阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以脑细胞外β-淀粉样蛋白斑块(β-amyloid protein,Aβ)的形成、脑内神经元和突触丧失等为病理特征的神经退行性疾病[1-2]。AD发病机制复杂,其中β-淀粉样蛋白级联假说和氧化应激假说是其主要发病机制假说。研究表明,脑内Aβ过量聚集会产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),损伤细胞线粒体[3],并导致脑内氧化-抗氧化系统失衡,发生氧化应激,最终导致痴呆[4]。因此,减少脑内Aβ过量聚集和氧化应激将是预防及治疗AD的有效手段。

海葡萄,学名长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentili-fera),属于绿藻门蕨藻科,主要生长在东南亚及我国南海等地。海葡萄含有丰富的多糖、海藻多酚、氨基酸、植物单宁等营养成分[5]。研究表明,海藻来源的糖类化合物可能是人类寻找治疗AD药物的新领域,如海带岩藻多糖可有效抑制Aβ诱导的SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元凋亡,促进神经突起再生,改善AD患者记忆[6];另外,由我国自主研发的新药,来自褐藻降解产物的甘露寡糖二酸(GV-971),能够解聚Aβ聚合体并抑制Aβ寡聚体形成,多靶点阻止AD病程进展[7]。目前,国内外对海葡萄多糖的研究处于起步阶段,其具体分子结构尚不清楚,在抗AD活性方面报道较少。但有研究指出,海葡萄多糖具有较好的体外抗氧化[8]、抗炎[9]和免疫调节[10]等活性,对改善氧化应激和Aβ聚集引起的AD病理损伤,具有潜在的作用。

本研究采用水提醇沉法提取海葡萄多糖,对其进行分离纯化,分析其抗氧化活性和Aβ1-42聚集抑制活性,并对其理化性质进行系统表征。SH-SY5Y属于人源神经母细胞瘤细胞系,具有轴突结构类似神经元的形态,同时具有神经递质合成能力,常用于AD的体外研究。Aβ1-42作为AD的关键病理因子可诱导SH-SY5Y细胞产生氧化应激及细胞凋亡的损伤过程,通过Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤可在体外快速建立AD相关的神经毒性实验模型,用于研究海葡萄多糖的抗AD活性。本研究以海葡萄多糖为研究对象,旨在开发一种兼具抗氧化应激和抑制Aβ1-42聚集的多靶向抗AD物质,为辅助治疗AD的功能食品开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海葡萄,杭州牧海食品经营有限公司;人源神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、特级胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(双抗)。DMEM/F-12、胰酶(质量分数为0.25%),武汉Procell公司;Sephadex G-200凝胶,北京索莱宝科技有限公司;果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、单糖标准品(岩藻糖Fuc、鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、果糖Fru、核糖Rib、半乳糖醛酸Gal-UA、葡萄糖醛酸Glc-UA、甘露糖醛酸Man-UA、古罗糖醛酸Gul-UA)、2,2-二苯基-1-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、石杉碱甲(Huperzine A)、D2O,美国sigma公司;Aβ1-42,美国EZBiolab公司;硫黄素T(Thioflavin T,ThT)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG),上海源叶生物科技有限公司;相关试剂盒,南京建成生物工程研究所。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ALPHA 1-2型冷冻干燥机,德国Martin Christ公司;ICS 5000 型离子色谱系统、Ultimate3000型高效液相色谱仪、Nicolet iS 10型傅立叶红外变换光谱仪,美国Thermo公司;DAWN HELEOS-Ⅱ型十八角度激光光散射仪,美国Wyatt公司;AVIIIHD500型核磁共振仪,瑞士布鲁克公司;SPM-9700HT型原子力显微镜(AFM),日本Shimadzu公司;JSM-7500F型扫描电子显微镜(SEM),日本电子株式会社;CKX53型倒置显微镜,深圳市欧博浩瀚科技有限公司;Infinite M Plex型全波长酶标仪,瑞士帝肯公司;XO-1000D型超声波细胞粉碎仪,南京先欧仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 海葡萄多糖的制备

将海葡萄清洗、干燥、粉碎、脱脂,并再次干燥,得到海葡萄粉末。准确称取海葡萄粉末,按照m(海葡萄粉)∶V(提取液)为1∶40(g/mL)的料液比加入去离子水,并添加质量分数为2%的纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶,三者质量比为1∶1∶1,50 ℃提取3 h,高温灭酶,过滤浓缩。向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇,4 ℃醇沉过夜,8 000 r/min离心10 min,收集沉淀,冷冻干燥,得到海葡萄多糖,命名为CLP。

1.3.2 海葡萄多糖的分离与纯化

参考陈秉彦等[11]的方法并修改。采用Sephadex-G200凝胶色谱柱对CLP进行分离纯化。以0.2 mol/L NaCl溶液为流动相,按照1 mL/min的流速进行洗脱,收集洗脱液,每管5 mL,共50管。测定每管多糖含量,将相同峰的洗脱组分合并,用截留分子质量为1 kDa的透析袋透析48 h去除NaCl,冷冻干燥,得纯化多糖,命名为CLP-1,并测定CLP-1的回收率。

1.3.3 海葡萄多糖化学组成的测定

通过苯酚-硫酸法[12]测定CLP和CLP-1的总糖含量。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定CLP和CLP-1的蛋白质含量。通过BaCl2/明胶法[13]测定CLP和CLP-1中硫酸基团的含量。

1.3.4 海葡萄多糖抗氧化性和Aβ1-42聚集抑制活性的测定

1.3.4.1 抗氧化性的测定

参考Xiao等[14]的方法并修改。分别将2 mg/mL的CLP和CLP-1溶液与浓度为0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液等体积充分混匀,以2 mg/mL的维生素C作为阳性对照,避光30 min,在517 nm波长处测得吸光度值。DPPH自由基清除率按照式(1)计算。

DPPH自由基清除率

(1)

式(1)中,A0为蒸馏水和DPPH溶液的吸光度值,A1为多糖溶液和DPPH溶液的吸光度值,A2为多糖溶液和无水乙醇的吸光度值。

1.3.4.2 Aβ1-42聚集抑制活性的测定

参考Qi等[15]的方法并修改。将CLP、CLP-1分别与10 mmol/L Aβ1-42共同孵育,将20 μL混合溶液与180 μL 5 mmol/L ThT混合,36 h后取样检测。以单独孵育的Aβ1-42作为空白对照,以EGCG为阳性对照,使用酶标仪在450 nm激发波长和480 nm发射波长处测定每孔样品的荧光强度。Aβ1-42聚集抑制率按照式(2)计算。

Aβ1-42聚集抑制率

(2)

式(2)中,Fi为加入样品后的荧光强度,Fb为样品本身荧光强度(无Aβ1-42),Fo为空白对照荧光强度。

1.3.5 海葡萄多糖单糖组成及分子质量分布的测定

参照Salvador等[16]的方法,对CLP-1进行前处理,利用离子色谱分析CLP-1的单糖组成。色谱条件:色谱柱为DionexTM CarboPacTM PA20(150×3.0 mm,10 μm)液相色谱柱,进样量5 μL,流动相A(H2O)、流动相B(0.1 mol/mL NaOH溶液)、流动相C(0.1 mol/mL NaOH溶液,0.2 mol/mL NaAc溶液),流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,梯度洗脱。

采用十八角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱仪联用测定CLP-1的分子质量。色谱条件:PSS GRAM 3000 Å色谱柱,流速0.5 mL/min,进样量100 μL,柱温35 ℃,流动相质量分数为0.02%的NaNO3溶液。数据采用Astra软件进行分析,折射率的增量(dn/dc)为0.138 mL/g。

1.3.6 CLP-1初级结构分析

采用红外光谱对CLP-1进行分析,在400～4 000 cm-1波数处进行红外光谱扫描。

1.3.7 CLP-1构型分析

称取冻干后的CLP-1样品溶于适量D2O中,注入核磁管中,用核磁共振仪在500 MHz下进行核磁共振氢谱检测(1H-NMR)。

1.3.8 CLP-1构象分析

参考Zhu等[17]的方法并修改。采用刚果红实验对CLP-1进行构象表征。称取2 mg CLP-1加入2 mL 80 μmol/L刚果红溶液,再加入不同体积的NaOH溶液(2 mol/L),使NaOH溶液终浓度为0～0.5 mol/L。以不加多糖的刚果红溶液为对照,在200～600 nm波长处用酶标仪进行扫描,在最大吸收波长处绘制折线图。

1.3.9 CLP-1表面形貌分析

采用原子力显微镜(AFM)和扫描电镜(SEM)对CLP-1的表面形貌进行分析。配制0.05 mg/mL CLP-1水溶液,滴加10 μL在云母片表面,通过AFM对CLP-1进行表面形貌观察。将CLP-1粉末固定于样品台上,喷金,使用SEM进行拍照观察。

1.3.10 CLP-1对SH-SY5Y损伤细胞影响的测定

1.3.10.1 CLP-1对SH-SY5Y损伤细胞形态及存活率影响的测定

参考Jiang等[18]的实验方法并修改,对SH-SY5Y细胞存活率及细胞形态进行测定。将SH-SY5Y细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔酶标板中,每孔100 μL,在37 ℃,含体积分数为5%CO2的培养箱中培养24 h。实验分为5组:空白组,更换为新的培养基培养24 h;模型组,更换为含有Aβ1-42(10 mol/mL)的培养基作用24 h;低、中、高剂量组,分别更换为含有质量浓度为0.01、0.05、0.10 mg/mL CLP-1的培养基培养4 h,之后更换为含有Aβ1-42(10 mol/mL)的培养基作用24 h。按照CCK-8试剂盒说明测定细胞存活率,并用显微镜观察细胞形态。Aβ1-42诱导的SH-SY5Y损伤细胞统称为模型细胞。

1.3.10.2 CLP-1对模型细胞氧化应激水平影响的测定

将SH-SY5Y细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔酶标板中,每孔2 mL,培养24 h。实验分为空白组、模型组和低、中、高剂量组,以及阳性对照组,前5组按1.3.10.1中的分组进行处理;阳性对照组,更换为具有神经保护作用的石杉碱甲(10 mol/mL)培养4 h,之后更换为含有Aβ1-42(10 mol/mL)的培养基作用24 h。将各孔培养基以1 000 r/min离心10 min,收集细胞,在冰水浴环境下超声破碎,超声功率为300 W,时间为1 min,4 ℃条件下以12 000 r/min 离心5 min,取上清液作为待测样品。按照试剂盒说明书测定总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。T-AOC和MDA测定结果以每克蛋白中各指标的物质的量表示,单位为mmol/g;CAT、GSH-Px、SOD测定结果以每克蛋白中具有的酶活力表示,单位为U/g。

1.3.10.3 CLP-1对模型细胞线粒体膜电位影响的测定

将SH-SY5Y细胞以1×106个/mL的密度接种于6孔酶标板中,每孔2 mL,培养24 h,按照1.3.10.2中的分组进行处理。加入1 mol/L星形孢菌素(staurosporine,STS)诱导4 h使细胞凋亡,用PBS洗涤细胞3次,2 000 r/min离心5 min,收集细胞。加入500 μL JC-1工作液将细胞悬浮,在37 ℃培养箱中孵育15～20 min。室温条件下2 000 r/min离心5 min,收集细胞,采用1×incubation buffer清洗3次。加入500 μL Buffer重悬细胞,在荧光显微镜下观察,使用酶标仪在490 nm激发波长,520 nm发射波长处测定各孔细胞的荧光强度。

1.3.10.4 CLP-1对模型细胞ROS水平影响的测定

将SH-SY5Y细胞以1×106个/mL的密度接种于6孔酶标板中,每孔2 mL,培养24 h。按照1.3.10.2中的分组进行处理。向每孔中加入2 mL DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)探针,37 ℃培养箱中孵育30 min,收集细胞。将各孔细胞以1 000 r/min离心3 min,PBS清洗3次后重悬,使用酶标仪在488 nm激发波长,525 nm发射波长处测定各孔细胞的荧光强度,并用荧光显微镜进行观察。

1.4 数据处理

所有样品均重复测定3次,数据用平均值±标准偏差表示。使用Origin 2021软件进行数据分析并绘图;使用SPSS软件对实验数据进行显著性分析,P<0.05表示实验结果具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 CLP纯化及化学组成分析

图1为CLP的洗脱曲线。由图1可知,经凝胶洗脱后,CLP分离纯化得到一个主要组分CLP-1,计算CLP-1的回收率为79.52%(质量分数)。

CLP和CLP-1的化学组成及含量分析结果如表1所示。由表1可知,CLP和CLP-1的总糖质量分数分别为65.25%和70.77%,硫酸基团质量分数分别为11.82%和14.21%。二者都不含蛋白质。

2.2 CLP的抗氧化性和Aβ1-42聚集抑制活性分析

CLP和CLP-1的DPPH自由基清除率和对Aβ1-42聚集的抑制率分析结果见图2。由图2(a)可知,CLP和CLP-1对DPPH自由基清除率分别为44.21%和64.38%。CLP-1的DPPH自由基清除能力更好,清除效果更接近维生素C(82.53%)。DPPH自由基清除活性与多糖的供氢能力有关,CLP中含有的硫酸基团可以激活CLP异头碳上的氢原子,增强多糖的供氢能力[19]。有研究表明,DPPH自由基清除活性与硫酸基团含量呈正相关[20]。

抑制Aβ聚集可以减轻脑内神经元细胞的损伤,延缓AD的病程。ThT可以与Aβ聚集体中的β-sheet结构特异性结合,在波长480 nm处发射出强烈的荧光。荧光强度在一定程度内与Aβ聚集体的浓度成正比,且荧光强度越高说明Aβ聚集程度越高,抑制效果越差。因此ThT荧光实验被广泛应用于Aβ聚集相关的实验表征[21]。由图2(b)可知,CLP和CLP-1对Aβ1-42聚集的抑制率分别为64.23%和71.62%。CLP-1对Aβ1-42聚集抑制能力更好,抑制效果接近EGCG(83.55%)。研究表明,多糖中的硫酸基团可以通过静电相互作用和Aβ1-42结合,与Aβ1-42单体上的残基之间形成氢键,阻止Aβ1-42残基之间氢键的形成,从而抑制Aβ1-42聚集[22]。

由图2可知,CLP-1比CLP具有更好的DPPH自由基清除活性,同时对Aβ1-42的聚集具有较好的抑制效果。这可能是因为CLP-1的硫酸基团含量相对较高,因此选用CLP-1进行后续实验。

2.3 CLP-1结构表征结果

2.3.1 CLP-1分子质量分布及单糖组成

通过十八角度激光光散射与凝胶色谱联用系统对CLP-1分子质量进行测定,其分子质量分布见表2。 由表2可知,CLP-1的重均分子质量(Mw)为3.98×106 Da,数均分子质量(Mn)为2.12×106 Da,分散指数(Mw/Mn)为1.88。目前分离获得的海葡萄多糖分子质量存在较大差异,有20～60 kDa[8,23],100～200 kDa[24],2 589.9～4 068.5 kDa[9]和5 184.97～13 531.72 kDa[25]。 CLP-1的分子质量与已知海葡萄多糖的分子质量数据均不相同,可能因为产地、提取方法及分离方法等存在差异。在高温条件下,多糖链会发生断裂,使多糖降解,导致分子质量降低[8]。

CLP-1的单糖组成分析结果如图3所示。由图3可知,CLP-1中含有半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖,4种单糖的物质的量比为48.1∶1.0∶23.2∶46.1。

2.3.2 CLP-1初级结构分析结果

通过红外光谱对多糖的初级结构和主要官能团进行分析,结果如图4所示。图4中,2 918 cm-1处的峰是C—H的伸缩振动吸收峰,是多糖的特征峰[26]。1 630 cm-1处的峰是羰基CO伸缩振动引起的,3 323 cm-1处的峰表明存在—OH伸缩振动,由分子内和分子间氢键导致。在1 210 cm-1附近有硫酸基SO的伸缩振动,在823 cm-1附近有 C—O—S 的轴向伸缩振动,表明CLP-1存在硫酸基取代,为酸性多糖[27]。在波数为1 000～1 200 cm-1的吸收峰则显示了C—O—C、C—O—H和C—C键的存在,表明CLP-1中存在吡喃糖结构[28]。

2.3.3 CLP-1构型分析结果

CLP-1的1H-NMR分析结果如图5所示。NMR技术经常被用于多糖的表征,包括α-或β-异聚体构型的确认、糖苷键连接方式[29]。在1H-NMR谱中,通常α型糖苷的异头氢化学位移大于5.0×10-6,β型糖苷键的化学位移一般在4.2×10-6～4.8×10-6。由图5可知,在δ为3.0～5.5时出现的信号,是多糖的特征信号。CLP-1的化学位移在5.0×10-6以上和4.2×10-6～4.8×10-6都出现了质子信号,说明CLP-1中存在α和β两种构型的糖苷键。

2.3.4 CLP-1构象分析结果

具有三股螺旋构象的多糖能够与刚果红形成络合物,络合物的最大吸收波长会相对于刚果红溶液发生红移,在NaOH浓度增加至破坏三股螺旋结构的阈值时,会使络合物分解,导致最大吸收波长减小[30]。CLP-1与刚果红混合溶液在不同NaOH浓度下最大吸收波长的变化如图6所示。由图6可知,刚果红+CLP-1组最大吸收波长增大,发生红移现象,表明CLP-1具有三股螺旋结构。但是随NaOH浓度增加至0.5 mol/L时,络合物没有分解,可能由于CLP-1分子质量较高且含硫酸基团,使三股螺旋结构更加稳定,难以被破坏,从而维持了CLP-1结构和功能活性的稳定。同时有研究指出,只有多糖的分子质量大于90 kDa,才能形成三股螺旋结构[31],本研究的CLP-1的分子质量为3.98×106 Da,说明其较大的分子质量是形成并维持三股螺旋结构稳定的关键因素之一。

2.3.5 CLP-1表面形貌分析结果

CLP-1的原子力显微镜观察结果如图7所示。由图7(a)可知,CLP-1分子排列密集,且形状和大小具有明显差异;由图7(b)可知,CLP-1呈高低不等的密集突起状结构,这与硫酸基团和羟基形成氢键使分子间引力增大有关,且高度最高为9.42 nm,高于多糖单链直径的理论值(0.1～1.0 nm)[32],说明CLP-1具有高度分支结构。

采用扫描电镜观察CLP-1的表面形貌,结果如图8所示。由图8可见,样品表面光滑,球形颗粒和棒状结构主体为多糖聚合物之间的相互连接提供机会,各种形状结构无序堆积在一起,结构间存在一定缝隙,略微疏松,可能为无定型结构。CLP-1与Sun等[9]获得的海葡萄多糖在形态结构上存在一定差异,这可能是由于原料来源和提取工艺的不同,使二者多糖的硫酸基团含量和分支程度等存在差异。

2.4 CLP-1对模型细胞损伤的影响

2.4.1 CLP-1对模型细胞存活率和形态的影响

采用CCK-8法测定模型细胞存活率,分析结果如图9所示。由图9可知,与模型组相比,CLP-1能提高模型细胞的存活率,其中,中剂量组具有较好的保护效果,细胞存活率提高了20.03%。

不同处理组的细胞形态变化如图10所示。图10(a)中细胞轴突短触角延伸明显,倾向于成簇生长,且圆润有光泽。图10(b)中,因为受Aβ1-42聚集的损伤,SH-SY5Y细胞的轴突消失,形态变为圆形,体积变小,细胞间距离变大。图10(c)、(d)、(e)中,与模型组相比,经过CLP-1预处理的细胞,损伤程度小,轴突明显,细胞形态完整。这表明,CLP-1中的硫酸基团可能与细胞膜表面的磷脂或蛋白结合,形成保护性涂层,从而减轻了Aβ1-42聚集对细胞膜的破坏,维持了细胞的正常形态[33]。有文献报道,质量浓度为0.80 mg/mL褐藻糖胶可以通过激活PI3K通路及促进抗凋亡蛋白的表达,使SH-SY5Y损伤细胞存活率提高约20.00%[34]。本研究表明,中剂量组预处理效果最佳,其剂量在低于已报道褐藻糖胶的条件下,对SH-SY5Y损伤细胞的保护与褐藻糖胶作用相当,可以有效改善Aβ1-42对SH-SY5Y细胞形态的损伤,提高细胞存活率。

2.4.2 CLP-1对模型细胞氧化应激水平的影响

人体中的抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px和CAT等。当Aβ聚集使神经细胞受到损伤时,抗氧化酶活性降低,机体的总抗氧化能力也随之降低,导致发生氧化应激,同时还会引发脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物MDA,加快AD发病。CLP-1对SH-SY5Y损伤细胞氧化应激水平的影响,实验结果如图11所示。由图11可知,与空白组相比,模型组的T-AOC水平和抗氧化酶活性显著降低(P<0.05),MDA水平显著升高(P<0.05),模型细胞损伤明显。与模型组相比,经CLP-1预处理,模型细胞的T-AOC水平和抗氧化酶活性显著提高(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.05)。由于中剂量组和高剂量组对抗氧化酶活性和MDA水平的影响不显著(P>0.05),其中,中剂量组对T-AOC水平改善效果最好,所以选择中剂量组作为抑制模型细胞氧化应激的最适浓度。中剂量组相比于模型组,T-AOC水平、CAT活力、GSH-Px活力、SOD活力分别提高了56.23%、63.19%、63.48%、65.80%,MDA水平降低了22.13%。本研究结果表明,CLP-1通过提高抗氧化酶活性和抗氧化能力,减少MDA的生成,从而改善了SH-SY5Y损伤细胞的氧化应激程度,减缓了AD的发生。这与一些海藻多糖的研究报道相似,例如来源于石莼等海藻的硫酸化多糖可以显著提高HT-22大鼠海马神经元细胞中CAT、SOD、GSH-Px水平,通过改善氧化应激缓解神经元细胞损伤[35];马尾藻多糖通过提高PC12细胞的SOD和GSH-Px水平,降低MDA的生成量,从而保护细胞免受损伤[36]。此外,研究发现硫酸化多糖通过调控MAPK、PI3K-Akt等途径,增加机体的抗氧化能力,并促进抗氧化酶基因的表达,抑制MDA和ROS的过度产生,从而抑制细胞的氧化应激[37]。从分子机制层面推测,一方面,CLP-1可能通过促进抗氧化酶基因的表达及内源性抗氧化物质的合成,增强细胞的抗氧化能力;另一方面,CLP-1可能通过抑制ROS生成相关酶活性减少氧化物质来源,从而抑制脂质过氧化反应。因此,抑制氧化应激是CLP-1等硫酸化多糖缓解AD症状的重要作用途径之一。

2.4.3 CLP-1对模型细胞线粒体膜电位水平的影响

线粒体功能发生障碍时,ATP显著减少,ROS过度积累[38],会加剧细胞的氧化应激[39],因此线粒体功能障碍和氧化应激会影响AD的发生与发展。当细胞线粒体功能受到损伤时,线粒体的膜电位水平会下降。CLP-1对SH-SY5Y损伤细胞线粒体膜电位水平的影响,实验结果如图12所示。由图12可知,与空白组相比,模型组线粒体膜电位相对水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,经CLP-1预处理的细胞能显著提高线粒体膜电位相对水平(P<0.05)。Zhao等[36]研究报道,质量浓度为0.1 mg/mL马尾藻多糖使PC12细胞的线粒体膜电位相对水平提高了8.67%。Chen等[40]研究发现,多糖通过提高抗氧化酶的活性可以减少氧化应激对线粒体的损伤,细胞中GSH-Px含量相对较高,是线粒体抗氧化系统中的主要成分,对线粒体膜电位影响可能较大,这与本研究结果相符。由于本研究中的中剂量组对模型细胞的损伤及氧化应激改善效果较好,所以选择中剂量组作为最适浓度。与模型组相比,中剂量组线粒体膜电位相对水平提高了14.80%,优于已报道的马尾藻多糖。CLP-1可能通过抗氧化酶清除线粒体基质内的H2O2和ROS,减少对线粒体膜的损伤,维持膜的完整性与流动性,从而稳定膜电位。另外,CLP-1可能通过调控线粒体相关信号通路,调节线粒体动态平衡,减少线粒体碎片化,进而恢复膜电位水平[41]。本研究结果表明,CLP-1可以通过减少氧化应激,改善细胞的线粒体膜电位水平,维持细胞稳态,对SH-SY5Y损伤细胞具有保护作用。

2.4.4 CLP-1对模型细胞ROS水平的影响

CLP-1对SH-SY5Y损伤细胞ROS的影响,实验结果如图13所示;SH-SY5Y损伤细胞的荧光强度分析结果如图14所示。由图13和图14可知,与空白组相比,模型组细胞的相对荧光强度显著增强(P<0.05),ROS水平显著提高。而与模型组相比,经CLP-1预处理的细胞相对荧光强度则显著降低(P<0.05),其中,中剂量组和高剂量组的改善效果较好,但两组对ROS水平的影响不显著(P>0.05)。由于中剂量组对模型细胞的损伤及氧化应激改善效果较好,所以选择中剂量组作为最适浓度。中剂量组ROS相对荧光强度降低了24.84%,优于已报道的马尾藻多糖(ROS水平降低17.37%)[36]。Aβ1-42聚集会使SH-SY5Y细胞损伤,发生氧化应激,导致ROS的过度积累,损害细胞的抗氧化系统,诱发神经炎症[42];另外,ROS会对细胞线粒体造成损害,促使神经元细胞凋亡,增加AD的严重程度。参考Ling等[43]对泡叶藻多糖的研究结果,推测CLP-1可能通过特定基团(硫酸基、羟基等)与胞内游离的ROS结合,实现ROS的直接清除;另外,结合CLP-1对GSH-Px等抗氧化酶活性的显著提升效果,其可能通过提高抗氧化酶活性,间接减少ROS的过度积累;同时,CLP-1可能通过抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)等ROS生成相关酶的活性,从而抑制ROS过量产生。本研究结果表明,CLP-1可能通过直接清除与间接抑制,降低细胞的ROS水平,且与线粒体保护、抗氧化酶激活形成协同作用,这可能是抑制氧化应激及缓解AD症状的潜在作用机制之一。

3 结 论

本研究采用水提醇沉法从海葡萄中获得CLP,通过分离纯化得到一种酸性多糖组分CLP-1。研究结果表明,CLP-1的DPPH自由基清除能力和抑制Aβ1-42聚集的能力均高于CLP。CLP-1主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成,含有α和β两种糖苷键,存在硫酸基取代,具有三股螺旋结构,且为吡喃糖。CLP-1表面形貌以球形颗粒和棒状结构为主体,具有高度分支结构。经CLP-1预处理能减轻SH-SY5Y细胞受Aβ1-42聚集造成的损伤,有效降低SH-SY5Y损伤细胞的氧化应激程度。质量浓度为0.05 mg/mL的CLP-1使SH-SY5Y损伤细胞的T-AOC水平、CAT活力、GSH-Px活力、SOD活力及线粒体膜电位水平分别提高了56.23%、63.19%、63.48%、65.80%、14.80%,MDA和ROS水平分别降低了22.13%和24.84%。未来将继续深入研究CLP-1的高级结构,并通过动物实验进一步验证CLP-1的抗AD作用机制,为辅助治疗AD功能性食品的开发提供理论基础。

参考文献：

[1] JOE E, RINGMAN J M. Cognitive symptoms of Alzheimer’s disease: clinical management and prevention[J]. BMJ British Medical Journal, 2019, 367: l6217.

[2] 王刚, 齐金蕾, 刘馨雅, 等. 中国阿尔茨海默病报告2024[J]. 诊断学理论与实践, 2024, 23(3): 219-256.WANG G, QI J L, LIU X Y, et al. China Alzheimer report 2024[J]. Journal of Diagnostics Concepts &Practice, 2024, 23(3): 219-256.

[3] BIRLA H, MINOCHA T, KUMAR G, et al. Role of oxidative stress and metal toxicity in the progression of Alzheimer’s disease[J]. Current Neuropharmacology, 2020, 18(7): 552-562.

[4] LI H, LÜ L, WU C Y, et al. Methyl jasmonate protects microglial cells against β-amyloid-induced oxidative stress and inflammation via Nrf2-dependent HO-1 pathway[J]. Neuropsychiatric Disease and Treatment, 2020, 16: 1399-1410.

[5] 王玉. 海南两养殖区长茎葡萄蕨藻营养成分分析及活性功能研究[D]. 海口: 海南大学, 2020.WANG Y. Analysis of nutritional components and active function of Caulerpa lentillipera in two cultivation areas of Hainan province[D]. Haikou: Hainan University, 2020.

[6] 杨志友, 马智慧, 张永平, 等. 岩藻多糖对Aβ25-35 诱导神经元凋亡和突起萎缩的抑制作用[J]. 湛江: 广东海洋大学学报, 2021, 41(4): 77-83.YANG Z Y, MA Z H, ZHANG Y P, et al. Protective effect of fucoidan on Aβ25-35-induced neuronal injury and neurite atrophy[J]. Zhanjiang: Journal of Guangdong Ocean University, 2021, 41(4): 77-83.

[7] WANG X Y, SUN G Q, FENG T, et al. Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota and suppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibit Alzheimer’s disease progression[J]. Cell Research, 2019, 29(10): 787-803.

[8] TESVICHIAN S, SANGTANOO P, SRIMONGKOL P, et al. Sulfated polysaccharides from Caulerpa lentillifera：optimizing the process of extraction, structural characteristics, antioxidant capabilities, and anti-glycation properties[J]. Heliyon, 2024, 10(2): e24444.

[9] SUN Y, LIU Z, SONG S, et al. Anti-inflammatory acti-vity and structural identification of a sulfated polysaccharide CLGP4 from Caulerpa lentillifera[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 146: 931-938.

[10] ZHANG M J, ZHAO M H, QING Y D, et al. Study on immunostimulatory activity and extraction process optimization of polysaccharides from Caulerpa lentillifera[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 143: 677-684.

[11] 陈秉彦, 林晓姿, 李维新, 等. 乳酸菌联合酿酒酵母发酵对龙须菜多糖结构特征及抗氧化性的影响[J]. 食品科学技术学报, 2023, 41(3): 107-115.CHEN B Y, LIN X Z, LI W X, et al. Effects of Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae fermentation on structure characteristics and antioxidant properties of Gracilaria lemaneiforms polysaccharide[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023, 41(3): 107-115.

[12] DUBOIS M, GILLES A K, HAMILTON K J, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 2002, 28(3): 350-356.

[13] KAWAI Y, SENO N, ANNO O. A modified method for chondrosulfatase assay[J]. Analytical Biochemistry, 1969, 32: 314-321.

[14] XIAO Z J, YAN C Y, JIA C X, et al. Structural chara-cterization of chia seed polysaccharides and evaluation of its immunomodulatory and antioxidant activities[J]. Food Chemistry: X, 2023, 20: 101011.

[15] QI X L, ZHAO P, ZHANG Y, et al. Sesquiterpenes from Stigma maydis ( Zea mays ) as a crop by-product and their potential neuroprotection and inhibitory activities of Aβ aggregation[J]. Industrial Crops &Products, 2018, 121: 411-417.

[16] SALVADOR L D, SUGANUMA T, KITAHARA K, et al. Monosaccharide composition of sweetpotato fiber and cell wall polysaccharides from sweetpotato, cassava, and potato analyzed by the high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection method[J]. Journal of Agricultural &Food Chemistry, 2000, 48(8): 3448-3454.

[17] ZHU M Q, HUANG R M, WEN P, et al. Structural characterization and immunological activity of pectin polysaccharide from kiwano (Cucumis metuliferus) peels[J]. Carbohydrate Polymers, 2021, 254: 117371.

[18] JIANG R W, DU X G, ZHANG X, et al. Synthesis and bioassay of β-(1,4)-D-mannans as potential agents against Alzheimer’s disease[J]. Acta Pharmacol Sinica, 2013, 34(12): 1585-1591.

[19] WANG J L, GUO H Y, ZHAN J, et. Sulfated modification, characterization and structure-antioxidant relationships of Artemisia sphaerocephala polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81: 897-905.

[20] CHOLARA R, VENKATACHALAM R. Investigation of antioxidant and anticancer potential of fucoidan (in-vitro &in-silico) from brown seaweed Padina boergesenii[J]. Algal Research, 2024, 79: 103442.

[21] VASSAR P S, CULLING C F. Fluorescent stains, with special reference to amyloid and connective tissues[J]. Archives Phthology, 1959, 68: 487-498.

[22] 蒋露莹. GV971和石莼多糖单元抑制Aβ42构象转换的分子机制[D]. 天津: 天津科技大学, 2022. JIANG L Y. Molecular mechanism of conformational transition of Aβ42 inhibited by GV971 and ulvan components[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2022.

[23] SHEVCHENKO N M, BURTSEVA Y V, ZVYAGINTEVA T N, et al. Polysaccharides and sterols from green algae Caulerpa lentillifera and C. sertularioides[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2009, 45: 1-5.

[24] MAEDA R, IDA T, IHARA H, et al. Immunostimulatory activity of polysaccharides isolated from Caulerpa lentillifera on macrophage cells[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2014, 76: 501-505.

[25] LONG H, GU X, ZHOU N, et al. Physicochemical characterization and bile acid-binding capacity of water-extract polysaccharides fractionated by stepwise ethanol precipitation from Caulerpa lentillifera[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 150: 654-661.

[26] FU Y, LI F, DING Y, et al. Polysaccharides from loquat (Eriobotrya japonica) leaves: impacts of extraction methods on their physicochemical characteristics and biological activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 146: 508-517.

[27] MANUEL J E, VIRGINIA P F, LUCIANA K, et al. Chemical and in situ characterization of macromolecular components of the cell walls from the green seaweed Codium fragile[J]. Glycobiology, 2009, 19(3): 212-228.

[28] ZHU H, YI X, JIA S S. Optimization of three extraction methods and their effect on the structure and antioxidant activity of polysaccharides in Dendrobium huoshanense[J]. Molecules, 2023, 28: 8019.

[29] 孔志强, 赵玉红. 沙棘降解多糖结构表征和功能特性研究[J]. 食品科学技术学报, 2023, 41(6):65-74. KONG Z Q, ZHAO Y H. Structural characterization and functional properties of sea buckthorn degraded polysaccharides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023, 41(6):65-74.

[30] LI D J, IBADULLAH W Z, SHUKRI R, et al. Structural characterization and antioxidant activity of polysaccharide from Rhodomyrtus tomentosa berry[J]. Food Chemistry, 2025, 484: 144150.

[31] TANG Y Y, SHENG J F, HE X M, et al. Novel antioxi-dant and hypoglycemic water-soluble polysaccharides from jasmine tea[J]. Foods, 2021, 10(10): 2375.

[32] XU X Q, CHEN A J, GE X Y, et al. Chain conformation and physicochemical properties of polysaccharide (glucuronoxylomannan) from fruit bodies of Tremella fuciformis[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 245: 116354.

[33] XU Y, FILICE C T, LEONENKO Z. Protective effect of trehalose sugar on amyloid-membrane interactions using BLM electrophysiology[J]. Biophysical Journal, 2024, 123(12): 1690-1704.

[34] WANG J, LIU H D, ZHANG X, et al. Sulfated hetero-polysaccharides protect SH-SY5Y cells from H2O2-induced apoptosis by affecting the PI3K/Akt signaling pathway[J]. Marine Drugs, 2017, 15(4):110.

[35] OLASEHINDE T A, OLANIRAN A O, OKON A I. Sulfated polysaccharides of some seaweeds exhibit neuroprotection via mitigation of oxidative stress, cholinergic dysfunction and inhibition of Zn-induced neuronal damage in HT-22 cells[J]. BMC Complementary Medicine and Therapies, 2020, 20: 251.

[36] ZHAO H Y, SONG J X, WANG T, et al. Selenium nanoparticles decorated with polysaccharides from Sargassum fusiforme protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in PC12 cells and rat model of Parkinson’s disease[J]. Nanomedicine : Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2024, 59: 102755.

[37] 徐元庆, 王哲奇, 张静, 等. 岩藻多糖的抗氧化功能研究进展[J].天然产物研究与开发, 2020, 32(10): 1782-1793.XU Y Q, WANG Z Q,ZHANG J, et al. Research advance on antioxidant function of fucoidan[J]. Natural Product Research and Development, 2020, 32(10): 1782-1793.

[38] WU Y B, CHEN M Q, JIANG T L. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and drug targets via apoptotic signaling[J]. Mitochondrion, 2019, 49: 35-45.

[39] BRITTON B G, SMITH A M, PERRY G, et al. Oxidative stress treatment for clinical trials in neurodegenerative diseases[J]. Journal of Alzheimer’s Disease, 2011, 24(2): 111-126.

[40] CHEN X X, WANG X, SHEN M Y, et al. Combined RNA-seq and molecular biology technology revealed the protective effect of Cyclocarya paliurus polysaccharide on H2O2-induced oxidative damage in L02 cells thought regulating mitochondrial function, oxidative stress and PI3K/Akt and MAPK signaling pathways[J]. Food Research International, 2022, 155: 111080.

[41] XU Y, XUE M L, LI J. Fucoidan improves D-galactose-induced cognitive dysfunction by promoting mitochond-rial biogenesis and maintaining gut microbiome homeostasis[J]. Nutrients, 2024, 16(10): 1512.

[42] LEE Y Y, NA I S, KIM J E, et al. Standardization of germinated oat extracts and their neuroprotective effects against Aβ1-42 induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. Molecules, 2025, 30(15): 3291.

[43] LING Y, ZHA S J, TENTAKU M, et al. Suppressive effects of sulfated polysaccharide ascophyllan isolated from Ascophyllum nodosum on the production of NO and ROS in LPS-stimulated RAW264.7 cells[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2021, 85(4): 882-889.

Structural Characterization of Polysaccharide from Caulerpa lentilifera and Its Effect on Aβ1-42 Induced Injury in SH-SY5Y Cells

MA Guanyun1, LI Yu1, YIN Qianyu1, WANG Fengwu1,2,*

(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;2. Qingdao Special Food Research Institute, Qingdao 266109, China)

Abstract：In order to explore the structure of polysaccharide from Caulerpa lentilifera (CLP) and its effect on SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction, an acidic polysaccharide component, CLP-1, was obtained through the separation and purification of CLP. The monosaccharide composition, molecular mass, glycosidic bond configuration, spatial conformation and microscopic structure of CLP-1 were characterized. At the same time, an SH-SY5Y cell damage model induced by Aβ1-42 was used to study the anti-Alzheimer’s disease (AD) activity of CLP-1. The results showed that, the mass average molar mass of CLP-1 was 3.98×106 Da, and it was mainly composed of galactose, glucose, xylose, and mannose, with the molar ratio of these four components was 48.1∶1.0∶23.2∶46.1. Infrared spectroscopy analysis showed that CLP-1 had sulfate group substitution and existed in the form of pyranose. The results of nuclear magnetic resonance analysis showed that CLP-1 had two types of glycosidic bonds: α-glycosidic bonds and β-glycosidic bonds. Congo red experiment analysis showed that CLP-1 had a triple helix structure. The results of atomic force microscopy analysis showed that CLP-1 had a highly branched structure, and the results of scanning electron microscopy analysis showed that CLP-1 had a loose structure mainly consisted of spherical particles and rods-like shapes. The results of in vitro activity analysis showed that CLP-1 exhibited DPPH radical scavenging activity and suppressed Aβ1-42 aggregation. The results of cell experiments indicated that the morphology of SH-SY5Y cells pretreated with CLP-1 at a mass concentration of 0.05 mg/mL was relatively intact. The cell survival rate increased by 20.03%, the level of total antioxidant capacity increased by 56.23%, the activity of catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase increased by 63.19%, 63.48% and 65.80%. The level of malondialdehyde decreased by 22.13%, the mitochondrial membrane potential level increased by 14.80%, and the level of reactive oxygen species dropped by 24.84%. The results showed that CLP-1 had good antioxidant and anti-AD activities. The purpose of this study was to provide a theoretical reference for the development of anti-AD functional foods.

Keywords：Caulerpa lentilifera; polysaccharide structure; Alzheimer’s disease; Aβ1-42 induction; SH-SY5Y cells; cell damage

中图分类号：TS204.1; TS254.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500041

文章编号：2095-6002(2025)06-0192-14

引用格式：马官云, 李钰, 殷倩钰, 等. 海葡萄多糖结构表征及其对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):192-205. MA Guanyun, LI Yu, YIN Qianyu, et al. Structural characterization of polysaccharide from Caulerpa lentilifera and its effect on Aβ1-42 induced injury in SH-SY5Y cells [J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):192-205.

收稿日期：2025-01-21

基金项目：山东省自然科学基金面上项目(ZR2020MB101)。

Foundation: Shandong Provincial Natural Science Foundation General Project (ZR2020MB101).

第一作者：马官云,女,硕士研究生,研究方向为食品化学与功能性活性物质。

*通信作者：王凤舞,女,副教授,博士,主要从事食品化学与功能性活性物质方面的研究。

(责任编辑：叶红波)