高血压是一种常见的慢性疾病,其发生与血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)密切相关,该酶可催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ,导致血压升高[1]。目前常用ACE抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors),如卡托普利,长期使用易引发高钾血症、导致肾功能损害[2]。从鳕鱼[3]、罗非鱼皮[4]、金枪鱼[5]、南极磷虾[6]等中提取的多肽表现出了较高的ACE抑制活性。海蜇因其蛋白质含量高,也可通过酶解或发酵技术获得此类活性肽[7]。然而,ACE抑制肽在胃肠环境中易被蛋白酶降解[8],影响其稳定性与吸收效率。

目前对ACE抑制肽的研究主要集中在结构鉴定和生物活性等方面[9-10];但其体内生物利用度较低,限制了ACE抑制肽的应用。纳米粒子由于表面积大和尺寸小等独特的物理化学性质,有望作为ACE抑制肽的高效转运载体[11]。大豆分离蛋白(soybean protein isolated,SPI)富含必需氨基酸,具备良好加工性能,是潜在的天然递送材料[12]。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)和SPI乳液通过喷雾干燥和冷冻干燥工艺可制备鱼油微胶囊[13]。但天然KGM溶解性及稳定性较差,经脱乙酰化处理(DKGM)可显著改善其性能[14]。目前,关于SPI与不同脱乙酰度KGM复合纳米粒子在提高活性肽生物利用度方面的研究仍较缺乏。关于ACE抑制肽纳米粒子吸收机制的研究也甚少。Caco-2细胞模型是研究功能成分肠上皮渗透和吸收机制的常用体外工具[15-16]。Song等[17]制备的壳聚糖包被的大麦醇溶蛋白纳米粒子可穿透上皮细胞单层,且该过程呈时间与浓度依赖性。杜冉等[18]研究发现,牡蛎锌结合肽主要通过细胞旁路和转胞吞作用的方式跨Caco-2细胞模型转运。

本研究拟通过Maillard反应和自组装法制备海蜇ACE抑制肽纳米粒子,探讨SPI和不同脱乙酰度的魔芋葡甘聚糖(deacetylated konjac glucomannan,DKGM)对ACE抑制肽纳米粒子形成和稳定性的影响,同时构建Caco-2细胞模型,明确ACE抑制肽纳米粒子在Caco-2细胞模型中的转运吸收机制。研究旨在为海蜇ACE抑制肽的吸收和应用奠定基础,拓宽海蜇ACE抑制肽的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

魔芋葡甘聚糖(纯度≥98%)、大豆分离蛋白(纯度≥98%)、复合蛋白酶(120 U/mg,食品级)、碳酸钠、Gly-Pro、脱氧胆酸钠、二甲基亚砜(DMSO)、K2HPO4、异硫氰酸荧光素(FITC)、磷钨酸、透析袋(3 kDa),上海源叶生物科技有限公司;海蜇,济南海鲜大市场;人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞,武汉普诺赛生命科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),美国Sigma公司;Transwell细胞培养皿、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、青链霉素混合液(100x)、HBSS缓冲液、PBS缓冲液、细胞培养瓶,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;碱性磷酸酶试剂盒,上海Ml-bio公司;氧化苯砷,九鼎化学(上海)科技有限公司。实验用水为去离子水,所有其他试剂均为分析纯,购自国药集团。

1.2 仪器与设备

JJ-1A型电热恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器有限公司;YP10002型电子天平,上海光正医疗仪器有限公司;TDL-5-A型台式离心机,上海安亭科学仪器厂;HF90型CO2细胞培养箱、TECAN M200pro型酶标仪,瑞士帝肯公司;OS20-Pro型顶置式电子搅拌器,大龙兴创实验仪器(北京)股份公司;Millicell ERS-2型细胞电阻仪,默克生命科学技术(南通)有限公司;LC-20AT型高效液相色谱仪,日本岛津公司;BT-9300S型激光粒度分布仪,丹东百特仪器有限公司;JEM-2100F型透射电子显微镜,北京科斯仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同脱乙酰度KGM的制备

称取1.0 g KGM溶解在不同质量分数(0.5%、1.0%、2.0%)的Na2CO3溶液中,制备不同脱乙酰度(degree of deacetylation)的KGM,并命名为DKGM1(脱乙酰度为43.29%)、DKGM2(脱乙酰度为61.85%)和DKGM3(脱乙酰度为77.21%)。

1.3.2 海蜇ACE抑制肽的制备

选用新鲜海蜇进行清洗处理,以去除杂质和盐分,将海蜇切碎,使用组织匀浆机将海蜇组织打碎。取10 g匀浆样品置于30 mL蒸馏水中,用氢氧化钠(0.1 mol/L)或盐酸(0.1 mol/L)溶液调节pH值至7.6,加入复合蛋白酶(酶与海蜇匀浆样品的质量比为2.8∶100.0)于58 ℃酶解3.9 h。酶解结束后,沸水浴灭活复合蛋白酶,冷却至室温,4 000 r/min条件下离心处理15 min,收集沉淀。将离心后的样品采用分子质量为3 kDa的滤膜超滤,分别收集Mw大于3 kDa和Mw小于3 kDa的滤过部分,测定ACE抑制率。将Mw大于3 kDa的滤过部分冷冻干燥得到具有ACE抑制活性的海蜇酶解产物。

1.3.3 海蜇ACE抑制肽纳米粒子的制备

参照Auwal等[19]的方法,采用Maillard反应和自组装法制备SPI-ACE抑制肽-KGM/DKGM核壳纳米粒子(SPI-ACE-KGM/DKGM)。具体步骤:1)称量5 g SPI完全溶解于100 mL的蒸馏水中,置于转速为600 r/min的搅拌器中搅拌2 h后水化过夜(4 ℃)。2)将SPI与ACE抑制肽按照10∶1、8∶1、6∶1、4∶1和2∶1的质量比完全溶解于去离子水中,在4 ℃下孵育过夜,用0.5 mol/L NaOH溶液将SPI-ACE混合体系的pH值调节至7.4,透析袋(3 kDa)透析48 h,将透析后的样品置于-20 ℃中预冻6 h,真空冷冻干燥48 h,得到SPI-ACE粉末。3)将质量分数为2%、4%、6%、8%和10%的KGM、DKGM1、DKGM2和DKGM3的溶液与质量分数为2%的 SPI-ACE溶液混合(质量比为1∶3),在95 ℃恒温下加热搅拌1 h后迅速冷却至室温终止反应。用1 mol/L 的HCl(或NaOH)溶液调节体系pH值至7.0,即得海蜇ACE抑制肽纳米粒子,分别命名为SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3。

1.3.4 海蜇ACE抑制肽纳米粒子包载率和ACE抑制率的测定

参照Cao等[10]的方法,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)评价纳米粒子包载率。将SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3纳米粒子完全溶解于蒸馏水中,调整质量浓度为1.0 mg/mL。在3 000 r/min离心10 min后,取上清液通过0.22 μm PVDF膜过滤,然后在228 nm波长下进行HPLC分析,包载率按式(1)计算。

包载率

(1)

式(1)中,M1代表纳米粒子中ACE抑制肽包载的质量,mg;M为纳米粒子的总质量,mg。

参照Liu等[20]的方法,采用HPLC分析卡托普利、ACE抑制肽、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3纳米粒子的ACE抑制率。将样品溶液质量浓度调整为1.0 mg/mL,在3 000 r/min离心10 min后,取上清液通过0.22 μm PVDF膜过滤,然后在228 nm波长下进行HPLC分析,取等量的硼酸钠缓冲溶液(pH=8.3)代替样品作为空白对照。ACE抑制率计算见式(2)。

ACE抑制率

(2)

式(2)中,SC为对照样品的峰面积,SS为卡托普利、ACE抑制肽、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2、SPI-ACE-DKGM3纳米粒子对应的峰面积。

1.3.5 海蜇ACE抑制肽纳米粒子形态观察

参照Auwal等[21]的方法,将SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子均匀分散在超纯水中制备成质量浓度为1 mg/mL的溶液,采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察形貌。用微量移液枪取2～5 μL分散液滴在铜网上,静置2 min,用滤纸从边缘吸除多余液体,避免形成厚层或结晶盐,滴加5～10 μL质量分数为1%～2%磷钨酸溶液负染30 s,用滤纸从边缘吸干染液,自然干燥5 min。将样品置于TEM的样品台中,在200 kV的加速电压下进行形态观察。

1.3.6 海蜇ACE抑制肽纳米粒子ζ-电位、粒径和多分散性指数测定

将SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子制备成质量分数为0.1%的溶液,并使用激光粒度分布仪进行分析,该仪器采用He/Ne激光器(λ=633 nm)。根据Cao等[10]建立的方法评估纳米粒子ζ-电位、粒径和多分散性指数(polydispersity index,PDI)。测量过程中,散射光角度保持在90°,温度控制在(25±1) ℃。

1.3.7 海蜇ACE抑制肽纳米粒子稳定性测定

分别探究海蜇ACE抑制肽纳米粒子在不同温度(4、25、60、80 ℃)、不同湿度(20%、40%、60%、80%、90%)、不同pH值(2、4、6、8、10)和不同离子浓度(100、200、500、800、1 000 mmol/L的NaCl溶液)中的稳定性,测定并计算ACE抑制肽的保留率。

1.3.8 SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子体外模拟消化实验

采用人工胃液(simulated gastric fluid,SGF)和人工肠液(simulated intestinal fluid,SIF)研究SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子的体外释放行为。SGF溶液的制备[22]：称取2.0 g NaCl,溶解于900 mL蒸馏水中,用体积分数为36%的HCl调节pH值至1.2,加入3.2 g胃蛋白酶至终体积为1 000 mL,并将溶液充分混合。将0.68 g K2HPO4溶解于800 mL蒸馏水中,然后加入0.2 mol/L的NaOH制备SIF,用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节溶液pH值至6.8,加入10 g胰蛋白酶,用蒸馏水将SIF的终体积调整到1 000 mL,并将溶液保存在4 ℃以待进一步分析。

模拟胃肠道消化:准确称取500 mg的纳米粒子,均匀溶解于20 mL的SGF溶液中,置于37 ℃的恒温振荡培养箱中,以180 r/min的转速孵育1 h。模拟胃消化结束后,迅速调整pH值至7,并在相同条件下加入25 mL的SIF溶液,再孵育3 h,分别在消化0、15、30、60、90、120、180、240、300、360 min时取样分析。ACE抑制肽的累计释放率计算见式(3)。

ACE抑制肽累计释放率

(3)

式(3)中,M1为纳米粒子中ACE抑制肽包载的质量,mg;Mt为各纳米粒子在不同取样时间下的ACE抑制肽含量,mg。

模拟消化后,评估ACE抑制肽和SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子的ACE抑制率,取样时间为0、15、30、60、90、120、180、240、300、360 min,ACE抑制率的测定方法见1.3.4节。

1.3.9 Caco-2细胞模型的建立

Caco-2细胞需在含质量分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,并置于37 ℃、体积分数5% CO2的恒温培养箱中。当细胞融合度达80%～90%时,用胰酶消化并终止反应后离心,重悬计数。将细胞以6 000个/孔的密度接种于Transwell多孔膜(孔径0.4 μm)的AP侧(上腔),并预先用PBS润湿小室以改善铺展均匀性,2～3 d更换一次培养基。同时,每天观察细胞形态。

1.3.9.1 Caco-2细胞生长曲线的绘制

MTT实验常被用来检测Caco-2细胞的生长增殖情况[23]。5 mg/mL的MTT溶液的配制:准确称量250 mg MTT加入50 mL PBS溶液中,磁力搅拌直至MTT完全溶解后用0.22 μm的滤膜过滤,去除可能的细菌或杂质,将过滤后的溶液收集到无菌离心管或玻璃瓶中,然后置于4 ℃的环境下避光保存备用。Caco-2细胞的培养:将冻存的Caco-2细胞复苏,接种到96孔板中,培养至细胞贴壁,在接种后的第3、5、7、9、12、15、18、21天后分别取3孔细胞,移除培养液后用PBS缓冲液冲洗1遍,弃去PBS后加入30 μL MTT溶液和270 μL无血清培养基,置于培养箱中继续孵育4 h,终止培养,弃上清液。然后加入300 μL DMSO溶解甲臜结晶,轻轻吹打混匀,取200 μL转移至新的96孔板中,置于振荡器上振荡10 min以保证混合均匀,用酶标仪于波长490 nm处检测OD值,记录结果。以时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3.9.2 Caco-2细胞模型跨膜电阻测定

通过测量跨上皮细胞电阻(transepithelium electrical resistance,TEER)来评估Caco-2细胞的融合完整性。参考Dahley等[24]的报道,将Caco-2细胞接种在Transwell插入式培养皿中,密度为6 000个/孔,根据欧姆定律,使用细胞抗性仪测定Caco-2细胞单层的TEER。测量电阻前,将电极浸泡在体积分数75%乙醇中15 min,然后用酒精棉球擦干电极,然后将电极置于含质量分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中15 min,再将电极两端垂直插入 Transwell 孔板中,分别测定空白孔和样品孔,平行测量3次,取平均值,TEER(Ω/cm2)计算见式(4)。

(4)

式(4)中,TEER1为Caco-2细胞电阻值,Ω;TEER2为空白(无细胞)电阻值,Ω;S为细胞培养板膜的面积,cm2。

1.3.9.3 Caco-2细胞模型通透系数测定

将异硫氰酸荧光素完全溶解于HBSS溶液中,配制成2 mg/mL的荧光黄母液,按梯度稀释后置于485 nm波长测定荧光强度,以吸光度(OD值)为纵坐标,溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线。按照1.3.9节方法培养Caco-2细胞,当在显微镜下观察到细胞铺满培养瓶底面的80%时,按照密度6 000个/孔接种于Transwell细胞培养板(图1)上,孔板的小室顶端侧(AP侧)加入0.5 mL的HBSS溶液,基底侧(BL侧)加入完全培养基1.5 mL,放入培养箱中培养。在接种细胞后的一周内隔天更换AP侧和BL侧的完全培养基(分别为0.5、1.5 mL),第8天开始每天换液,接下来测量被动扩散标志物荧光黄的表观渗透系数(apparent permeability,Papp)从而检测Caco-2细胞单层的通透性[25]。Papp计算见式(5)。

(5)

式(5)中,dQ/dt为单位时间内物质通过细胞的速率或通过膜的物质转移量,μmol/s;C0为供体室初始质量浓度,μg/mL;A为Transwell膜表面积,cm2。

1.3.10 Caco-2细胞生长分化特征测定

Caco-2细胞在从隐窝迁移到绒毛顶端的过程中发生分化,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达水平和活力会增加,可以通过检测Caco-2细胞膜两侧培养液(AP侧和BL侧)及细胞内的ALP活性来观察细胞培养过程中的分化特征[26]。分别在Caco-2细胞培养后第3、6、9、12、15、18、21天,收集AP侧和BL侧的培养液,按照ALP试剂盒说明书检测培养液中ALP活力,结果以金单位表示(在37 ℃下,100 mL待测样品与显色底物反应15 min,产生1 mg苯酚作为金单位)。同时计算两侧细胞培养液中的碱性磷酸酶活力比值(AP/BL)。

1.3.11 不同质量浓度SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子作用下Caco-2细胞存活率的测定

取对数生长期的Caco-2细胞接种在96孔板上,密度约为6 000个/孔,每孔加入150 μL的细胞悬浮液,置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h后,弃去上清液,加入一系列含量梯度的SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子溶液,每孔均加入150 μL,同时设置空白对照组,每组均设置6个平行实验。待24 h后,每孔中再加入5 mg/mL的20 μL MTT溶液,间隔4 h后,弃去上清液,每孔均加入150 μL的DMSO,振荡10 min后,于酶标仪中读取每孔的OD值,检测波长为490 nm。根据OD值按式(6)计算细胞存活率(cell survival rate,CSR)。

细胞存活率

(6)

式(6)中,OD1为纳米粒子组的吸光度;OD2为空白对照组的吸光度;OD3为培养基的吸光度。

1.3.12 SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子在Caco-2细胞中转运效果测定

取对数生长期的Caco-2细胞,并从AP-BL和BL-AP两侧进行SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子转运实验(图2)。当Transwell板上的Caco-2细胞荧光黄的Papp小于1.0×10-6 cm/s时,即可进行细胞转运实验研究。用pH=7.4的HBSS溶液清洗细胞3次,在第3次洗涤时将细胞置于37 ℃的细胞培养箱中共同培养15 min,然后将各孔内的HBSS溶液吸净。AP侧到BL侧的转运:将0.5 mL样品加入AP侧作为供给池,同时BL侧加入1.5 mL空白HBSS作为接收池。BL侧到AP侧的转运:将1.5 mL样品加入BL侧作为供给池,AP侧加0.5 mL空白HBSS作为接收池。每次测定时分别取样150 μL,同时相应地补加37 ℃的150 μL空白HBSS溶液,进行3次平行实验取平均值。样品中ACE抑制肽的含量通过HPLC进行检测[27]。

1.3.13 SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子在Caco-2细胞单层中转运途径测定

根据Yang等[28]的方法,采用肽转运载体竞争性抑制剂10 μmol/L Gly-Pro、内吞抑制剂25 μmol/L氧化苯砷和旁路转运促进剂100 μmol/L脱氧胆酸钠研究SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子的转运途径。当Transwell板上的Caco-2细胞荧光黄的Papp小于1.0×10-6 cm/s时,即可进行细胞转运实验研究。实验步骤按1.3.12节进行,平行实验3次取平均值。参考1.3.4节对样品中ACE抑制肽的含量进行检测。同时参照1.3.9.2节测定TEER值。

1.4 数据处理

实验均进行3次取平均值,采用SPSS 25.0对实验数据统计分析,结果表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s法多重比较分析各组的差异显著性,其中P<0.05代表显著性差异,用Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 海蜇ACE抑制肽纳米粒子的构建结果分析

SPI与ACE抑制肽质量比对海蜇ACE抑制肽核壳纳米粒子包封率的影响见图3。由图3(a)可知,当KGM、DKGM1、DKGM2和DKGM3的质量分数固定为4%时,纳米粒子的包封率在SPI与ACE抑制肽比例为8∶1时最高。SPI分子吸附在纳米粒子表面,可形成保护层,改善其生物相容性和靶向性,减少粒子间的相互作用,推测在ACE抑制肽中添加SPI能提高纳米粒子的包封率[29]。当SPI与ACE抑制肽比例升至8∶1时,SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3纳米粒子的包封率分别为(78.96±1.39)%、(85.41±2.08)%、(87.69±3.56)%和(80.11±2.11)%,其中SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的包封率显著高于其他3种纳米粒子。因此可以确定SPI与ACE抑制肽优化质量比为8∶1。由图3(b)可知,DKGM2的质量分数达到6%时,SPI-ACE-DKGM2的包封率由71.87%提高到(92.34±2.08)%;且粒径最小,仅为(213.45±10.32) nm,显著低于其他3种纳米粒子。说明此时ACE抑制肽已被包埋进脂质纳米粒子中,DKGM2的添加降低了纳米粒子的粒径。因此选择添加6%的DKGM2作为构建海蜇ACE抑制肽纳米粒子的原料。综合可知,海蜇ACE抑制肽核壳纳米粒子的最终配方为SPI与ACE抑制肽质量比为8∶1,DKGM2的质量分数为6%,此时ACE抑制肽核壳纳米粒子最大包封率为(92.34±2.08)%,粒径为(213.45±10.32) nm。

2.2 海蜇ACE抑制肽纳米粒子包载率和ACE抑制率分析

包载率是评价纳米粒子性能的关键参数。SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子的包载率和ACE抑制率见表1。结果表明,SPI-ACE-DKGM核壳纳米粒子的包载率优于SPI-ACE-KGM纳米粒子。由表1可知,SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的包载率最高,为(9.76±0.14)%,而SPI-ACE-KGM纳米粒子的包载率仅为(4.38±0.11)%。此外,SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子的ACE抑制率也最高。由此可知,纳米粒子的包载率随着KGM的脱乙酰化程度的增加而增加,这主要是由于乙酰化反应,糖环上的羟基逐渐被乙酰基取代,从而增强了疏水性,这种增加的疏水性有助于在分子结构内包封疏水性ACE抑制肽。该结果与Fan等[30]的前期研究有明显的相似之处,这也表明适度脱乙酰化的DKGM可以促进具有SPI的凝胶网络结构更加有序和致密。本研究以DKGM2作为ACE抑制肽的载体。随着不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

KGM脱乙酰化程度的提升,KGM的分子结构变得更加有组织,增强了结构的稳定性。此外,分子间作用力和疏水相互作用也均增强,促进了蛋白质分子的交联,形成内部网络结构,从而提高了包载率。然而,DKGM1和DKGM3的核壳纳米粒子的包载率和ACE抑制率均低于DKGM2纳米粒子。这种差异可能是因为DKGM1对乙酰基的去除较少,导致其与SPI的相互作用不完全,影响了纳米粒子的形成;而在DKGM3中,强疏水相互作用导致蛋白质快速聚集,最终降低了纳米粒子的包载率。

2.3 海蜇ACE抑制肽纳米粒子微观形貌分析

图4为SPI-ACE共聚物、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子的透射电子显微镜图。由图4可知,所有粒子都接近球形,但是不同样品的微观结构有显著差异。由图4(a)可知,SPI-ACE共聚物呈现球形形态,没有观察到明亮的白色;图4(b)～图4(e)均证实了ACE抑制肽被成功包裹并形成了核壳结构,其中核(浅灰色)被致密的壳(深灰色层)包裹。然而,图4(b)中核的一部分被染成黑色,表明纳米粒子的外观不规则;相比之下,图4(c)和图4(d)纳米粒子呈现出较白的颜色,这是由于DKGM1和DKGM2相对较低的分子质量利于形成紧密交联的外核,使得磷钨酸盐更难以将核心负染成黑色。此外,图4(e)显示,纳米粒子完全被染成黑色,表明DKGM3的分子质量较低,导致外核密度不够,多糖片段分布在核壳纳米粒子中,这一现象与之前的报道结果一致[31]。

2.4 海蜇ACE抑制肽纳米粒子ζ-电位、粒径和PDI分析

ζ-电位是评估分散体系稳定性的关键参数,主要用来表征纳米粒子之间的相互作用。通常,较高的ζ-电位绝对值与系统稳定性的增加有关。SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子的ζ-电位值见表2。DKGM的加入增强了纳米粒子体系内的静电斥力,从而提高了其稳定性。此外,SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子的ζ-电位值为(-32.76±1.09)mV,其绝对值显著高于其他纳米粒子,表明该纳米粒子体系具有优异的稳定性。这些发现与Wu等[32]的研究结果一致,该研究表明,ACE抑制肽可中和SPI的正电荷,使蛋白质上正电荷的暴露减少,带负电荷的蛋白质比例增加,而DKGM2的加入促进了蛋白质与DKGM2带电表面的相互作用,最终通过静电吸附形成聚集体。

平均粒径对纳米粒子体系的稳定性有显著影响。一般来说,平均粒径越小,且PDI<0.5表明纳米粒子分布越均匀,纳米凝胶体系的稳定性越强。由表2可知,SPI-ACE-DKGM纳米粒子粒径小于SPI-ACE-KGM的粒径,其中SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子粒径最小,为(213.45±1.87)nm。结果表明ACE抑制肽被成功包埋SPI-DKGM2中。PDI数据表明,SPI自身体系是不稳定的,而加入ACE抑制肽和DKGM后,纳米粒子的粒径和PDI均有一定程度的降低。根据文献报道可知,在中性pH值条件下,DKGM和SPI之间带正电的区域可以通过静电吸引形成化合物,从而表现出优异的乳化性能[33]。

2.5 海蜇ACE抑制肽纳米粒子稳定性分析

ACE抑制肽易受温度和湿度的影响,这是因为高温环境会破坏肽的化学键,导致结构改变或降解;而高湿度环境则会加速ACE抑制肽的水解和氧化,导致其活性降低。海蜇ACE抑制肽纳米粒子的稳定性见图5。由图5(a)和图5(b)可知,随着温度和湿度分别逐渐升高到80 ℃和90%,游离的ACE抑制肽的保留率仅为(32.43±1.72)%和(38.76±0.65)%;而SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的ACE抑制肽保留率为(83.24±2.52)%和(85.45±1.76)%,约是游离ACE抑制肽的2.5倍,且显著高于SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1和SPI-ACE-DKGM3纳米粒子中ACE抑制肽的保留率。结果表明,SPI和DKGM2的添加能提高ACE抑制肽纳米粒子的热稳定性和湿度稳定性。这可能是因为DKGM2的加入使纳米粒子的整体结构更加紧密,降低了ACE抑制肽因温度和湿度影响而发生降解的概率。同样地,You等[34]通过酶解制备得到了新型贻贝源性ACE抑制肽,发现ACE抑制肽在光照和潮湿环境中也容易发生分解。

由图5(c)和图5(d)可知,当溶液pH值为2～10时,ACE抑制肽纳米粒子的ACE抑制肽保留率均在pH值为8时达到最大;当pH值增加至10时,ACE抑制肽的保留率则显著降低。这可能是由于溶液中H+的增加降低了粒子之间的静电作用力,从而导致纳米粒子发生聚集;而游离ACE抑制肽的保留率在pH值的影响下显著低于纳米粒子的ACE抑制肽保留率,表明ACE抑制肽纳米粒子具有良好的pH稳定性。而在NaCl溶液中,随着NaCl溶液浓度逐渐升高,SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的ACE抑制肽保留率均未发生明显变化,而游离ACE抑制肽的保留率则显著降低。当NaCl浓度达到1 000 mmol/L时,ACE抑制肽的保留率仅为(46.57±1.21)%,显著低于SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的ACE抑制肽保留率[(88.43±1.11)%]。这表明ACE抑制肽纳米粒子具有良好的pH和离子稳定性。Qu等[35]研究发现,玉米ACE抑制肽纳米粒子能够提高ACE抑制肽在不同pH值中的稳定性。因此,在食品或药物开发中,需综合考虑pH值、盐浓度、温度和湿度等因素,以保持纳米粒子的稳定性。

2.6 SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子体外模拟消化分析

ACE抑制肽、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子在体外模拟胃液和肠液中的释放率和ACE抑制活性如图6。由图6(a)可知,SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子的释放率在前100 min较低,这可能是因为SPI-ACE-KGM/DKGM纳米粒子具有疏水性,且SGF中缺乏KGM特异性降解酶,从而阻止了KGM/DKGM的降解。因此,ACE抑制剂肽在模拟胃环境中未被释放。暴露于肠液后,β-甘露聚糖酶的存在促进了KGM/DKGM的特异性降解。在100 min后,随着时间的推移,纳米粒子的释放速率逐渐增加,表明肠液可以有效降解KGM/DKGM。此外,这也进一步证实了乙酰化修饰不会改变KGM对β-甘露聚糖酶降解的易感性,与Chokboribal等[36]的研究结果一致。这是因为在乙酰化修饰过程中,乙酰基仅仅取代了KGM糖环上的羟基,而不影响糖苷键的完整性。

SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子在SGF中的累计释放率为21.33%,在pH值为7.0时快速释放。随着SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的降解,ACE抑制肽被释放到SIF中,300 min后释放率为83.11%。结果表明,在低pH值(pH=2)条件下,SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子在SGF中的释放缓慢;而在pH=7时,ACE抑制剂肽的释放效率显著增加。这种变化可能归因于ACE抑制肽与DKGM2在不同pH值水平下静电相互作用强度的差异。在pH值为2时,带正电的多肽与带负电的DKGM2之间存在强烈的静电吸引,有利于多肽在SPI-DKGM2水凝胶网络内的滞留,抑制其扩散;相反地,当pH值为7时,阳离子多肽与带负电荷的DKGM2之间发生静电斥力,从而促进多肽从纳米粒子网络中释放。由此可见,SPI-DKGM2对ACE抑制肽具有缓释作用,增强了其在胃肠道内的稳定性,也在一定程度上提高了其生物利用度。

图6(b)显示了游离ACE抑制肽、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子在体外胃肠消化模拟过程中ACE抑制率的变化。结果表明,游离ACE抑制肽与核壳纳米粒子胃肠消化初始时的ACE抑制率无显著差异(P>0.05)。然而,在模拟肠液中消化后,游离的ACE抑制肽在胃蛋白酶的作用下进一步水解,由于肽的结构改变,导致其ACE抑制率迅速下降。这一观察结果与Chanajon等[37]的研究结果一致,该学者发现,在体外胃肠模拟消化后,ACE抑制肽序列中存在精氨酸或赖氨酸残基可能导致ACE抑制活性降低。与游离ACE抑制肽相比,SPI-ACE-DKGM2纳米粒子对ACE抑制肽具有明显的保护作用,特别是在模拟胃液环境中,纳米粒子显著降低了对ACE抑制肽活性的影响。在模拟肠液中,ACE抑制率逐渐降低。模拟消化300 min后, SPI-ACE-DKGM2的ACE抑制率比游离ACE抑制肽的抑制率高64.28%,表明SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子在胃肠道环境中能够更有效地保持ACE抑制肽的生物活性,且与SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1和SPI-ACE-DKGM3这3种核壳纳米粒子相比,SPI-ACE-DKGM2纳米粒子在肠道中的抑制率显著增强。

2.7 Caco-2细胞模型的表征

2.7.1 细胞生长特性分析

不同浓度Caco-2细胞生长曲线见图7。由图7(a)可知,当细胞生长到10 d时,细胞缓慢融合,且能观察到均匀致密的单细胞层,这表明Caco-2单层细胞模型建立成功。不同浓度Caco-2细胞生长曲线见图7(b)。按照4 000、6 000、8 000、10 000个/孔的细胞密度接种在48孔板上培养至21 d后发现,密度为 6 000个/孔的细胞生长状态较其他密度的细胞好;4 000个/孔的细胞由于密度较低,生长状态较其他3个密度的细胞差。接种6 d后,6 000、8 000、10 000个/孔的细胞均呈快速生长融合的状态,OD值显著增大。接种9 d时,6 000、8 000个/孔的细胞OD值开始下降,说明这2个密度的细胞分化已接近饱和;接种15 d后,OD值降低更快,说明Caco-2细胞已停止继续增殖。6 000个/孔的细胞OD值在12 d达到峰值。此外,Caco-2细胞生长速度比较缓慢,且在培养过程中对营养素的要求较高,为了后续转运实验的精确度,必须保证细胞活力处于较高的水平,因此,选择 6 000个/孔的细胞浓度进行后续实验。

2.7.2 细胞模型紧密性与完整性分析

不同时间Caco-2细胞模型跨膜电阻水平见图8。Caco-2细胞单层模型在培养过程中TEER值的变化如图8(a)。Caco-2细胞单层完整性与TEER值存在显著相关性,如果细胞未形成单层,TEER值会显著降低[38-39]。由图8(a)可知,前6 d TEER值增长缓慢,6 d后TEER值增长较快;12 d时,该细胞单层的TEER值超过400 Ω·cm2;13～18 d时,TEER值呈缓慢上升趋势,最终达到649.08 Ω·cm2左右。18 d后,TEER值不再增长;20 d时TEER值稳定在640 Ω·cm2左右。这些变化说明,Caco-2细胞单层膜完整性好,细胞间连接紧密。由图8(b)可知,Caco-2细胞在培养18 d后的TEER平均值均高于培养16 d和20 d。

2.7.3 细胞模型通透系数分析

结合2.1节和2.2节实验结果,选择6 000个/孔的浓度接种细胞并培养18 d后进行通透系数研究,结果见表3。根据1.3.9.3节方法得到的荧光黄标准曲线为y=0.404x+0.020 7,R2=0.999 6。将荧光黄溶液加入Caco-2细胞后于90 min和120 min分别检测荧光强度,根据标准曲线计算可得Papp值分别为(0.087±0.012)×10-6 cm/s和(0.132±0.034)×10-6 cm/s,均低于通透性实验规定的5.0×10-7 cm/s[40]。结果表明,Caco-2细胞在Transwell板中培养18 d后,已经形成了完整的单细胞层,可用于后续的转运实验研究。

2.7.4 细胞生长分化特征分析

ALP是Caco-2细胞分泌的肠道细胞特异性酶中的代表性酶,是肠上皮细胞刷状边界的重要标记酶,可用于衡量肠上皮细胞的分化程度,反映其主要功能性状[41-42]。Caco-2细胞单层AP侧、BL侧、细胞内碱性磷酸酶活性见表4。由表4可知,随着时间的逐渐延长,AP侧和BL侧的ALP活性均增大,其中AP侧的ALP活性在15 d后,呈现平稳趋势。21 d的ALP活性为第3天的5.45倍;而BL侧21 d的ALP活性仅为AP侧第3天的2倍。通过分析AP/BL的数值也可以看出,随着时间延长至21 d,AP/BL的数值由第3天的0.97±0.05增加至5.51±0.23。这说明碱性磷酸酶在细胞内的空间分布极不对称,这一现象是细胞生长分化为具有极性的单层上皮细胞的明确标志。此类分化成熟的细胞建立了完整的物质转运体系,其膜上特异性表达了碱性磷酸酶等关键功能蛋白,以执行定向的物质运输与摄取功能。

2.8 海蜇ACE抑制肽纳米粒子对Caco-2细胞的影响

2.8.1 对Caco-2细胞存活率的影响

采用MTT法考察SPI-ACE-DKGM核壳纳米粒子的剂量范围,Caco-2细胞存活率见图9。由图9可知,随着SPI-ACE-DKGM核壳纳米粒子质量浓度的增加,Caco-2细胞存活率先升高到一定值然后逐渐降低。结果显示,当添加量为200 μg/mL,SPI-ACE-DKGM核壳纳米粒子与Caco-2细胞孵育24 h后,存活率大于90%,没有显著的细胞毒性(P>0.05)。因此,在Caco-2细胞的转运实验时,选择SPI-ACE-DKGM核壳纳米粒子质量浓度为200 μg/mL。

2.8.2 在Caco-2细胞中的转运效果分析

基于Caco-2细胞单层模型的SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的Papp,与该纳米粒子在体内的吸收效率有很好的相关性。因此,Papp值反映了该物质在肠内的吸收水平。结合2.5节实验结果,基于Caco-2细胞活力,所有SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的转运研究均采用相同的无毒质量浓度(200 μg/mL),从而降低不同核壳纳米粒子质量浓度依赖效应造成的误差。SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的Caco-2细胞模型转运时效关系见图10。图10(a)和图10(b)显示了200 min内ACE抑制肽、SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3核壳纳米粒子从AP侧到BL侧、BL侧到AP侧的ACE抑制肽含量。在AP-BL和BL-AP的转运过程中,随着时间的延长,ACE抑制肽和4种纳米粒子的转运量在0～120 min均呈现不断增加的趋势。90～120 min时,ACE抑制肽转运量缓慢增加,出现饱和现象,特别是在BL-AP侧转运过程中;但AP-BL侧没有出现明显的饱和现象。当时间延长至150 min后,AP-BL侧的转运量达到饱和状态,这可能是由于活性载体饱和造成的,表明主动运输和被动转运同时存在。结果表明,SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子是可以被吸收的,这与Wu等[43]的研究结果一致。同样地,Dou等[44]将壳聚糖修饰的纳米粒子与Caco-2细胞孵育,研究其吸收和运输过程。结果发现,修饰后的纳米粒子通过网格蛋白介导的作用进行转运,从侧面验证了本研究结果。此外,BL-AP侧的转运速率显著低于AP-BL侧的转运速率,表明纳米粒子的转运具有方向性,且受到转运蛋白的外排作用。比较2个方向的ACE抑制肽转运量可以发现,Caco-2细胞单层对SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的吸收作用大于外排作用。

王颖等[45]研究了多种成分在Caco-2细胞和人空肠中的吸收情况,结果发现吸收率为0～100%的物质在Caco-2细胞中的Papp值为5×10-8～5×10-5 cm/s。本研究发现,SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在Caco-2细胞单层中双向转运的Papp值均在5×10-8～5×10-5 cm/s,因此,该结果表明在Caco-2细胞中的研究结果可以预测SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在肠道中的吸收机制。SPI-ACE-KGM核壳纳米粒子双向转运的表观渗透系数见表5。由表5可知,在AP-BL和BL-AP这2个方向的Papp均大于1.0×10-6 cm/s,且存在显著差异(P<0.05),表明SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在人体肠道中具有较好的吸收特性。此外,AP-BL和BL-AP两侧的Papp值之比大于1.5,说明SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的分泌速率远大于吸收速率,这也进一步说明了SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在Caco-2细胞运输过程中存在能量消耗的主动运输,如内吞作用[46]。

在同一时间内,由AP-BL侧,SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在Caco-2细胞单层模型上的转运量显著高于ACE抑制肽,且在120 min时的Papp也显著高于后者,其中SPI-ACE-DKGM2的转运量最高,Papp值最大。这是由于DKGM2作为纳米粒子的包埋材料,对ACE形成的保护作用显著优于KGM、DKGM1和DKGM3对ACE的保护作用,降低了消化道中蛋白酶对纳米粒子的降解水平,从而有效提高了ACE在人体消化系统中的吸收效果。经过SPI-DKGM2的包埋,可能通过其载体靶向介导途径,实现核壳纳米粒子吸收效率的提高[47-49]。

2.8.3 在Caco-2细胞单层中的转运途径分析

细胞旁路转运、跨膜转运和肽载体介导的主动转运是物质通过细胞膜或细胞间连接的3种主要方式。细胞旁路转运不依赖于细胞膜上的载体或通道蛋白,而是通过细胞间的空隙进行;跨膜转运中,大多数极性分子和离子不能自由通过,需要特定的机制来完成跨膜转运;而肽载体介导的主动转运则是指特定的小肽等通过肽载体蛋白(如PEPT1、PEPT2)逆浓度梯度转运,该过程需要消耗能量[50-52]。抑制剂或刺激剂通常被用于研究转运机制,其中Gly-Pro常被作为抑制剂来研究其转运载体的作用;抑制剂氧化苯砷可抑制物质在跨细胞过程中的内吞作用;脱氧胆酸钠则是旁路转运启动子,可改变细胞间紧密连接的程度,从而增强旁路转运的通透性[53]。因此,本研究采用肽转运载体竞争性抑制剂Gly-Pro(10 μmol/L)、内吞抑制剂氧化苯砷(25 μmol/L)和旁路转运促进剂脱氧胆酸钠(100 μmol/L)探讨SPI-ACE-KGM/DKGM2核壳纳米粒子的转运途径,结果见图11。Gly-Pro和氧化苯砷对ACE抑制肽的转运无显著影响,而脱氧胆酸钠属于胆酸盐类的吸收促进剂,溶解磷脂的能力较强,具有增强旁路转运能力的作用。由图11(a)可知,脱氧胆酸盐显著地促进了ACE抑制肽在Caco-2细胞单层的转运,这表明ACE抑制肽在Caco-2细胞单层的转运以细胞旁路转运为主。

SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的转运途径研究结果表明,纳米粒子主要通过细胞旁路转运和内吞方式提高ACE抑制肽的转运速率。与游离ACE抑制肽相比,SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在Caco-2细胞模型中的转运量显著增加,其中SPI-ACE-DKGM2的转运量最大。这可能得益于DKGM2在小肠上受体的介导作用,为活性负载物的高效吸收提供了一条有效的途径。同样地,已有研究表明,铁蛋白在小肠上皮细胞上有专一的受体,其吸收过程依赖集合蛋白2(AP-2)亚基μ2的受体运载,可以完整形式通过AP-2受体介导并被直接吸收,进而转运至细胞内部[54]。由图11(b)可知,将游离ACE抑制肽与Caco-2单层细胞模型一起孵育后,TEER值几乎没有降低。与游离ACE抑制肽的TEER值相比,SPI-ACE-DKGM2核壳纳米粒子可以在Caco-2单层细胞模型中进行有效转运并显著降低TEER值。经过继续培养,Caco-2单层细胞模型的TEER值可逐渐恢复。由此再次证明,SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子的转运以细胞旁路转运为主。

3 结 论

本研究以不同脱乙酰度的KGM(DKGM1、DKGM2和DKGM3)与SPI为原料,制备负载海蜇ACE抑制肽的纳米粒子(SPI-ACE-KGM、SPI-ACE-DKGM1、SPI-ACE-DKGM2和SPI-ACE-DKGM3)。这些纳米粒子在不同温度、湿度、pH值和离子浓度条件下均具有良好的稳定性,能够透过Caco-2细胞,其转运方式主要是细胞旁路转运。SPI-ACE-KGM/DKGM核壳纳米粒子在Caco-2细胞模型中的转运量较游离ACE抑制肽显著增加,其中SPI-ACE-DKGM2纳米粒子的包封率最大、粒径最小、转运量最大,Papp值最高。研究结果表明,ACE抑制肽核壳纳米粒子在Caco-2细胞单层模型中具有良好的吸收特性,可为ACE抑制肽类功能食品的吸收机制研究和产业化应用提供理论参考。

参考文献：

[1] DUAN X J, DONG Y F, ZHANG M, et al. Identification and molecular interactions of novel ACE inhibitory peptides from rapeseed protein[J]. Food Chemistry, 2023, 422: 136085.

[2] GAO D D, ZHANG F M, MA Z R, et al. Isolation and identification of the angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from cottonseed protein: optimization of hydrolysis conditions[J]. International Journal of Food Properties, 2019, 22(1): 1296-1309.

[3] VILDMYREN I, OTERHALS Å, LEH S, et al. Intake of residuals from Atlantic cod attenuated blood pressure increase but did not delay development of kidney damage in obese Zucker fa/fa rats[J]. Food &Nutrition Research, 2022, 66: 66.

[4] DONG Y, YAN W, ZHANG Y Q, et al. A novel angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from Tilapia skin：preparation, identification and its potential antihypertensive mechanism[J]. Food Chemistry, 2024, 430: 137074.

[5] WANG S, ZHANG L, WANG H, et al. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the tuna (Thunnus thynnus) muscle: screening, interaction mechanism and stability[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 279: 135469.

[6] ZHAO Y Q, ZHANG L, TAO J, et al. Eight antihypertensive peptides from the protein hydrolysate of Antarctic krill (Euphausia superba): isolation, identification, and activity evaluation on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)[J]. Food Research International, 2019, 121: 197-204.

[7] MOHAN PRAKASH R L, RAVI D A, HWANG D H, et al. Identification of new angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides isolated from the hydrolysate of the venom of Nemopilema nomurai jellyfish[J]. Toxins, 2024, 16(9): 410.

[8] ZHU Q N, XUE J W, WANG P, et al. Identification of a novel ACE inhibitory hexapeptide from Camellia seed cake and evaluation of its stability[J]. Foods, 2023, 12(3): 501.

[9] CAO S N, HAO J, WANG Y Z, et al. Chitosan-coated nanoliposomes for the enhanced stability of walnut angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide[J]. Journal of Food Science, 2023, 88(5): 2130-2140.

[10] SITANGGANG A B, PUTRI J E, PALUPI N S, et al. Enzymatic preparation of bioactive peptides exhibiting ACE inhibitory activity from soybean and velvet bean: a systematic review[J]. Molecules, 2021, 26(13): 3822.

[11] SONG W T, FU J X, ZENG Q, et al. Improving ACE inhibitory activity of hazelnut peptide modified by plastein: physicochemical properties and action mechanism[J]. Food Chemistry, 2023, 402: 134498.

[12] FANG Z, CAI X X, WU J L, et al. Effect of simultaneous treatment combining ultrasonication and pH-shifting on SPI in the formation of nanoparticles and encapsulating resveratrol[J]. Food Hydrocolloids, 2021, 111: 106250.

[13] BABU A, SHAMS R, DASH K K, et al. Protein-polysaccharide complexes and conjugates: structural modifications and interactions under diverse treatments[J]. Journal of Agriculture and Food Research, 2024, 18: 101510.

[14] YE S X, ZONGO A W, SHAH B R, et al. Konjac glucomannan (KGM), deacetylated KGM (da-KGM), and degraded KGM derivatives: a special focus on colloidal nutrition[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(44): 12921-12932.

[15] ZHENG M Y, ZHANG W J, LU S M. The characterization of the pectin/alginate nanoparticle for encapsulation of hydroxypropyl-β-cyclodextrin-complexed naringin and its effects on cellular uptake and oxidative stress in Caco-2 cells[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 263: 130398.

[16] KAYA-TILKI E, ÖZTÜRK A A, ENGÜR-ÖZTÜRK S, et al. Enhanced anti-angiogenic effects of aprepitant-loaded nanoparticles in human umbilical vein endothelial cells[J]. Scientific Reports, 2024, 14: 19837.

[17] SONG H D, HE A J, GUAN X, et al. Fabrication of chitosan-coated epigallocatechin-3-gallate (EGCG)-hordein nanoparticles and their transcellular permeability in Caco-2/HT29 cocultures[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 196: 144-150.

[18] 杜冉, 陈忠琴, 谭明堂, 等. 牡蛎锌结合肽的稳定性及其跨Caco-2细胞模型的吸收转运机制[J]. 广东海洋大学学报, 2024, 44(3): 103-111.DU R, CHEN Z Q, TAN M T, et al. Stability of oyster zinc-binding peptides and their mechanism of absorption and transport across Caco-2 cell monolayers[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2024, 44(3): 103-111.

[19] AUWAL S M, GHANISMA S B M, SAARI N. Optimization, physicochemical stability and in vivo study of alginate-chitosan composites as nanocarriers for low mole-cular weight angiotensin I-converting enzyme (ACE)-inhibitory peptide[J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2024, 32(3): 358-370.

[20] LIU S, LUO X Y, LIU S Y, et al. Acetazolamide-loa-ded pH-responsive nanoparticles alleviating tumor acidosis to enhance chemotherapy effects[J]. Macromolecular Bioscience, 2019, 19(2): 1800366.

[21] AUWAL S M, ZAREI M, TAN C P, et al. Enhanced physicochemical stability and efficacy of angiotensin I-converting enzyme (ACE)-inhibitory biopeptides by chitosan nanoparticles optimized using Box-Behnken design[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 10411.

[22] XIE H J, LIU C Z, GAO J, et al. Fabrication of zein-lecithin-EGCG complex nanoparticles: characterization, controlled release in simulated gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry, 2021, 365: 130542.

[23] PANSE N, GERK P M. The caco-2 model: modifications and enhancements to improve efficiency and predictive performance[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2022, 624: 122004.

[24] DAHLEY C, BÖCKMANN T, EBERT A, et al. Predicting the intrinsic membrane permeability of Caco-2/MDCK cells by the solubility-diffusion model[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2024, 195: 106720.

[25] JANSSEN A W F, DUIVENVOORDE L P M, BEEKMANN K, et al. Transport of perfluoroalkyl substances across human induced pluripotent stem cell-derived intestinal epithelial cells in comparison with primary human intestinal epithelial cells and Caco-2 cells[J]. Archives of Toxicology, 2024, 98(11): 3777-3795.

[26] ZHANG Z D, TAO Q, QIN Z, et al. Uptake and transport of naringenin and its antioxidant effects in human intestinal epithelial Caco-2 cells[J]. Frontiers in Nutrition, 2022, 9: 894117.

[27] SU Y C, CHEN S C, SHEN J S, et al. Screening and molecular mechanisms of novel ACE-inhibitory peptides from Gracilariopsis lemaneiformis[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(23): 14850.

[28] YANG Y J, WANG B, LI B. Structural requirement of casein peptides for transcytosis through the Caco-2 cell monolayer: hydrophobicity and charge property affect the transport pathway and efficiency[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(42): 11778-11787.

[29] YANG H, SU Z W, MENG X H, et al. Fabrication and characterization of Pickering emulsion stabilized by soy protein isolate-chitosan nanoparticles[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 247: 116712.

[30] FAN J W, YANG Y, LI Y J, et al. Deacetylation enhances the structure and gelation properties of konjac glucomannan/soy protein isolate cold-set gels[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 283: 137459.

[31] LIU J H, FANG C H, XU X, et al. Physico-chemical and functional properties of silver carp myosin glycated with konjac oligo-glucomannan: effects of deacetylation[J]. Food Chemistry, 2019, 291: 223-230.

[32] WU Z Z, WANG L, MA C, et al. Konjac glucomannan/xanthan gum film embedding soy protein isolate-tannic acid-iron complexes for blueberry preservation[J]. Food Hydrocolloids, 2025, 163: 111040.

[33] WENG Y, ZHANG H Y, XU S J, et al. Preparation and quality evaluation of honokiol nanoparticles using a new polysaccharide polymer as its carrier[J]. Current Drug Delivery, 2023, 20(2): 183-191.

[34] YOU Q N, SUN X P, CHEN J L, et al. Ameliorative effect of mussel-derived ACE inhibitory peptides on spontaneous hypertension rats[J]. European Journal of Nutrition, 2023, 62(7): 3097-3111.

[35] QU W J, FENG Y T, XIONG T, et al. Preparation of corn ACE inhibitory peptide-ferrous chelate by dual-frequency ultrasound and its structure and stability analyses[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2022, 83: 105937.

[36] CHOKBORIBAL J, TACHABOONYAKIAT W, SANGVANICH P, et al. Deacetylation affects the physical properties and bioactivity of acemannan, an extracted polysaccharide from Aloe vera[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 133: 556-566.

[37] CHANAJON P, HAMZEH A, TIAN F, et al. Hypotensive effect of potent angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from corn gluten meal hydrolysate: gastrointestinal digestion and transepithelial transportation modifications[J]. Food Chemistry, 2025, 462: 140953.

[38] LOPEZ-ESCALERA S, WELLEJUS A. Evaluation of Caco-2 and human intestinal epithelial cells as in vitro models of colonic and small intestinal integrity[J]. Biochemistry and Biophysics Reports, 2022, 31: 101314.

[39] 林佳丽, 刘杨洁, 韩富亮. 转运葡萄糖苷类化合物的Caco-2细胞模型建立[J]. 食品科学技术学报, 2021, 39(4): 95-103.LIN J L, LIU Y J, HAN F L. Establishment of Caco-2 cell model for transporting glucoside compounds[J]. Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(4): 95-103.

[40] TIAN D, YANG Y X, ZHANG H Y, et al. Comparison of using chamber and Caco-2 model in evaluation of intestinal absorption mechanism of compounds from diffe-rent BCS classifications[J]. Drug Metabolism and Bioanalysis Letters, 2023, 16(2): 105-112.

[41] ZHU H T L, LUO J, PENG Y, et al. Nitazoxanide protects against experimental ulcerative colitis through improving intestinal barrier and inhibiting inflammation[J]. Chemico-Biological Interactions, 2024, 395: 111013.

[42] HARAHAP I A, OLEJNIK A, KOWALSKA K, et al. Effects of daidzein, tempeh, and a probiotic digested in an artificial gastrointestinal tract on calcium deposition in human osteoblast-like Saos-2 cells[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2024, 25(2): 1008.

[43] WU S J, JIANG P, ZHANG X L, et al. Understanding the transepithelial transport and transbilayer diffusion of the antihypertensive peptide Asn-Cys-Trp: insights from Caco-2 cell monolayers and the DPPC model membrane[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(17): 9828-9841.

[44] DOU T Y, WANG J, HAN C K, et al. Cellular uptake and transport characteristics of chitosan modified nano-particles in Caco-2 cell monolayers[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 138: 791-799.

[45] 王颖, 朱淑珍, 伍邦青, 等. Caco-2细胞模型不同取样方式对药物表观渗透系数的影响[J]. 华西药学杂志, 2020, 35(4): 374-377.WANG Y, ZHU S Z, WU B Q, et al. Effects of diffe-rent sampling methods on Papp values of drugs[J]. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020, 35(4): 374-377.

[46] ZOU Y R, GAO W, JIN H Z, et al. Cellular uptake and transport mechanism of 6-mercaptopurine nanomedicines for enhanced oral bioavailability[J]. International Journal of Nanomedicine, 2023, 18: 79-94.

[47] WANG F, HANG L Y, DAI B, et al. Characterization of herpetrione amorphous nanoparticles stabilized by hydroxypropylmethyl cellulose and its absorption mechanism in vitro[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 268: 131744.

[48] PIAZZINI V, CINCI L, D’AMBROSIO M, et al. Solid lipid nano-particles and chitosan-coated solid lipid nanoparticles as promising tool for silybin delivery: formulation, characterization, and in vitro evaluation[J]. Current Drug Delivery, 2019, 16(2): 142-152.

[49] YAO X D, BUNT C, LIU M Y, et al. Enhanced cellular uptake and transport of bovine lactoferrin using pectin- and chitosan-modified solid lipid nanoparticles[J]. Pharmaceutics, 2023, 15(8): 2168.

[50] GORZKIEWICZ M, MARCINKOWSKA M, STUDZIAN M, et al. Mesalazine-PAMAM nanoparticles for transporter-independent intracellular drug delivery: cellular uptake and anti-inflammatory activity[J]. International Journal of Nanomedicine, 2023, 18: 2109-2126.

[51] ZHONG L J, CHEN S S, TANG Z J, et al. Transport of environmental natural organic matter coated silver nano-particle across cell membrane based on membrane etching treatment and inhibitors[J]. Scientific Reports, 2021, 11: 507.

[52] HUO Q Q, ZHOU J, TANG H, et al. Nanoparticle surface decoration mediated efficient protein and peptide co-encapsulation with precise ratiometric control for self-regulated drug release[J]. Nanoscale, 2023, 15(10): 5063-5073.

[53] HONG Y D, ZHANG J, ZHUANG M, et al. Efficacy of decitabine-loaded gelatinases-stimuli nanoparticles in overcoming cancer drug resistance is mediated via its enhanced demethylating activity to transcription factor AP-2 Epsilon[J]. Oncotarget, 2017, 8(70): 114495-114505.

[54] JIANG Y, ZHANG C, YUAN J H, et al. Effects of pectin polydispersity on zein/pectin composite nanoparticles (ZAPs) as high internal-phase Pickering emulsion stabilizers[J]. Carbohydrate Polymers, 2019, 219: 77-86.

Study on Storage Stability of Jellyfish ACE Inhibitory Peptide Nanoparticles and Their Transport and Absorption Mechanism in Caco-2 Cell Model

CUI Tingting1,2, YIN Aijiao1,2, ZHANG Miansong1,2, LIU Xue1,2, JIA Airong1,2,*

(1.Biology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, China;2.Shandong Provincial Marine Functional Food Technology Innovation Center, Weihai 264305, China)

Abstract：New stable nanoparticles loaded with jellyfish ACE inhibitory peptides were prepared using konjac glucomannan (KGM, DKGM1, DKGM2, and DKGM3) with varying degrees of deacetylation and soy protein isolate (SPI). Their stability under different storage conditions, and transport and absorption mechanisms in Caco-2 cell model were evaluated. The results indicated that nanoparticles loaded with jellyfish ACE inhibitory peptides (SPI-ACE-KGM, SPI-ACE-DKGM1, SPI-ACE-DKGM2 and SPI-ACE-DKGM3) were successfully prepared using KGM, DKGM1, DKGM2, DKGM3, and SPI. When the mass ratio of SPI to the ACE inhibitory peptide was 8∶1, with a mass fraction of DKGM2 at 6.0%, SPI-ACE-DKGM2 nanoparticles had the densest shell, and the encapsulation efficiency of SPI-ACE-DKGM2 nanoparticles was the highest [(92.34±2.08)%], the particle size was the smallest [(213.45±10.32) nm], and ζ-potential was (-32.76±1.09) mV. It also demonstrated good stability in environments with different temperatures, humidities, pH levels, and ion concentrations. Simulation of the digestion and absorption of nanoparticles in gastrointestinal fluid showed that SPI-ACE-DKGM2 nanoparticles had a significant protective effect on ACE inhibitory peptides. After 21 d of Caco-2 cell culture, a well-differentiated monolayer structure was formed with tight cell junctions and good monolayer membrane integrity. The activity of alkaline phosphatase on the apical side (AP side)

was significantly higher than that on the basal side (BL side), exhibiting a typical polarized epithelial cell morphology. Furthermore, ACE inhibitory peptide nanoparticles were able to penetrate the Caco-2 cell monolayer, and the transport process was time- and concentration-dependent. The apparent permeability coefficient (Papp) values for bidirectional transport across the Caco-2 cell monolayer ranged from 5×10-8 to 5×10-5 cm/s, and the ratio of Papp values between the AP-BL and BL-AP sides was greater than 1.5. Additionally, the transport of ACE inhibitory peptide nanoparticles in the Caco-2 cell monolayer primarily occurred via paracellular transport, with SPI-ACE-DKGM2 exhibiting the highest transport volume and the highest Papp value. SPI-DKGM2 could be utilized as a natural delivery carrier for ACE inhibitory peptides, and ACE inhibitory peptide nanoparticles could be effectively transported and absorbed in the intestine. This research laid a theoretical foundation for the further application of ACE inhibitory peptides.

Keywords：ACE inhibitory peptide; nanoparticle; Caco-2 cell; transport and absorption; mechanism study

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500114

文章编号：2095-6002(2025)06-0175-17

引用格式：崔婷婷,殷爱姣,张绵松,等.海蜇ACE抑制肽纳米粒子贮藏稳定性及其在Caco-2细胞模型中转运吸收机制[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):175-191. CUI Tingting, YIN Aijiao, ZHANG Miansong, et al. Study on storage stability of jellyfish ACE inhibitory peptide nanoparticles and their transport and absorption mechanism in Caco-2 cell model[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):175-191.

收稿日期：2025-02-28

基金项目：2023年校(院)第一批人才科研项目(2023RCKY228);山东省自然科学基金博士基金(ZR2022QC085);齐鲁工业大学(山东省科学院)-威海市产学研协同创新基金项目(2022CXY-04、2022KC04);山东省自然科学基金资助项目面上项目(ZR2023MC065);山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目(2023TSGC0681、2022TSGC2500、2022TSGC1306);山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目 (2023TSGC0772/2023TS1085);泰安市岱宗人才项目(2023-04)。

Foundation: Basic and Talent Research Project of Pilot Project for Integration of Science, Education and Industry, Qilu University of Technology, Shandong Academy of Sciences (2023RCKY228); Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2022QC085); Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)-Weihai Industry University Research Collaborative Innovation Fund Project (2022CXY-04, 2022KC04);Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2023MC065); Innovation Ability Enhancement Project of Small and Medium-Sized Science and Technology Enterprises in Shandong Province(2023TSGC0681,2022TSGC2500,2022TSGC1306); Shandong Innovation Capability Enhancement Project for Technology-Based Small and Medium Sized Enterprises (2023TSGC0772/2023TS1085);Daizong Talent Project of Tai’an (2023-04).

第一作者：崔婷婷,女,助理研究员,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

*通信作者：贾爱荣,女,研究员,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

(责任编辑：张逸群)