(最适pH值为5.0)[12]和食油甲单胞菌(Pseudomonas oleovorans)来源的黑芥子酶(最适pH值为7.0)[24]。E. coli表达的Cmyr最适温度和pH值分别为25 ℃和6.0[14],而K. phaffii表达的Cmyr最适温度和pH值分别为35 ℃和7.0,这可能是由于Cmyr在K. phaffii表达系统中翻译后进行了修饰。K. phaffii表达系统具有独特的蛋白合成途径和蛋白翻译修饰功能,能够使复杂蛋白正确折叠,从而影响酶的性质[25]。类似的现象在木聚糖酶[26]、β-葡萄糖苷酶[27]和β-甘露聚糖酶[28]中均有发现。E. coli表达的Cmyr在40 ℃仅保持20%的活性[14],而K. phaffii表达的Cmyr在40 ℃以下保持80%以上的活性。K. phaffii表达的Cmyr热稳定性有明显提高,有助于Cmyr脱除萝卜红色素异味。

2.4 Cmyr对萝卜红色素异味的脱除效果分析

2.4.1 Cmyr脱除萝卜红色素异味的条件优化

异味脱除实验以味觉评价得分为指标,考察了Cmyr对萝卜红色素异味脱除效果,结果见图5。由图5可知,Cmyr脱除萝卜红色素异味最适条件:酶添加量为0.3 U/g(以萝卜湿重计),最适反应pH值为6.0,反应温度和时间分别为40 ℃和8 h。

2.4.2 储存时间对萝卜红色素异味脱除效果影响分析

储存时间对萝卜红色素异味脱除效果影响分析结果见图6。由图6可知,随着储存时间的延长,各分组的味觉评价分有所波动,对照组和市售色素E60组下降趋势较大,但实验组变化不大,且在21 d达到稳定,30 d后无明显“返味”现象产生。萝卜红色素提取过程中的色价变化结果见表3。表3显示,实验组和对照组的色价在提取过程中未有明显变化。本研究结果表明,Cmyr具有脱除萝卜红色素异味的潜力。

萝卜红色素异味脱除是萝卜红色素加工再利用的关键。吴凤池[29]通过双水相萃取结合树脂吸附脱除萝卜红色素异味,异硫氰酸酯的脱除率高达94%。Gao等[30]通过添加壳聚糖处理萝卜红色素提取物,气味物质减少了70%。这些方法以钝酶(失活内源性黑芥子酶)和去除异硫氰酸酯为主,而异味的源头萝卜硫苷仍大量存在,在后期储藏时依然会出现“返味”问题。阳晖等[16]使用4株真菌,在接种量2%,30 ℃和pH值为5.0条件下发酵60 h后,能够有效脱除萝卜红色素异味。与文献[16]以及文献[29-30]方法相比,Cmyr可以直接催化萝卜硫苷,显著降低其含量,从根本上解决后期可能出现的“返味”问题。同时,本研究制备的黑芥子酶具有酶用量少和作用时间短等优势,可高效、快速地脱除萝卜红色素异味,说明该酶具有工业化应用潜力。

3 结 论

从Citrobacter sp.中克隆了一个黑芥子酶基因(Cmyr),在K. phaffii中实现分泌表达,经5 L发酵罐高密度发酵后测得酶活力为433.2 U/mL,与已报道的黑芥子酶相比,该酶的酶活力是最高的。Cmyr最适反应温度为35 ℃,最适pH值为7.0,在pH值为6.0～8.0和40 ℃以下温度条件下保持稳定。与E. coli表达的Cmyr相比,K. phaffii表达的Cmyr具有较高的温度特性,更有利于萝卜红色素异味的脱除。与其他脱除萝卜红色素异味的方法相比,Cmyr直接作用于异味的前体物质萝卜硫苷,即可从根本上解决后期的“返味”问题。Cmyr对萝卜红色素异味的脱除效果分析表明,Cmyr能够高效且快速脱除萝卜红色素异味,具有工业化应用潜力。本研究旨在为黑芥子酶的开发和黑芥子酶对萝卜红色素异味的脱除应用提供理论基础。

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High Level Expression of Myrosinase from Citrobacter sp. and Its Application in Removing Off-Flavor from Radish Red Pigment

LÜ Ang1, WANG Sanying2, YANG Shaoqing1, PAN Tianyi2, JIANG Zhengqiang1,3,*, JIN Ziheng2

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Henan Zhongda Hengyuan Biotechnology Stock Co., Ltd., Luohe 450007, China; 3. Food Laboratory of Zhongyuan, Luohe 450007, China)

Abstract：“Off-flavor” from radish red pigment has severely restricted its applications in food industry. In this study, the myrosinase gene (Cmyr) from Citrobacter sp. was cloned and expressed in Komagataella phaffii GS115. The purified enzyme was characterized and used for removing the “off-flavor” from radish red pigment. The transformant was incubated in a 5 L fermenter for high cell density fermentation (132 h), and produced extracellular myrosinase enzyme activity of 433.2 U/mL and protein concentration of 6.8 mg/mL. The recombinant enzyme was purified through Q-Sepharose anion exchange chromatography column to obtain the electrophpresis-grade pure enzyme. SDS-PAGE showed that the molecular weight of purified enzyme was about 70 kDa. After purification, the optimal pH and temperature of recombinant myrosinase (Cmyr) were pH 7.0 and 35 ℃, respectively. The enzyme was stable up to 40 ℃ and within pH 6.0-8.0. It showed the highest specific activity (146 U/mg) towards sinigrin. CmyR was used to remove the off-flavor from radish red pigment and effectively reduced “off-flavor” from radish red pigment at 0.3 U/g (wet weight of radish), pH 6.0, and 40 ℃ for 8 h. Compared with other radish red pigments, there was no significant “off-flavor” reversion in radish red pigment treated with Cmyr, after storage at 55 ℃ for 30 d. Therefore, Cmyr has great potential for application in removing the off-flavor from radish red pigment.

Keywords：Citrobacter sp.; myrosinase; radish red pigment; off-flavor reversion; off-flavor removal

中图分类号：TS201.3; Q814.1

文献标志码：A

收稿日期：2025-03-28

基金项目：国家重点研发计划项目(2022YFD2101400)。

Foundation: National Key Research and Development Program of China (2022YFD2101400).

第一作者：吕 昂,男,博士研究生,研究方向为食品生物技术。

*通信作者：江正强,男,教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

doi：10.12301/spxb202500176

文章编号：2095-6002(2026)01-0032-10

引用格式：吕昂,王三营,杨绍青,等. 柠檬酸杆菌黑芥子酶的高效表达及其对萝卜红色素异味的脱除作用[J]. 食品科学技术学报,2026,44(1):32-41. LÜ Ang, WANG Sanying, YANG Shaoqing, et al. High level expression of myrosinase from Citrobacter sp. and its application in removing the off-flavor from radish red pigment[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(1):32-41.

(责任编辑：叶红波)