DOI:10.12301/spxb202500363
中图分类号:TS235.1
施晓丹, 王妍, 项发晖, 赖谱富
| 【作者机构】 | 福建省农产品质量安全重点实验室/福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所; 江西师范大学药学院/天然与仿生药物江西省重点实验室; 福建省农业科学院农产品加工研究所/国家食用菌加工技术研发分中心 |
| 【分 类 号】 | TS235.1 |
| 【基 金】 | 江西省自然科学基金项目(20242BAB20325) 福建省农产品质量安全重点实验室开放基金项目(APQSKF202204)。 |
近年来,非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSPs)被广泛用于天然淀粉理化性能和营养特性的改善[1]。NSPs可通过氢键、静电作用或物理屏障效应显著调控淀粉的结构与功能特性,且分子质量、分支度及电荷性质是决定NSPs与淀粉分子发生相互作用的关键结构因素[2]。其中,分子质量决定了NSPs对淀粉糊化、凝胶、消化等特性的修饰效果,可精准适配食品质地与稳定性需求,为低GI功能食品开发和加工工艺优化提供依据。如Wang等[3]研究发现,高分子质量、窄分布且强酶抑制活性的小米米糠多糖更容易通过增强小米淀粉凝胶网络稳定性、形成片层结构等降低小米淀粉的消化率。Zhang等[4]也发现,高分子质量果胶比低分子质量果胶更容易降低玉米淀粉糊峰值、回生及最终黏度、冻融析水率及凝胶硬度,减少回生结晶度并提升慢消化淀粉和抗性淀粉比例。Li等[5]探讨了不同分子质量魔芋葡甘露聚糖(KGM)对甘薯淀粉(SPS)理化和消化特性的影响。结果发现,高分子质量KGM可显著增强SPS糊化黏度峰值、更大程度抑制糊化进程、改善复合凝胶黏弹性并形成更致密稳定结构。同时,随着KGM分子质量升高,抗性淀粉含量增加,对SPS消化率的抑制作用增强且相对结晶度降低。Gong等[6]考察了不同分子质量洋车前子多糖(PP)对大米淀粉(RS)的影响,发现高分子质量PP因更强的分子间相互作用形成结构屏障,抑制消化及血糖反应的效果最显著,且分子质量越低抑制作用越弱,证实了分子质量对NSPs-淀粉体系消化调控的关键作用。
燕麦淀粉是燕麦主要成分之一,其中直链淀粉占总淀粉质量的10.6%~24.5%,比其他淀粉更易糊化[7]。研究表明,蛋白质(乳清蛋白、酪蛋白酸盐等)、多糖(β-葡聚糖等)及脂质的添加可显著改善燕麦淀粉的功能特性[8]。如Tang等[8]报道了去除裸燕麦粉中非淀粉成分(蛋白质、脂质和β-葡聚糖)会增加燕麦淀粉的快速消化淀粉、降低抗性淀粉并升高预估血糖指数,表明非淀粉成分是裸燕麦呈现低消化率的关键因素。Nguyen等[9]、Ma等[10]研究发现,β-葡聚糖通过氢键和疏水作用与燕麦淀粉形成复合物,干扰淀粉短程有序结构和结晶构型。β-葡聚糖可提高燕麦淀粉糊化温度和峰值黏度,降低崩解值,增强热稳定性,其高黏度特性(溶液黏度提高2~3倍)限制淀粉颗粒溶胀(溶胀度降低30%)。目前,不同化学组成和分子质量等复杂结构的NSPs对燕麦淀粉的作用效果未见报道。
银耳是我国传统药食用真菌,具有滋阴润肺、开胃健脾的功效。多糖是银耳的主要营养成分,化学结构复杂,具有抗氧化、降血脂、抑菌和调节肠道菌群等多种生物活性[11]。课题组前期采用冷水、热水、稀碱溶液和稀酸溶液依次从干燥银耳子实体中提取了4个多糖样品,并命名为CWE(cold water extract)、HWE(hot water extract)、ALE(alkaline extract)和ACE(acidic extract)[12],其中ALE和ACE的得率分别为14.7%和10.1%,远高于CWE(1.3%)和HWE(5.3%)。液相色谱分析发现,CWE的分子质量分布曲线有两个主要的洗脱峰,其余组分则主要是一个分布较为均匀的洗脱峰。HWE、ALE和ACE的重均分子质量依次为18 800、3 570、37.4 kDa。流变学测试结果显示,1%质量分数的CWE和ACE的黏度较低,呈现流体性质,而HWE和ALE的表观黏度较为接近[12]。综合考虑样品得率、纯度和流变性质,本研究拟以分子质量相差较大的ALE和ACE为研究对象,研究2种银耳多糖对燕麦淀粉的结构特征、热力学特性和流变特性的影响,旨在补充更多NSPs与燕麦淀粉相互作用的基础数据,以期为银耳多糖在淀粉基食品中的应用提供依据。
银耳,富昌品牌,市售,产地福建古田。燕麦为黑龙江省哈尔滨市当地农产品。土豆直链淀粉标准品,上海麦克林生化技术有限公司;其他试剂为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
Nova Nano SEM 230型场发射扫描电子显微镜,捷克Fei Czech Republic S.R.O.公司;Nicolet is50型红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技有限公司;DSC214型差示扫描量热仪,德国耐驰仪器制造有限公司;MCR302型旋转流变仪,奥地利安东帕有限公司;UV-1100型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;LGJ-12型真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司。
1.3.1 不同分子质量银耳多糖的制备
ALE和ACE的制备参考Shi等[12]的方法。称取200 g银耳粉,用无水乙醚浸泡脱脂,然后依次采用室温水浸提法和热水提取法提取水溶性银耳多糖。热水提取后的过滤残渣用清水冲洗数次后冻干备用。称取30 g冻干后的银耳水提残渣,以料液比为1∶60(g/mL)的0.5 mol/L NaOH溶液作为提取剂,4 ℃提取约3 h,用6 mol/L盐酸将提取液pH值调至中性,离心收集提取液。重复提取一次,合并提取液并浓缩,加入3倍体积无水乙醇沉淀过夜。纱布过滤收集沉淀、加水复溶、透析、冻干获得ALE。碱液提取后的残渣用1.8 L稀盐酸溶液(pH值为2)在100 ℃进行2次提取,每次提取2 h。提取液经浓缩、醇沉、透析和冻干等操作后获得ACE。
1.3.2 银耳多糖与燕麦淀粉复配物的制备
燕麦淀粉的制备参考Shi等[13]的方法。燕麦淀粉的提取工艺是将燕麦米粉碎,先用乙醚脱脂,然后以液料比(mL/g)10∶1 、pH值为10的氢氧化钠溶液进行提取,提取时间2 h,提取温度35 ℃。提取液离心后收集白色淀粉层,用蒸馏水洗涤3~5次,离心收集沉淀,40 ℃烘干即为燕麦淀粉。
称取0、100、200、300、400 mg ALE和ACE,分别加入50 mL离心管中,用移液管量取25 mL蒸馏水加入离心管后置于60 ℃水浴中磁力搅拌使其充分溶解。将多糖溶液转移到250 mL样品瓶中,然后加入2 g燕麦淀粉,再加入75 mL蒸馏水,磁力搅拌10 min左右使其充分混匀。将混悬液置于90 ℃加热30 min至样品完全糊化,冷却至室温后,将复配物冻干。所得样品命名为GOS、GOS-5%ACE、GOS-10%ACE、GOS-15%ACE、GOS-20%ACE、GOS-5%ALE、GOS-10%ALE、GOS-15%ALE和GOS-20%ALE。
1.3.3 GOS及8种复配物的直链淀粉含量测定
参考Govindaraju等[14]的报道,以土豆直链淀粉为标品,采用碘比色法测定GOS及8种复配物的直链淀粉含量。称量10 mg淀粉样品于2 mL离心管中,加入1 mL 95%乙醇溶液,混匀后80 ℃加热30 min,取出冷却至室温,离心除去醇溶性杂质。加1 mL石油醚,振荡混匀,离心除去脂溶性杂质。向离心所得沉淀中加入1.0 mL 0.2 mol/L NaOH溶液,90 ℃水浴10 min,取适量提取液用乙酸和碘试剂显色,用酶标仪在620 nm处测定吸光度。以0.2 mol/L NaOH溶液替代样品为空白进行相同的操作。绘制标准曲线然后计算直链淀粉含量。
1.3.4 GOS及8种复配物的短程有序性测定
采用红外光谱仪测定GOS及8种复配物的光谱信号。利用OMNIC 32软件对数据进行反褶积处理,并计算样品的有序度(degree of order,DO)和双螺旋程度(degree of double helix,DD)。其中DO和DD分别是红外图谱去卷积后在1 047 cm-1与1 022 cm-1处的比值和995 cm-1与1 022 cm-1处的比值[15]。
1.3.5 GOS及8种复配物的微观形貌观察
将GOS及8种复配物充分干燥后,取一部分样品固定在铜台的导电胶上,用离子溅射仪对其进行喷金处理,采用场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)于6.00 kV电压下观察淀粉颗粒形貌特征[16]。
1.3.6 GOS及8种复配物的热力学性质测定
采用同步热分析仪测定GOS及8种复配物的热力学性质。称取10 mg冻干后的样品,置于同步热分析仪的铂盘中,在恒定流速(20.0 mL/min)的氩气气氛下,加热速率为10 ℃/min,温度变化范围为30~600 ℃,获得9种样品的质量变化曲线。
1.3.7 GOS及8种复配物的流变学性能测定
采用旋转流变仪测定GOS及8种复配物的流变特性。称取适量样品,用蒸馏水制备成质量分数为6%的样品溶液。静置过夜后将样品转移到测试平台上,采用平行板(直径50 mm,间隙1 mm)进行静态和动态流变测试。在25 ℃下进行静态剪切扫描,剪切速率范围为0.01~100.00 s-1。在线性黏弹区进行应变扫描(0.01%~10.00%)以确定后续测试的应变值。频率扫描在25 ℃、2.0%应变、0.05~50.00 rad/s的频率范围内进行。采用RheoCompass软件采集动态流变参数,包括储能模量(G′)和损耗模量(G″)[17]。
除非另有说明,所有数据均以3次测定的平均值±标准偏差表示。使用Origin 2018软件绘制图形。使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),评估统计的显著性,显著性水平设定为P<0.05。
直链淀粉和支链淀粉是构成淀粉的两种基本成分[18]。直链淀粉含量(amylose content,AMC)决定了淀粉链分子间的缔合和晶型结构等更高层次的结构特征,也是淀粉理化性质和消化特性的重要影响因素[19]。GOS及8种复配物的浸出直链淀粉含量见表1。由表1可知,GOS-5%ACE和GOS-10%ACE的AMC显著低于GOS(P<0.05)。GOS-15%ACE和GOS-20%ACE的AMC值与GOS无显著差异。对于ALE,4种GOS与ALE复配物的AMC均大于GOS,但是不同添加量的样品之间无明显差异。推测其中的原因可能是,在燕麦淀粉糊化过程中,ACE添加量小于10%时,由于其分子质量较小,糖链分子较短,其与水分子竞争,与淀粉分子发生氢键作用,从而减少了直链淀粉的浸出。当ACE添加量增加或加入分子质量较大的ALE时,糖链分子会与水分子或支链淀粉分子形成氢键,直链淀粉更容易从局部螺旋等有序结构中释放出来。
表1 不同分子质量银耳多糖对燕麦淀粉浸出直链淀粉含量的影响
Tab.1 Effects of tremella polysaccharides with different mole-cular weights on contents of leached amylose of oat starch
不同小写字母表示不同样品之间存在显著差异(P<0.05)。
样品名称w(直链淀粉)/%GOS44.55±0.74cGOS-5%ACE40.66±1.18bGOS-10%ACE35.11±0.63aGOS-15%ACE47.43±1.25cdeGOS-20%ACE46.57±1.28cdGOS-5%ALE48.96±2.43deGOS-10%ALE50.04±3.25eGOS-15%ALE47.73±1.77cdeGOS-20%ALE49.81±1.45de
2.2.1 银耳多糖对燕麦淀粉特征官能团的影响
图1为GOS及8种复配物的红外光谱及各样品在波数为1 200~800 cm-1的去卷积图谱。由图1(a)可知,波数为3 304~3 318 cm-1附近的吸收峰为羟基伸缩振动峰,1 364 cm-1处为C—O—H基团的变形振动,而1 147、1 076 cm-1处分别为淀粉C—O伸缩振动和C—C单键骨架振动[20]。929、849 cm-1处的信号分别为α-(1,4)-糖苷键的对称伸缩振动和α-(1→4)-糖苷键的骨架振动,758 cm-1处的吸收峰为亚甲基的弯曲振动峰[21]。对比9种样品的羟基伸缩振动峰,发现GOS-10%ACE的吸收峰分布更宽,说明其中含更多分子间氢键作用。GOS-5%ALE和GOS-15%ALE的羟基峰吸收更弱,分布略宽,对应更多的分子间氢键,而GOS-10%ALE和GOS-20%ALE与GOS的峰型更接近,对应更多的是分子内氢键。
图1 不同分子质量银耳多糖对燕麦淀粉特征官能团和短程有序性的影响
Fig.1 Effects of tremella polysaccharides with different molecular weights on functional groups and short-range ordered structure of oat starch
GOS-5%ACE、GOS-15%ACE和GOS-20%ACE在1 738 cm-1左右处出现了一个新的吸收峰,可能是ACE中羰基振动峰。随着ACE添加量的增加,1 636 cm-1处的吸收峰逐渐红移至1 613 cm-1处,该峰为O—H的弯曲振动峰,其红移现象表明ACE的羟基与燕麦淀粉形成氢键[22]。ACE与淀粉之间的相互作用强于淀粉分子内的相互作用。在糊化过程中,ACE与淀粉颗粒中先浸出的直链淀粉形成氢键连接,然后包围在淀粉颗粒表面,导致糊化程度降低[23]。与ACE不同的是,ALE的加入对GOS在 1 636 cm-1附近的信号没有明显的影响,表明其与淀粉分子发生氢键作用更弱,这可能与ALE的相对分子质量更大有关。
2.2.2 银耳多糖对燕麦淀粉短程有序性的影响
通常,1 047 cm-1处的红外吸收峰可代表淀粉结晶区的有序结构,而1 022 cm-1附近的吸收峰则代表淀粉的无序结构。R1 047/1 022可用来衡量淀粉晶体的有序程度,有序度越高,比值越大[20]。995 cm-1处的红外吸收代表淀粉分子中的双螺旋结构。R995/1 022代表淀粉双螺旋结构的多少,比值越大,螺旋结构所占比例越多[24]。表2为糊化燕麦淀粉及其与不同分子质量银耳多糖复配物的短程有序程度和双螺旋度。由表2可知,GOS的R1 047/1 022值远小于糊化前燕麦淀粉(0.864) [25],这是因为糊化后淀粉颗粒的结晶区有序结构受到破坏。
表2 糊化燕麦淀粉及其与不同分子质量银耳多糖的短程有序程度和双螺旋度
Tab.2 Degree of short-range order and degree of double helix of gelatinized oat starch and its composites with tremella polysaccharides with different molecular weights
不同小写字母表示不同样品之间存在显著差异(P<0.05)。
样品名称R1047/1022R995/1022GOS0.511±0.005c1.283±0.009fGOS-5%ACE0.541±0.010d1.246±0.011eGOS-10%ACE0.442±0.001a1.147±0.001bGOS-15%ACE0.566±0.006ef1.184±0.008cGOS-20%ACE0.597±0.007g1.203±0.009dGOS-5%ALE0.568±0.011f1.354±0.017gGOS-10%ALE0.483±0.004b1.268±0.003fGOS-15%ALE0.555±0.005e1.149±0.003bGOS-20%ALE0.446±0.001a1.090±0.002a
由表2可知,添加两种银耳多糖后,R1 047/1 022出现了显著变化。对于分子质量较小的ACE,除GOS-10%ACE外,其余3个复配组分的R1 047/1 022值均大于GOS,且ACE加入量越多比值越大,表明ACE可能与燕麦淀粉分子发生了一定的有序结合。Zhou等[26]报道了黑木耳多糖对芸豆淀粉的短程有序结构也有类似的作用效果。对于R1 047/1 022值变小的GOS-10%ACE,可能是因为在该添加量时,仅部分ACE糖链与淀粉分子形成了局部有序结构,当更多的ACE分子加入后,可能存在ACE分子内的相互作用。对于分子质量更大的ALE,GOS-5%ALE和GOS-15%ALE的R1 047/1 022值明显大于GOS(P<0.05),而GOS-10%ALE和GOS-20%ALE却显著降低(P<0.05)。
对于双螺旋程度的指标(R995/1 022值),除GOS-5%ALE和GOS-10%ALE外,其余组分的R995/1 022结果均显著低于GOS(P<0.05)。通常,淀粉分子的双螺旋结构主要发生在支链分子的分支上。当糖链分子加入后,部分糖链分子插入淀粉分子中间,影响了双螺旋结构的形成,尤其是分子链更短的ACE更容易渗透到分子内部,其与淀粉分子间的氢键作用更强。
淀粉的颗粒结构包括颗粒直径和形貌特征。GOS及其与银耳多糖复配物的SEM分析结果如图2所示。由图2可知,所有样品都没有淀粉颗粒结构,表明淀粉已完全糊化。GOS主要呈现相互交联的多孔网络结构,孔壁较薄,表明其凝胶强度较低,更容易受到消化酶的攻击。与GOS相比,GOS-5%ACE和GOS-20%ACE表现出连续且相对有序的纤维网络结构,网络结构更为连续致密,而GOS-10%ACE和GOS-15%ACE与GOS的结构更为相似,但连续的网络结构被破坏得更严重。
放大倍数为500倍。
图2 不同分子质量银耳多糖对燕麦淀粉微观结构的影响
Fig.2 Effects of tremella polysaccharides with different molecular weights on microstructure of oat starch
与ACE不同,ALE的添加使得GOS的网络结构呈现更大的片状结构,凝胶上的小孔不规则且出现较多碎片状结构。这与Xie等[27]报道的更高分子质量的阿拉伯木聚糖对燕麦淀粉凝胶网络结构破坏更严重的结果一致,说明ALE与GOS分子链的结合更弱于GOS分子之间的相互作用,ALE的添加破坏了淀粉凝胶网络结构。
GOS及8种复配物的热重分析和热重导数分析曲线如图3所示。由图3(a)可知,在所测温度范围内,主要存在3个明显的质量损失区域,依次标注为Ⅰ(30~150 ℃)、Ⅱ(275~350 ℃)和Ⅲ区(350~600 ℃),其中,Ⅰ区主要体现的是样品中水分的丢失。9种样品在Ⅰ区A点对应的质量分数为86.1%~87.3%[28],因此样品水分含量为12.7%~13.9%;Ⅱ区对应的是燕麦淀粉和银耳多糖的热降解[20],图3(a)中B点对应的质量分数为24.8%~32.6%。因此,9种样品在此区间的质量损失率为54.3%~62.4%。Ⅲ区主要发生燃烧产物与无机盐的重组,这时剩余残渣与样品中矿物质等无机物相关[29]。Ⅲ区C点对应的纵坐标数值即为样品最终剩余质量分数。由图3(a)可知,GOS的水分含量和最终剩余质量分数分别为13.1%和19.6%。经计算,随ACE添加量的增加,复配物的水分含量和最终剩余质量分数先略微减小随后增加,但均低于GOS,且以GOS-5%ACE最低(约12.7%和13.8%)。然而,GOS与ALE复配物的水分含量随着ALE添加量增加而增加,但4种复配物的最终剩余质量分数均低于GOS,且以GOS-10%ALE最低(约17.7%)。
图3 不同分子质量银耳多糖对燕麦淀粉热力学性质的影响
Fig.3 Effects of tremella polysaccharides with different molecular weights on thermodynamic property of oat starch
由图3(b)可知,所有样品均存在两个明显的质量损失速率峰(P1和P2)。所有样品的P1对应的质量损失速率非常接近,每分钟损失2.5%±0.1%。不同添加量的ACE和ALE对燕麦淀粉热降解速率产生不同影响。相比之下,分子质量更大的ALE对样品水分丢失速率影响更大,ALE添加量越大,最大质量损失速率就越大。而ACE产生的影响主要存在于有机物被热降解的第二阶段(Ⅱ区),P2对应的最大质量损失速率随着ACE添加量的增加先增加后减小,由每分钟16.2%减小到每分钟12%~13%。
进一步分析发现,ALE使GOS在Ⅰ区P1处最大损失速率对应的温度由92.4 ℃提高到93~97 ℃,ACE则促进了GOS在Ⅱ区P2处的温度由303 ℃提高到310~317 ℃。这说明ACE和ALE均能提高淀粉的热稳定性,但是其中的分子机制不同,可能的原因是ALE与GOS的分子间氢键作用力弱于ACE与GOS的相互作用。
线性黏弹区是指在一定应变范围,储能模量(G′)能够保持基本不变的区域,即可执行测试而不破坏样品结构的范围[20]。因此,在对样品的动态黏弹性进行分析时,首先需要确认线性黏弹区内的应变范围。图4为GOS及8种复配物的流变学测试结果。由图4(a)可知,在0.01%到10.00%的应变范围内,所有样品的G′值不变,因此选取2.00%应变作为后续实验参数。
图4 不同分子质量银耳多糖对燕麦淀粉流变学特性的影响
Fig.4 Effects of tremella polysaccharides with different molecular weights on rheological properties of oat starch
动态流变学频率扫描结果是用来表征淀粉糊黏弹性随频率的变化,反映了多糖对淀粉凝胶弹性及黏性的影响。由图4(b)可知,相同浓度下,GOS的G′值大于8种复配物,且GOS与ACE复配物的G′值整体上略高于GOS与ALE复配物。因此,两种银耳多糖的加入在一定程度上破坏了淀粉分子形成的凝胶结构,分子质量大的组分,破坏更严重。Xie等[29]也发现,高分子质量的阿拉伯木聚糖更容易降低小麦淀粉黏弹性,赤豆多糖也降低了赤豆淀粉黏弹性[30];而具有高黏性特征的魔芋葡甘露聚糖和车前子多糖则被证明会形成物理屏障增强淀粉凝胶的黏弹性[4]。对于ACE,添加量越多,G′值越小,添加量为5%和10%的结果接近,而15%和20%添加量结果接近。与ACE相比,除5%的ALE添加量外,其余组分的G′对于频率的依赖性相对更大,这可以归因于ALE的高分子质量使得其自身具有一定的假塑性流体性质[12]。
采用共糊化的方法,向燕麦淀粉中添加不同质量分数(0、5%、10%、15%和20%)的两种分子质量的银耳多糖(ALE和ACE),沸水加热制备获得糊化燕麦淀粉(GOS)和8种复配物。测定了GOS及8种复配物的直链淀粉含量、官能团特征、热力学性质、微观结构和动态流变学特性。结果发现,糊化过程中,当添加量为5%和10%时,ACE更容易进入燕麦淀粉分子内部并与淀粉分子发生氢键作用,形成较多局部短程有序结构,从而延缓了加热过程中淀粉分子的热降解,但继续加大添加量没有更明显的效果。与ACE相比,由于分子质量更大,ALE分子更多地破坏了燕麦淀粉的短程有序结构,其与燕麦淀粉的氢键作用更弱,对燕麦淀粉的热稳定性的影响主要体现在水分损失阶段。本研究表明,ACE通过氢键作用促进了糊化燕麦淀粉分子形成短程有序结构,形成相对更致密的凝胶网络,其中10%添加量的作用效果最为突出。两种多糖均能提高燕麦淀粉的热稳定性并降低淀粉凝胶的黏弹性。未来将进一步探讨不同复配物的体内外消化特性;另外,银耳多糖分子结构复杂,本研究仅从分子质量角度对银耳多糖与燕麦淀粉的相互作用进行了探讨,未来还可以从单糖组成或糖链结构等角度开展研究。
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