柚皮素(naringenin,Nar)是一种天然黄酮类化合物,主要存在于葡萄柚、柠檬和橙子等柑橘类水果中,具有神经保护、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等生物活性。然而,Nar存在溶解度低、易氧化、遇光/热易分解等问题,严重限制了其在食品领域中的应用[1]。因此,需要开发合适的Nar递送系统,以改善其稳定性、溶解度以及生物利用度等。为解决这些难题,研究者们已进行了各种尝试,使用脂质载体、环糊精、聚合物纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、胶束等[2-8]作为Nar载体,以实现对其的保护和递送。但在这些载体中,大部分存在配方复杂、成本昂贵且制备耗时等问题,因此,亟需一种更为简便且与食品具有良好相容性的递送系统。其中,蛋白质作为天然高分子化合物,具有独特优势。一方面,蛋白质具有良好的生物降解性、化学可修饰性以及相容性,这些特性使其成为构建递送系统的理想材料。另一方面,作为从动植物中提取的生物大分子,它是一种容易获取的可再生资源。此外,由蛋白质材料制成的复合物易于加工且成本较低。因此,构建基于蛋白质的递送系统具有无可比拟的优势,是包封各种疏水性物质最具前景的策略之一。

大豆蛋白具有营养丰富、廉价和可再生等特点,在食品工业中得到了广泛的应用。大豆蛋白主要由大豆7S蛋白(7S)和大豆11S蛋白(11S)组成,二者含量约占大豆总蛋白的70%～80%。7S蛋白是一种三聚体蛋白质,分子质量分别为72、68、52 kDa;其由3个亚基α、α′和β组成平面三角形结构。α′亚基和α亚基具有高度同源性,均有两条寡糖链,一条位于核心区域,另一条在延伸区域,且都具有亲水性;同时,它们在N端附近都有一个半胱氨酸残基。β亚基只有一条糖链,核心区域具有疏水性,N端主要是疏水性氨基酸,不含半胱氨酸残基。11S蛋白是一种六聚体蛋白质,分子质量约为300～380 kDa;其由6个异二聚体亚基组成,每个亚基包含一条酸性多肽链(A链,约35 kDa)和一条碱性多肽链(B链,约20 kDa),两者间通过二硫键共价连接。7S和11S具有独特的纳米结构,可以被物理或化学作用解构,从而显露出内部的疏水性氨基酸残基。这一变化显著增强了它们对脂溶性天然化合物的亲和力,使得7S和11S能够作为这些物质的有效运输载体。

已有关于7S和11S用于包封天然活性化合物的应用报道,如姜黄素[9]、叶酸[10]、β-胡萝卜素[11]等,这些研究引发了我们对以7S和11S为基础合成Nar递送载体的兴趣。作为天然蛋白质,7S和11S的结构和性质易受pH 值、温度、离子浓度和蛋白酶等外在因素影响,这在一定程度上限制了它们的实际应用。通常认为,采用物理或化学手段对天然蛋白质进行结构修饰,能显著改善其的功能特性。

大豆蛋白的多数活性基团被包裹于球状结构内部,这成为制约其在食品领域中广泛应用的关键障碍。在未经热处理的蛋白质溶液中,蛋白质分子呈现出一种卷曲的紧密结构,表面被水化膜包围,具有相对的稳定性。而热处理可以改变蛋白质的结构或聚集状态,使蛋白质的空间结构去折叠展开,暴露出更多的内部疏水性基团,增强了其与生物活性物质的疏水相互作用[12]。与天然大豆分离蛋白相比,热处理提升了其自身功能性质,如较强的盐耐受性[13],另外,还能提升其递送活性物质的效率,以及改善小分子的稳定性和生物可及性,如花青素[14]和维生素D3[15]等。此外,不同pH值条件下热处理也会导致蛋白质分子表面带电氨基酸重新排布,使蛋白质表面电荷发生改变,从而影响其与天然化合物的结合[16]。pH调节和/或热处理得到的蛋白质作为小分子的载体,能明显提升小分子与蛋白质间的结合力并改善其理化性质。He等[17]在55～90 ℃和pH值为3.6或6.3条件下预处理β-乳球蛋白和β-酪蛋白,发现预处理后这两种蛋白质与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷间的相互作用会显著增强。Zhang等[16]研究了不同pH值下热处理的酪蛋白与叶黄素/玉米黄质间结合后对这两种天然色素性能的影响,发现低pH值、加热环境能改善这两种化合物的稳定性与生物利用度。Wang等[18]发现,在pH值6.0～9.0条件下,经90 ℃加热制备得到的蛋清蛋白乳液表现出更高的稳定性和抗氧化活性。但是,关于联合使用pH调节和热处理导致植物性蛋白质变性,并探究其与疏水性化合物的相互作用以及对小分子功能性质影响的研究较少。

Inouye等[19]的研究表明,在80 ℃条件下热处理能最有效地改变大豆分离蛋白的二级结构。此外,Zhang等[20]的研究显示,富含7S的蛋白质混合物在85 ℃加热后溶解度显著下降,而富含11S的蛋白质混合物在95 ℃加热条件下同样呈现出溶解度显著降低的现象。为了防止热处理导致蛋白质溶解度降低而对Nar的包封效果产生影响,故本研究选用80 ℃作为热处理温度。Zhong等[21]发现大豆亲脂蛋白在特定的pH值下孵育2 h后,其结构呈现出明显的去折叠现象。为了使7S和11S充分去折叠以暴露更多的疏水性残基,故本研究选用2 h作为处理时间。

本研究拟通过在pH值为7.4与2.0的条件下加热预处理7S和11S得到H7S和H11S,然后利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和红外光谱技术研究不同pH值下H7S/H11S与Nar的相互作用机制,并考察H7S/H11S蛋白对Nar的包封率和装载能力,及包封前后Nar的溶解度、热稳定性、抗氧化能力、释放特性、生物可及性和对α -淀粉酶、α -葡萄糖苷酶的抑制能力。希望研究结果可为进一步拓展Nar在食品领域中的应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂豆粉,西安浩天生物工程有限公司;Nar、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(pNPG),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胃蛋白酶、胆盐、胰酶、α-淀粉酶(porcine pancreas, EC 3.2.1.1)和α-葡萄糖苷酶(saccharomyces cerevisiae, EC 3.2.1.20),德国默克公司;α-(2-氯-4-硝基苯基)-β-1,4-半乳糖苷麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP),日本Toyobo公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;F97 Pro型荧光光谱仪,上海棱光技术有限公司;LGJ-10型冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司;IS50型傅里叶变换红外光谱仪,美国FEI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆7S和11S蛋白的提取

参考Wu等[22]的方法,提取大豆7S和11S蛋白。称取100 g脱脂豆粉,溶解于1.5 L双蒸水中,用2 mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.5,在45 ℃下以300 r/min的转速充分搅拌 h,之后在8 000 g的转速下4 ℃离心20 min,收集上清液。向上清液加入一定质量的NaHSO3粉末,使得溶液中NaHSO3的终浓度为0.01 mol/L。用1 mol/L的盐酸调节溶液pH值至6.4,在4 ℃冰箱中静置过夜后,将溶液在4 ℃下8 000 g离心40 min,收集到的沉淀即为11S,向上清液加入NaCl粉末,使得溶液中NaCl的终浓度为0.25 mol/L。用1 mol/L HCl调节溶液pH值至5.0,静置1 h后在8 000 g的转速下4 ℃离心40 min。向上清液加入等体积双蒸水,并用1 mol/L HCl调节溶液pH值至4.8,相同条件下离心40 min,收集到的沉淀即为7S。将7S和11S沉淀溶解于双蒸水,调节溶液pH值至7.2,冷冻干燥后得到7S粉末和11S粉末,使用前保存在4 ℃冰箱。

1.3.2 热处理大豆7S和11S蛋白的制备

参考He等[17]的方法并稍加修改,在不同pH值下制备H7S和H11S。用PBS缓冲液(pH=7.4)配制10 mg/mL的7S和11S溶液,使用2 mol/L的盐酸分别将蛋白溶液调至pH值为7.4或2.0,在4 ℃冰箱静置过夜。之后在80 ℃下水浴加热2 h,立即冰水浴冷却至室温,冷冻干燥得到不同pH值下的H7S和H11S粉末。

1.3.3 不同pH值条件下H7S/H11S和Nar溶液的配制

H7S和H11S(pH值为7.4和2.0)溶液的制备。准确称取500 mg的H7S和H11S(pH值为7.4和2.0)粉末,溶解于50 mL的PBS缓冲液(pH值为7.4和2.0),得到浓度为10 mg/mL的H7S和H11S储液,在4 ℃冰箱静置过夜。

Nar溶液的制备。准确称取200 mg的Nar粉末,溶解于甲醇,得到浓度为20 mg/mL的Nar储液。每次实验前制备新鲜的Nar溶液。

1.3.4 H7S/H11S与Nar相互作用的荧光光谱检测

参考Liu等[23]的方法,向H7S(0.5 mg/mL)或H11S(1 mg/mL)溶液加入Nar,使得溶液中Nar终浓度分别为0、0.67、1.33、2、2.67、3.33、4、4.67、5.33 μg/mL,混匀后分别在298、304、310 K下进行荧光光谱扫描。设定激发波长(λex)为280 nm,发射波长(λem)为290～500 nm,狭缝宽度为10 nm,电压为550 V。以不含H7S或H11S的同等浓度的Nar溶液作为空白背景。

1.3.5 H7S/H11S与Nar相互作用的三维荧光光谱检测

参考Li等[24]的方法,向H7S(0.5 mg/mL)或H11S(1 mg/mL)溶液加入Nar,使得溶液中Nar终浓度分别为0 μg/mL(不加Nar)或5.33 μg/mL。混匀后在298 K下进行三维荧光光谱扫描。设置λem为230～600 nm,λex为200～360 nm,狭缝宽度为10 nm,电压为550 V,温度为298 K。以不含H7S或H11S的同等浓度的Nar溶液作为空白背景。

1.3.6 H7S/H11S与Nar相互作用的紫外-可见吸收光谱检测

参考Shpigelman等[25]的方法,向H7S或H11S溶液(0.2 mg/mL)加入Nar,使得溶液中Nar的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12 μg/mL,混合后在25 ℃(298 K)下孵育30 min,扫描样品的紫外-可见吸收光谱图。以不含H7S或H11S的同等浓度的Nar溶液作为空白背景。

1.3.7 H7S/H11S与Nar相互作用的红外光谱检测

采用红外光谱仪测定各个样品的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱。扫描区间为4 000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为32次。

1.3.8 天然7S/11S与Nar的分子对接模拟

7S的三维结构(PDB-ID:3AUP)和11S的三维结构(PDB-ID:1OD5)从PDB数据库中(https:∥www.rcsb.org)下载。Nar的三维结构(CID:932)从PubChem网站上(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载,并使用OpenBabel软件进行格式转换。使用AutoDock4.2软件对7S/11S的结构进行去除水分子、加氢处理,并将其作为受体。对Nar的结构进行加氢以及能量最小化处理,并将其作为配体。在126×126×126 Å的网格盒子中进行盲对接,对接次数设定为200次。对接完成后,选择结合能最低的构象进行研究,利用Pymol软件和Discovery Studio 4.5 Client软件进行可视化分析。

1.3.9 H7S-Nar/H11S-Nar复合物的制备以及Nar溶解度、包封率和装载能力的测定

参考Ji等[26]的方法,制备H7S-Nar/H11S-Nar复合物,并计算Nar在蛋白质溶液中的溶解度(简称溶解度)。向不同浓度的7S/11S或H7S/H11S溶液中添加Nar,使得Nar与H7S或H11S的质量比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,Nar的最终质量浓度为1.5 mg/mL。室温下避光搅拌8 h,随后在10 000 r/min下离心10 min,去除不溶性物质,收集上清液。

用甲醇稀释上清液,并测定其在288 nm处的吸光度值。代入Nar标准曲线(甲醇溶解,R2=0.999)计算Nar含量。根据式(1)计算Nar的溶解度。

溶解度

(1)

式(1)中,ms是离心后上清液中的Nar的质量,g;mt是加入的Nar的总质量,g。

根据Chen等[27]的方法,测定7S/11S和H7S/H11S对Nar的包封率和装载能力。将上一步得到的上清液在4 500 r/min的转速下离心25 min(超滤管截留量为10 kDa),分别收集上清液和下清液,将上清液冷冻干燥得到7S/11S-Nar或H7S-Nar/H11S-Nar复合物。用甲醇稀释下清液,并测定其在288 nm处的吸光度,得到未被7S/11S或H7S/H11S负载的游离Nar的含量。根据式(2)和式(3)计算大豆蛋白对Nar的包封率和装载能力。

包封率

(2)

装载能力

(3)

式(2)和式(3)中,mf是未被H7S或H11S负载的Nar的质量,g,mc是复合物的质量,g。其余参数含义与式(1)一致。

1.3.10 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar热稳定性测定

参考Chen等[7]的方法,研究包封前后Nar的热稳定性变化。根据1.3.3节中H7S和H11S溶液的配制方法配制复合物溶液。各个样品溶液均置于85 ℃水浴锅内,分别在第5、10、15、20、30、60、90、120、180、240、300 min取1 mL样品与1 mL甲醇混合,在10 000 r/min下离心5 min后,测量上清液在288 nm处的吸光度。Nar保留率的计算见式(4)。

保留率

(4)

式(4)中,mr是一定时间后剩余的Nar质量,g;m0是初始时刻的Nar质量,g。

1.3.11 H7S-Nar/H11S-Nar复合物的抗氧化能力测定

1)ABTS+自由基清除:参考Cong等[28]的方法,向ABTS原液(7 mmol/L)加入过硫酸钾粉末(2.45 mmol/L),避光放置过夜,稀释后得到ABTS工作液,并测定其在734 nm处的吸光度值(A0)。向其中加入样品,使溶液中Nar的浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μg/mL。根据复合物制备过程中,蛋白质与Nar的质量比与相应包封率,设置单纯H7S和H11S的浓度梯度。混合均匀后在25 ℃下避光静置20 min,测量各个样品在734 nm处的吸光度值(Aij)。ABTS自由基清除率按照式(5)计算。

ABTS+自由基清除率

(5)

2)铁还原抗氧化能力测定:参考Benzie等[29]的方法检测样品的铁还原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)。将醋酸缓冲液(0.3 mol/L)、TPTZ溶液(10 mmol/L)、FeCl3溶液(20 mmol/L)以10∶1∶1的体积比混合成FARP工作液。向FARP工作液中加入样品,使溶液中Nar的浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL。根据复合物制备过程中,蛋白质与Nar的质量比与相应包封率,设置单纯H7S和H11S的浓度梯度。混合均匀后在37 ℃下避光静置20 min,测量各个样品在593 nm处的吸光度值,还原力以还原得到的Fe2+的毫摩尔数(mmol/L)来表示。

1.3.12 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar的释放特性测定

参考Dong等[30]的方法并稍作修改,分析H7S-Nar和H11S-Nar复合物中Nar的释放特性。将样品溶液加入透析袋(7 kDa)中,分别置于pH值为7.4或pH值为2.0的PBS缓冲液中,在37 ℃,200 r/min下水浴震荡进行透析。在固定时间吸取1 mL的PBS缓冲液,用甲醇稀释后测量其在288 nm处的吸光度值,同时向释放体系中补充1 mL新鲜PBS缓冲液。根据式(6)计算Nar的释放率。

释放率

(6)

式(6)中,m′是t分钟时释放到PBS缓冲液中的Nar的质量,m0是透析袋内Nar的初始质量。

1.3.13 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar的生物可及性测定

根据Minekus等[31]的方法配制模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)电解质储备液和模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF)电解质储备液,参考Li等[32]的方法并稍做修改,开展静态体外模拟消化实验。

1)模拟胃消化阶段。向8 mL SGF电解质储备液加入胃蛋白酶(2 000 U/mL)、CaCl2溶液(0.15 mmol/L)与2 mL双蒸水。将10 mL样品溶液与10 mL SGF混合,使得溶液中Nar终浓度为100 μg/mL,用6 mol/L HCl调节溶液pH至3.0,在37 ℃下以100 r/min的速度震荡2 h,每隔1 h取1 mL样品。

2)模拟肠消化阶段。向8 mL SIF电解质储备液中加入胰蛋白酶(100 U/mL)、胆盐(2.5 mg/mL)、CaCl2溶液(0.6 mmol/L)与2 mL双蒸水。取10 mL消化后的混合溶液,与10 mL SIF混合,用1 mol/L NaOH调节溶液pH值为至7.0,在37 ℃下以100 r/min的速度振荡2 h,每隔1 h取1 mL样品。

用甲醇稀释收集的样品,并利用紫外-可见分光光度计测定Nar含量,根据式(4)计算Nar的保留率。消化结束后,将混合溶液在4 ℃下以15 000 g的转速离心40 min,测定上清液中的Nar含量(ms),根据式(7)计算Nar的生物利用度。

生物利用度

(7)

式(7)中,ms是离心后上清液中的Nar质量,m0是初始样品中Nar的总质量。

1.3.14 H7S-Nar/H11S-Nar复合物对α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶的抑制能力测定

根据Peng等[33]的方法,研究H7S-Nar和H11S-Nar复合物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。

1)α-淀粉酶抑制活性测定。将样品溶液与α-淀粉酶(终浓度为0.1 μmol/L)进行混合,使得溶液中Nar的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL,在37 ℃下预孵育20 min,随后加入Gal-G2-α-CNP(终浓度为0.5 mmol/L)启动反应。使用紫外-可见分光光度计测定反应混合物在405 nm处的吸光度。阿卡波糖作为阳性对照组。抑制效果根据式(8)计算。

抑制效果

(8)

式(8)中,Asample和Ablank分别表示抑制剂存在和不存在时体系每分钟吸光度值的变化。

2)α-葡萄糖苷酶抑制活性测定。将样品溶液与α-葡萄糖苷酶(终浓度为0.03 μmol/L)混合,使得溶液中Nar的质量浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL,在37 ℃下预孵育20 min,随后加入pNPG(终浓度为0.5 mmol/L)启动反应。之后采用上述相同方法测定对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,实验数据表示为平均值±标准差,使用Graphpad Prism 5软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 H7S/H11S与Nar相互作用的荧光光谱分析结果

蛋白质的内源性荧光主要是由3种芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的荧光发射引起的,其中色氨酸和酪氨酸残基发挥着主要作用。当小分子配体与蛋白质结合后会改变蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基周围的微环境,从而导致其荧光光谱发生变化。在298 K下,测定不同浓度Nar存在时H7S和H11S的荧光光谱图,结果见图1。由图1可知,当pH值为7.4和2.0时,H7S的荧光特征峰分别位于333 nm和314 nm,证明在pH值为7.4下,H7S的蛋白质荧光主要来自色氨酸,而在pH值为2.0下主要来自于酪氨酸[34]。当pH值为7.4和2.0时,H11S的荧光特征峰分别位于343 nm和340 nm,证明2种pH值下H11S的蛋白质荧光均主要来自色氨酸,与刘金杰等[35]的结果相一致。Nar的加入导致H7S和H11S荧光强度呈现出浓度依赖性的降低。在pH值为7.4和2.0下,当Nar质量浓度为5.33 μg/mL,H7S的荧光强度分别下降了36.62%和49.93%,H11S的荧光强度分别下降了45.66%和52.16%,表明Nar与H7S/H11S间存在着相互作用,从而猝灭它们的内源荧光[23],且两种蛋白质在酸性环境中的荧光猝灭程度更大。此外,在2种pH条件下,H7S(pH值为7.4:从 333 nm 移至350 nm;pH值为2.0:从314 nm移至323 nm)和H11S(pH值为7.4:从343 nm移至347 nm;pH值为2.0:从340 nm移至352 nm)的荧光发射峰均发生明显的红移。这些改变表明Nar的存在会导致H7S/H11S中芳香族氨基酸的微环境发生改变。

根据荧光团和猝灭剂之间的相互作用方式,猝灭机制通常可分为动态猝灭、静态猝灭及两种机制的结合。使用Stern-Volmer方程定量分析Nar对H7S/H11S的猝灭机制,见式(9)。

=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q] 。

(9)

式(9)中,F0和F分别是不存在和存在Nar时H7S/H11S的荧光强度;[Q]是Nar的浓度;Ksv是Stern-Volmer猝灭常数;kq是猝灭速率常数,τ0是猝灭剂不存在时生物分子荧光团的荧光寿命(10-8 s)。

图2显示了H7S-Nar体系和H11S-Nar体系在298 K、304 K和310 K下的Stern-Volmer曲线。可以看出它们均呈现出良好的线性关系(R2>0.99),表明只存在单一的猝灭机制。表1中列出不同温度下各个体系的Ksv和kq值,可以看出,所有体系的Ksv值均随着温度的升高而降低,且kq值大于最大扩散碰撞猝灭的速率常数(2×1010 L/mol-1s-1),表明Nar对H7S/H11S的猝灭机制是静态猝灭模式。

对于静态猝灭模式,Nar和H7S/H11S之间的结合常数(K)和结合位点数(n)可以通过式(10)进行计算。

(10)

式(10)中,[Pt]和[Qt]分别表示蛋白质和Nar的总浓度,μmol/L;n是结合位点数,其余参数含义与式(9)一致。

图3显示了不同温度下H7S-Nar体系和H11S-Nar体系的log(F0-F)/F与log(1/([Qt]-(F0-F)[Pt]/F0))的关系图。经曲线拟合可得到n和K值,列于表1中。由表1可见,K值处于3.49×104～12.17×104 L/mol-1,与典型的高亲和力蛋白质-配体体系(K=107～109 L/mol-1)相比,Nar与H7S/H11S间具有中等强度的结合力,这意味着Nar可被H7S/H11S包封和递送。对于每个体系而言,K值随着温度的升高而降低,表明Nar与这些蛋白质的结合过程是放热结合,较低的温度有利于它们之间的结合。此外,在pH值为2.0条件下H7S/H11S与Nar的K值大于pH值为7.4条件下相应的值,可能是由于强酸性环境使蛋白质暴露出更多的疏水性氨基酸残基,增强了与Nar的相互作用。在相同pH下,H7S-Nar体系的K值大于H11S-Nar体系。同时,每个体系的n值均接近于1,说明在H7S/H11S上均存在一个主要的Nar结合位点。

配体与蛋白质之间的结合主要涉及4种非共价结合力:疏水相互作用、范德华力、静电相互作用和氢键。使用Van’t Hoff方程[式(11)]和Gibbs-Helmholtz方程[式(12)]可计算焓变(ΔH0)、熵变(ΔS0)和吉布斯自由能变化(ΔG0),从而确定Nar与H7S/H11S相互作用过程中起主导作用的作用力类型。

(11)

ΔG0=ΔH0-TΔS0 。

(12)

式中,K是结合常数,R是气体常数(8.314 J·mol-1·K-1),T是绝对温度。

图4展示了不同体系的lnK与温度倒数的关系。利用线性拟合方法可以获得热力学参数值,并列入表2中。由表2可知,所有体系的ΔG0都小于0,表明H7S/H11S与Nar之间的结合是自发进行的。对于H7S-Nar体系而言,无论pH值为7.4还是2.0,ΔH0<0,且ΔS0<0,说明H7S与Nar主要通过氢键和范德华力形成复合物。对于H11S-Nar体系来说,当pH值为2.0时,维系复合物的主要作用力也是氢键和范德华力,而pH 7.4下,它们之间主要作用力是氢键和疏水相互作用(ΔH0<0,ΔS0>0)。

2.2 H7S/H11S与Nar相互作用的三维荧光光谱分析结果

三维荧光光谱常用来探究与小分子相互作用后蛋白质的空间构象和微环境变化。图5是H7S-Nar体系和H11S-Nar体系的三维荧光光谱和相应的等高线图,相关特征参数见表3。从图5中可以看出,在所有研究的体系中,三维荧光光谱图中均显示三个特征峰,其中Peak a(λex=λem)和Peak b(λex=2λem)分别代表一阶瑞利散射峰和二阶瑞利散射峰,与样品折射率和颗粒大小有关。Peak 1主要展示色氨酸和酪氨酸残基的荧光特征[24]。当Nar加入蛋白质溶液后,H7S-Nar体系和H11S-Nar体系的Peak 1的荧光强度均降低,证明H7S/H11S发生了荧光猝灭,且它们之间能发生相互作用。同时,所有体系中Peak 1的峰位置发生了红移,这表明Nar的加入会对H7S/H11S微环境产生影响,使得色氨酸和酪氨酸残基所处微环境的极性增加,这与2.1节中观察到的现象相一致。

2.3 H7S/H11S与Nar相互作用的紫外-可见吸收光谱分析结果

图6是H7S-Nar /H11S-Nar体系的紫外-可见吸收光谱图。蛋白质在210 nm附近的特征吸收峰主要是由羰基的n→π*跃迁引起的,275 nm附近的特征吸收峰则主要是由色氨酸、酪氨酸等氨基酸中的芳香杂环π→π*跃迁引起的[36]。随着Nar浓度的增加,蛋白质在210 nm附近的特征吸收峰强度逐渐降低(对于H7S来说,pH值为7.4下降低了36.41%,pH值为2.0下降低了37.90%;对于H11S来说,pH 7.4下降低了33.89%,pH 2.0下降低了37.25%),且峰位置发生红移,这意味着Nar与H7S/H11S间发生了相互作用,从而导致蛋白质的构象发生改变[36],这意味着它们之间形成了基态复合物,再次表明它们之间存在静态猝灭机制,与2.1节中的结论相一致。

2.4 H7S-Nar/H11S-Nar复合物的红外光谱分析结果

FT-IR光谱是研究蛋白质与小分子结合过程中蛋白质二级结构变化的一种常用技术。图7是各样品的FT-IR光谱图。由图7可知,天然7S和11S在1 635.91 cm-1/1 632.41 cm-1(酰胺I带,CO伸缩振动)和1 528.46 cm-1/1 528.65 cm-1(酰胺Ⅱ带,N—H弯曲振动)处显示出特征条带。在两种pH下对7S和11S进行热处理后,O—H伸缩振动位置的吸收峰(3 275.39 cm-1/3 274.22 cm-1)均红移,表明热变性过程导致蛋白质球状结构的展开,破坏了其原有的氢键系统,氨基酸残基间会重新形成新的分子间氢键,造成蛋白质结构的改变[37]。另外,较强的氢键作用会导致CO的电子云密度降低,CO伸缩振动也出现红移现象[38]。在pH值为7.4下,加热后的蛋白质在500～1 160 cm-1范围内出现很多新的吸收峰,可能是加热导致了化学环境的改变,引起C—O伸缩振动(1 050～1 150 cm-1)发生变化,以及二硫键的断裂或形成。而在pH 2.0下,加热时并没有导致此区间产生太多新的吸收峰。游离Nar在1 450～1 600 cm-1的范围内存在多个强吸收峰(图中未显示),与苯环的CC键伸缩振动紧密相关。H7S-Nar体系/H11S-Nar体系的光谱图与H7S/H11S的光谱图类似,且复合物的红外光谱图中没有出现Nar苯环CC键伸缩振动的特征峰,表明Nar被包封在H7S/H11S中。H7S-Nar体系/H11S-Nar体系的酰胺Ⅰ带发生红移,意味着蛋白质与Nar之间存在着疏水相互作用和静电作用力[39]。具体为从1 632 cm-1移至1 630.78 cm-1(H7S-Nar体系,pH=7.4)、从1 624.93 cm-1移至 1 623.81 cm-1(H7S-Nar体系,pH=2.0)、从 1 630.52 cm-1移至1 630.29 cm-1(H11S-Nar体系,pH=7.4)和从1 632.06 cm-1移至1 630.08 cm-1(H11S-Nar体系,pH=2.0)。此外,酰胺Ⅱ带同样会向短波长方向移动,这表明Nar与H7S/H11S的结合反应会改变蛋白质的二级结构。

在OMNIC软件中将光谱图纵坐标转化为吸光度,并进行归一化处理。运用PeakFit 4.12软件对酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)进行基线校正和平滑预处理,然后进行傅里叶变换去卷积和二阶导数处理,根据子峰面积计算出蛋白质的二级结构含量,见表4。其中,1 650～1 660 cm-1对应α-螺旋,1 600～1 640 cm-1对应β-折叠,1 640～1 650 cm-1对应无规卷曲,1 660～1 700 cm-1对应β-转角。由表4可知,pH值为7.4条件下,7S/11S与天然7S/11S的二级结构含量相差不大,但酸性处理后,α-螺旋和β-折叠含量显著下降,表明强酸性环境下蛋白质结构变得更加松散和不规则,可能是由于强酸性环境破坏了蛋白质分子内部的氢键,使得α-螺旋结构解螺旋[40]。在刘金杰等[35]的研究中也观察到类似的结果。相较于单纯的pH变性,加热使得蛋白质的α-螺旋和β-折叠含量上升,无规卷曲含量下降,表明加热使得蛋白质松散的结构变得更为紧密[41]。H7S/H11S与Nar形成复合物后,在pH值为7.4下,蛋白质的α-螺旋和β-折叠含量均下降,而pH值为2.0下,其α-螺旋含量上升,β-折叠含量均下降,这表明在不同pH下,Nar的结合会对H7S/H11S的二级结构产生不同的影响。

2.5 天然7S/11S与Nar的分子对接模拟结果

利用分子对接模拟分析7S/11S与Nar之间的相互作用模式,结果见图8。由图8可知,在Nar与7S的对接体系中,Nar与7S中Pro82、Leu79、Met353和Ala357等疏水性氨基酸残基相邻,同时与2个氨基酸残基(Ser259和Gln354)形成了3个氢键,距离分别为2.1 Å、2.1 Å和2.2 Å。此外,Nar还与Leu79间存在着π-烷基相互作用。在Nar与11S的对接体系中,Nar周围环绕着Phe163、Val204、Pro169、Met177和Ile171等疏水性氨基酸残基,且在Gly202、Tyr164和Thr176处观察到4个氢键,距离分别为2.0 Å、2.2 Å、2.1 Å和2.1 Å。同时,Nar与11S 上的一些氨基酸残基(如Phe163、Ile171和Arg161)间存在着π-相互作用。此外,Nar与7S之间的分子对接结合能为-5.43 kcal/mol,与11S之间的分子对接结合能为-4.83 kcal/mol,意味着Nar与7S间的结合更为紧密。然而,pH调节和热处理会导致蛋白质空间结构发生改变,暴露出新的Nar结合位点或掩盖天然蛋白质原来的结合位点。因此,在未来的研究中应当借助分子动力学模拟技术进一步解释热处理7S/11S与Nar之间的结合模式。

2.6 热处理大豆7S和11S蛋白对Nar溶解度及其包封率和装载能力的影响

Nar作为一种脂溶性的黄酮化合物,在水溶液中的溶解度很低,而当其与H7S/H11S形成复合物后,水分散性得到显著提升,结果见图9。由图9可知,随着蛋白质与Nar的质量浓度比逐渐增加,Nar的溶解度呈持续上升趋势。在Ji等[26]的研究中也得到了类似的结果,即用大豆蛋白纤维负载姜黄素时,会显著提高姜黄素的溶解度,且它的溶解度随着蛋白质浓度的增加而增大,在蛋白质与姜黄素质量比为100∶1时达到最大。在本研究中,当蛋白质与Nar质量浓度比为40∶1时,Nar的溶解度基本上达到最高水平,继续增加蛋白质的比例,Nar的溶解度或包封率并没有得到显著的提升。综合考虑装载能力和经济成本,后续研究中选用40∶1的质量比来制备复合物。与未处理的7S/11S-Nar复合物相比,热处理显著增强了复合物的包封能力以及Nar的溶解度。在质量比为40∶1时,热处理使得7S-Nar复合物和11S-Nar复合物中Nar的溶解度分别至少提高了49.21%和47.58%,包封率分别至少提高了62.93%和69.75%。在pH值为7.4的PBS溶液中,Nar粉末的溶解度为38.21 μg/mL,但形成复合物后(40∶1),其溶解度分别达到1 369.95 μg /mL(H7S-Nar复合物)和1 254.60 μg /mL(H11S-Nar复合物),Nar的溶解度分别被提高了34.85倍和31.83倍;在pH值为2.0的PBS溶液中,Nar粉末的溶解度为29.68 μg/mL,形成复合物后(40∶1),其溶解度分别达到1 443.60 μg /mL(H7S-Nar复合物)和1 479.30 μg /mL(H11S-Nar复合物),Nar的最大溶解度分别被提高了47.64倍和48.84倍,这一提升主要归因于Nar通过氢键、范德华力或疏水相互作用与蛋白质形成了可溶性复合物,从而显著增强了其水分散性。在以前的研究中,研究者们也利用了各种递送体系负载Nar以提高其溶解度。如Nar-β-环糊精复合物中,Nar溶解度提高了11倍[8];在Nar磷脂酰胆碱复合物中,它的溶解度在pH值为2.0下提高了13.05倍,而在pH值为6.8下仅提高了2.76倍[42];在Nar磷脂复合物中,在pH值为2.5和7.0下,其溶解度分别提高了4.26倍和6.50倍[43],在混合胶束中,Nar的溶解度提高了30倍[3]。

为分析H7S/H11S对Nar的负载情况,测定不同质量浓度比下各体系对Nar的包封率和装载能力,具体数据见表5。由表5可知,体系包封率的变化趋势与溶解度的趋势高度一致。对于同一种蛋白质而言,在pH值为2.0条件下的溶解度和包封率均高于pH值为7.4条件,且在40∶1的质量浓度比下达到最高。具体而言,在pH值为7.4下,H7S-Nar体系的包封率和装载能力分别是83.08%和2.03%,而在pH值为2.0下,该体系的包封率和装载能力则提升至88.31%和2.15%。对于H11S-Nar体系,在pH值为7.4下,其包封率和装载能力分别为76.27%和1.86%;在pH值为2.0下,则分别达到了90.37%和2.20%。在后续实验中,我们选用了溶解度和包封率最高的体系开展研究,即蛋白质与Nar的质量比设定为40∶1。此外,与其他纳米载体相比,H7S-Nar/H11S-Nar体系展现出显著优势。如基于麦芽糖糊精的Nar纳米载体的包封率最高为85.23%[5];Nar固体脂质纳米颗粒的包封率为72.70%[44]～78.22%[6],基于藜麦蛋白分离物的Nar纳米载体的包封率最高为87.26%,装载能力为9.41%[7];玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒对Nar的最大包封率接近60%,装载能力约为7%[39]。这些结果表明了H7S-Nar和H11S-Nar复合物在提高Nar溶解度方面的显著优势,显示出7S/11S具备作为疏水性小分子良好递送系统的潜力。

2.7 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar的热稳定性分析结果

图10是85 ℃下H7S-Nar/H11S-Nar复合物在不同时间点的Nar保留率。可以看出,随着加热时间的增加,Nar的含量逐渐降低。从5 min起,不同复合物中的Nar保留率的大小排序与最终保持一致。复合物中的Nar保留率在加热过程中几乎没有变化,在加热初期(0～15 min)的下降速率较快。加热5 h后,游离Nar的保留率仅为67.20%,而复合物中Nar保留率分别是89.66%(H7S-Nar体系,pH=7.4),94.49%(H7S-Nar体系,pH=2.0),91.80%(H11S-Nar体系,pH=7.4)和95.98%(H11S-Nar体系,pH=2.0),远高于游离状态的保留率。对于这2个体系来说,pH值为2.0下的保留率明显高于pH值为7.4下,这可能与Nar自身在酸性环境中更加稳定相关。在相同pH值下,相较于H7S,H11S能在高温下为Nar提供更加明显的保护效果。此外,值得注意的是,游离Nar具有较高的热稳定性,在65 ℃下加热5 h后,游离Nar的保留率与复合物中的保留率没有显著差异(图10中未显示)。整体而言,Nar与H7S/H11S形成的4种复合物均能有效地缓解了Nar的热分解,显著改善其热稳定性。这与以前报道的研究相类似,即在基于藜麦蛋白分离物的Nar纳米载体中,Nar的热稳定性得到了改善,在85 ℃下加热20 min后,其保留率约为85%[7]。

2.8 H7S-Nar/H11S-Nar复合物的抗氧化能力分析结果

图11是H7S-Nar/H11S-Nar复合物的ABTS自由基清除能力和Fe3+还原能力结果。由图11可知,所有体系的抗氧化活性均随着Nar浓度的增加呈上升趋势。此外,复合物的形成显著提升了Nar的抗氧化能力,这可能与复合物中Nar具有更高的溶解度和稳定性有关,由于Nar被包封在复合中,能够更好地在溶液中分散,从而提高了其结构中抗氧化基团与自由基之间的接触机会[45]。对于H7S-Nar复合物来说,在相同浓度下,两种pH值下复合物的ABTS+自由基清除能力和Fe3+还原能力差异很小,说明pH的变化对其抗氧化能力的影响并不显著。而对于H11S-Nar复合物来说,pH值的改变导致其抗氧化能力出现明显不同的结果:在ABTS自由基清除实验中,与pH值为7.4下相比pH值为2.0环境会使复合物表现出更高的ABTS自由基清除能力,而在FRAP实验中,pH值为7.4的体系则比pH值为2.0的体系具有更强的Fe3+还原能力。H7S和H11S具有优异的抗氧化能力,这可能与其羧基端存在酪氨酸残基有关[46],且加热促进了7S/11S中抗氧化肽的释放[47]。另外,蛋白质与Nar较高的质量比也解释了蛋白质载体具有较强的抗氧化能力。Nar的抗氧化活性主要依靠苯环上三个羟基提供H+来清除自由基。其中,A环5,7-二羟基的特定排列[1(a)],使Nar供电子后能通过共轭效应、氢键网络及分子内环流效应维持结构稳定,为其持续发挥抗氧化功能提供了结构保障。值得注意的是,在各个浓度下,复合物的抗氧化能力几乎都低于游离Nar与单纯H7S或H11S的抗氧化能力之和,这种掩蔽作用可能是由于蛋白质酰胺羰基与Nar酚羟基形成了分子间氢键,阻碍其提供H+。此外,在Nar与蛋白质结合的过程中,蛋白质结构发生变化,具有抗氧化能力的氨基酸残基可能被包埋在蛋白质分子内部[48]。在先前的一些研究中也得到了类似的结果,即大豆分离蛋白-槲皮素颗粒的抗氧化能力低于二者之和[49];β-酪蛋白-根皮苷复合物的ABTS自由基清除能力同样低于二者之和[48]。不过,复合物整体所展现出的抗氧化能力显著优于游离Nar。其中,H11S-Nar(pH=2.0)体系的ABTS自由基清除能力优于其他体系,这是由于蛋白质载体可以为Nar的5,7,4’位羟基营造更有利的微环境,即它可能会与蛋白质形成更少的氢键,从而使Nar更易提供H+来还原自由基[49]。然而,在FRAP实验中,与ABTS自由基清除实验中的规律不同,H11S-Nar(pH=7.4)体系的Fe3+还原能力最强,这种现象与已有的研究报道相一致[50]。故可以推测无论哪种体系,低于铁-亚铁半反应的氧化还原电位都更有利于亚铁离子的形成[50]。先前羟丙基-β-环糊精包封Nar的研究中,也发现Nar的ABTS自由基清除率得到提升(49.45%)[51]。此外,李文洁等[45]的研究表明,在表没食子儿茶素没食子酸酯共价修饰的玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒中,Nar的自由基清除能力和Fe3+还原能力得到显著改善。在pH值为7.4下,H7S-Nar复合物与H11S-Nar复合物的ABTS自由基清除能力相差不大,但H11S-Nar复合物的Fe3+还原能力比H7S-Nar复合物更强。而在pH值为2.0下,H11S-Nar复合物无论是ABTS自由基清除能力,还是Fe3+还原能力,均强于H7S-Nar复合物。综合而言,H11S-Nar复合物的抗氧化能力更为突出。当然,为了更加全面地揭示这些复合物的抗氧化能力,未来还需要开展其他的抗氧化实验来进行综合评估。

2.9 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar的释放特性分析结果

体外释放率是评估Nar负载系统性能的一个重要指标[52]。图12展示了处于pH值为7.4和2.0的PBS缓冲环境下,这2种复合物中Nar的释放特性情况。由图12可见,在2种pH的透析环境中,复合物中的Nar都比游离Nar表现出了更快的释放速率。Nar的疏水性影响其溶解性,进而导致其较差的释放特性,而复合物的形成使得Nar具有无定形结构[53],降低了Nar和释放介质之间的界面张力,改善了Nar的亲水性,从而促进其释放速率。在其他有关Nar负载体系的研究中,也发现了类似的释放模式[30]。此外,可以看出释放曲线分为两个阶段:第一阶段,Nar的释放速率急剧上升,其主要从靠近蛋白质表面的区域或颗粒缝隙中释放出来;第二阶段,其释放速率趋于平缓,达到最大释放能力,出现平台期,可能是因为Nar从蛋白质内部扩散出来比较缓慢。另外,水合作用增加了分子的扩散路径距离,故Nar释放速率会变低[53]。相较于H7S-Nar复合物,H11S-Nar复合物在相同释放介质及条件下展现出更优异的Nar释放特性(释放速率和最大释放量提升更明显)。当释放时长达到24 h时,在pH值为7.4的释放介质里,复合物中Nar的最大释放率相较于游离Nar提高了38.30%～49.37%;而在pH值为2.0的释放介质中,处于复合物状态的Nar其最大释放率比游离状态提高了18.62%～48.55%。因此,H7S和H11S对Nar的释放行为产生了极为显著的影响。在两种透析条件下,除pH值为2.0环境下制备的H11S-Nar体系外,其余3种体系的释放率和蛋白质-Nar体系的结合常数呈现出负相关关系,即结合力的增加会阻碍Nar在蛋白质基质中的移动[54]。不过,pH值为2.0环境下制备的H11S-Nar体系是个例外。尽管该体系的结合常数大于pH值为7.4环境下制备的H11S-Nar体系,但其释放速率和最大释放量却是最高的。这表明释放过程并非仅由结合常数决定,还受到其他因素的影响。例如,在pH值为7.4环境下,H11S与Nar之间的结合主要依赖静电相互作用来驱动,而在其他体系中,二者的结合则主要由氢键和范德华力主导。静电相互作用属于长程作用力,具有较强的稳定性,不易被破坏。因此,pH值为7.4环境下H11S-Nar体系的结合稳定性可能更高,进而使其释放速率降低。此外,不同复合物中Nar的释放速率还可能受到蛋白质空间位阻的影响[30]。

参考Chen等[52]的方法,分别使用First order模型和Korsmeyer-Peppas模型对快速释放曲线进行拟合,同时采用Weibull模型和Korsmeyer-Peppas模型对全程释放曲线进行拟合,相关结果如图13所示。各模型的具体参数详见表6。First order模型、Weibull模型和Korsmeyer-Peppas模型的方程分别见式(13)～(15)。

F=1-exp(-kFt) ;

(13)

F=1-exp(-(kWt)d) ;

(14)

F=kKptn 。

(15)

式(13)～(15)中,F是t时刻Nar的释放分数,kF是一级释放常数,kW是Weibull模型的动力学常数,kKP是Korsmeyer-Peppas模型的动力学常数,n是释放指数值。

由图13和表6可知,在快速释放阶段,Korsmeyer-Peppas模型能完美地拟合所有体系的释放曲线;而对于全程释放曲线,Weibull模型则展现出更优的拟合效果。当t时刻的释放分数低于0.6时,可采用释放指数值(n)判断释放机制。从快速释放阶段Korsmeyer-Peppas模型的拟合结果来看,所有体系的n值在0.45和0.89之间,表明其释放性质遵循非Fickian转运模式,也说明蛋白质溶胀达到平衡的速度快于Nar释放速率,扩散过程主要发生在已经溶胀的蛋白质基质上[55],从而使Nar的释放模式偏离Fickian扩散模式。各个体系中Nar的释放速率与其对应的kkp值具有良好对应关系(kkp值表示Nar的突释)。释放速率的不同可能与蛋白质的溶胀程度密切相关。pH值为2.0下制备的H11S-Nar复合物的释放速率最快,可能是由于Nar不易进入蛋白质内部,也不易使得蛋白质发生溶胀[55]。另外,Nar从蛋白质内部到表面的扩散路径长度不同,越靠近蛋白质表面其释放速率越快[56]。各个体系在不同pH透析环境下呈现出不同的释放曲线,表明Nar的释放是pH依赖性的,且在pH值为7.4下观察到较高程度的Nar释放量。在pH值为2.0 下,氨基的质子化可能会促进蛋白质的溶胀程度,导致静电斥力增大。故水会缓慢渗透到复合物中,有助于蛋白质的溶胀,减弱Nar的扩散[57]。此外,Nar在pH值为7.4时的溶解度高于pH值为2.0,这也解释了Nar在近中性环境下释放率更高的原因[57]。

2.10 H7S-Nar/H11S-Nar复合物中Nar的生物可及性分析结果

游离Nar溶解度很低,且在消化过程中易被消化酶降解,这导致其生物可及性不佳。为了提高Nar在消化后的保留率以及生物可及性,我们采用H7S/H11S对其进行包封。鉴于口服过程中食物在口腔中的停留时间极为短暂,且对Nar保留率几乎没有影响,因此我们借助模拟胃肠液开展体外消化实验,测定各个体系中Nar的保留率和生物可及性,结果见图14。其中,保留率表示消化后未被降解的Nar含量,生物可及性表示释放出来的可被肠道吸收(即溶解)的Nar的比例。由图14可知,随着消化的进行,Nar逐渐被降解,表明其在模拟消化环境中的不稳定性。一般而言,黄酮类化合物在肠道中性pH条件下相较于胃内酸性条件下更为不稳定。此外,黄酮类化合物与消化酶之间的相互作用可能会引发蛋白质沉淀,进而降低其生物利用度[58]。模拟胃消化结束后,复合物中Nar的保留率(81.67%～94.75%)相较于游离Nar(68.65%)提高了18.97%～38.02%;模拟小肠消化结束后,复合物中Nar的保留率(60.70%～76.70%)比游离Nar(30.65%)提高了98.04%～150.24%。在以前的一项研究中, Li等[32]利用玉米醇溶蛋白来增强Nar的消化稳定性,经模拟胃液消化后,Nar的保留率提升了23.25%,经模拟肠液消化后,Nar的保留率提升了114.28%。这些结果清晰地表明,复合物的形成能为Nar提供一个稳定的微环境,使其与外界环境相隔离,限制了消化酶与Nar的接触,从而提高了Nar消化稳定性,减少其降解。相反,游离Nar由于直接暴露在消化液中,极易被破坏或降解。

如图14所示,所有的递送体系均显著地提高了Nar的生物可及性,提升幅度达2.47～3.69倍,这种生物可及性的差异可能与不同体系中Nar的溶解度不同有关。在相同pH条件下,与H7S-Nar体系相比,H11S-Nar体系能更好地保护Nar免受消化酶的降解,以及改善Nar生物可及性的效果更佳,这与热稳定性研究中的保护效果相一致。

2.11 H7S-Nar/H11S-Nar复合物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力分析结果

糖尿病主要与高血糖相关,通过抑制α-淀粉酶α-葡萄糖苷酶等碳水化合物水解酶,能够有效控制餐后高血糖,这是预防和治疗糖尿病发展进程的一种有效策略。在此背景下,研究了Nar和H7S-Nar/H11S-Nar复合物在体外对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并以标准药物阿卡波糖作为阳性对照,结果如图15所示,各体系的IC50值列于表7。结果表明所有样品都以浓度依赖的方式对这两种酶表现出显著的抑制活性。α-淀粉酶抑制研究表明,除pH值为2.0下制得的H7S-Nar复合物外,其余3种复合物均表现优于游离Nar的抑制能力。然而,对于α-葡萄糖苷酶,游离Nar的IC50值最低,这表明其抑制活性强于所有复合物。值得注意的是,不同复合物对酶活性的抑制强弱与Nar的释放速率大小呈现出一一对应的关系,即H11S-Nar复合物 (pH=2.0)>H11S-Nar复合物 (pH=7.4)>H7S-Nar复合物 (pH=7.4)>H7S-Nar复合物 (pH=2.0)。然而,在复合物中大豆蛋白质的空间位阻效应可能使得Nar难以接近酶的活性中心,从而降低了其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此,Nar的释放行为以及蛋白质的空间位阻效应综合影响了复合物对酶活性的抑制能力。在Lammari等[59]的研究中也出现了类似的现象,即包封的枣籽油比未包封的枣籽油更有效地降低α-淀粉酶的催化活性,但未包封的枣籽油却展现出更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。另外,无论Nar是以游离形式还是复合形式存在,其抑制α-淀粉酶的能力均弱于阿卡波糖,而在α-葡萄糖苷酶体系中,情况则恰好相反。另外,复合物相较于游离Nar具有更优异的稳定性,而相较于阿卡波糖具有更低的副作用,总之,H7S-Nar/H11S-Nar复合物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均表现出良好的抑制活性,其中H11S-Nar复合物的酶抑制能力更强。鉴于此,其有可能成为传统口服抗糖尿病药物的有效替代品。

3 结 论

利用多种光谱学技术系统地研究了2种不同pH值条件下H7S/H11S与Nar的相互作用机制,同时评估了H7S-Nar/H11S-Nar复合物对Nar功能性质的影响。研究结果表明,Nar通过静态猝灭机制与H7S/H11S形成1∶1复合物,且在pH值为2.0时H7S/H11S与Nar的结合常数大于pH值为7.4时的相应数值。Nar的存在对蛋白质的空间构象和微环境产生显著影响。具体而言,在pH=7.4下,蛋白质的α-螺旋和β-折叠含量均呈现出下降趋势;而在pH=2.0下,蛋白质的α-螺旋含量有所上升,β-折叠含量则下降。复合物的形成显著提高了Nar的溶解度、热稳定性、抗氧化能力、消化稳定性和生物可及性,促进了Nar的释放能力。此外,复合物中Nar也展现出良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力。值得注意的是,与H7S-Nar复合物相比,H11S-Nar复合物在提升Nar功能性质方面表现出更优异的效果,意味着其更有潜力地递送Nar。本研究旨在为大豆蛋白-脂溶性小分子复合物的制备以及脂溶性小分子功能特性的改善提供一定的理论指导。

参考文献：

[1] BHIA M, MOTALLEBI M, ABADI B, et al. Naringenin nano-delivery systems and their therapeutic applications[J]. Pharmaceutics, 2021, 13(2): 291.

[2] KUMAR R P, ABRAHAM A. PVP-coated naringenin nanoparticles for biomedical applications-in vivo toxicological evaluations[J]. Chemico-Biological Interactions, 2016, 257: 110-118.

[3] SONG I S, CHA J S, CHOI M K. Enhanced oral bioavailability of naringenin administered in a mixed micelle formulation with Pluronic F127 and Tween 80 in rats[J]. Journal of Pharmaceutical Investigation, 2015, 45(7): 633-640.

[4] GEORGE D, MAHESWARI P U, MEERA SHERIFFA BEGUM K M. Chitosan-cellulose hydrogel conjugated with L-histidine andzinc oxide nanoparticles for sustained drug delivery: kinetics and in-vitro biological studies[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 236: 116101.

[5] CHAURASIA S, PATEL RR, VURE P, et al. Oral naringenin nanocarriers: fabrication, optimization, pharmacokinetic and chemotherapeutic efficacy assessments[J]. Nanomedicine, 2017, 12(11): 1243-1260.

[6] JI P, YU T, LIU Y, et al. Naringenin-loaded solid lipid nanoparticles: preparation, controlled delivery, cellular uptake, and pulmonary pharmacokinetics[J]. Drug Design, Development and Therapy, 2016, 10: 911-925.

[7] CHEN YY, LI Q M, PAN L H, et al. pH-shifted quinoa protein isolate-based nanocarriers for naringenin: structure characterization and stability evaluation[J]. Food Hydrocolloids, 2024, 149: 109637.

[8] XU X R, YU H T, HANG L, et al. Preparation of naringenin/β-cyclodextrin complex and its more potent alleviative effect on choroidal neovascularization in rats[J]. BioMed Research International, 2014, 2014: 623509.

[9] WANG Y Y, SHEN J, ZOU B W, et al. Unveiling the critical pH values triggering the unfolding of soy 7S and 11S globulins and enhancing their encapsulation efficiency[J]. Food Chemistry, 2024, 445: 138707.

[10] OCHNIO M E, MARTNEZ J H, ALLIEVI M C, et al. Proteins as nano-carriers for bioactive compounds. the case of 7S and 11S soy globulins and folic acid complexa-tion[J]. Polymers, 2018, 10(2): 149.

[11] PENG L P, TANG C H. Outstanding antioxidant pickering high internal phase emulsions by co-assembled polyphenol-soy β-conglycinin nanoparticles[J]. Food Research International, 2020, 136: 109509.

[12] MANTOVANI R A, RASERA M L, VIDOTTO D C, et al. Binding of carotenoids to milk proteins: why and how[J]. Trends in Food Science &Technology, 2021, 110: 280-290.

[13] 王金梅,夏宁,杨娟,等. 天然和热处理大豆蛋白稳定乳液的性质研究[J]. 中国粮油学报,2012,27(9):16-20.WANG J M, XIA N, YANG J, et al. Characterization of oil-in-water emulsion stabilized by native and heat-treated soy protein[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2012, 27(9): 16-20.

[14] ZHANG Y, CHEN S, QI B K, et al. Complexation of thermally-denatured soybean protein isolate with anthocyanins and its effect on the protein structure and in vitro digestibility[J]. Food Research International, 2018, 106: 619-625.

[15] ZHANG A Q, CUI Q, WANG X B, et al. Effect of temperature of preheated soy protein isolate on the structure and properties of soy protein isolate heated-vitamin D3 complex[J]. Journal of Food Biochemistry, 2021, 45(6): e13733.

[16] ZHANG G, HE L L, QI X, et al. Decreased formulation pH and protein preheating treatment enhance the interaction, storage stability, and bioaccessibility of caseinate-bound lutein/zeaxanthin[J]. Food Research International, 2024, 195: 114971.

[17] HE W J, MU H B, LIU Z M, et al. Effect of preheat treatment of milk proteins on their interactions with cyanidin-3-O-glucoside[J]. Food Research International, 2018, 107: 394-405.

[18] WANG C Y, LI J H, LI X, et al. Emulsifying properties of glycation or glycation-heat modified egg white protein[J]. Food Research International, 2019, 119: 227-235.

[19] INOUYE K, NAKANO M, ASAOKA K, et al. Effects of thermal treatment on the coagulation of soy proteins induced by subtilisin Carlsberg[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(2): 717-723.

[20] ZHANG W, JIN M R, WANG H, et al. Effect of thermal treatment on gelling and emulsifying properties of soy β-conglycinin and glycinin[J]. Foods, 2024, 13(12): 1804.

[21] ZHONG M M, SUN Y F, SUN Y D, et al. Soy lipophi-lic protein self-assembled by pH-shift combined with heat treatment: Structure, hydrophobic resveratrol encapsulation, emulsification, and digestion[J]. Food Chemistry, 2022, 394: 133514.

[22] WU D, TANG L, DUAN R, et al. Interaction mechanisms and structure-affinity relationships between hypero-side and soybean β-conglycinin and glycinin[J]. Food Chemistry, 2021, 347: 129052.

[23] LIU Y J, CAI Y X, YING D Y, et al. Ovalbumin as a carrier to significantly enhance the aqueous solubility and photostability of curcumin: interaction and binding mechanism study[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 116: 893-900.

[24] LI D J, ZHANG T, XU C, et al. Effect of pH on the interaction of baicalein with lysozyme by spectroscopic approaches[J]. Journal of Photochemistry and Photobio-logy B: Biology, 2011, 104(3): 414-424.

[25] SHPIGELMAN A, COHEN Y, LIVNEY Y D. Thermally-induced β-lactoglobulin-EGCG nanovehicles: loading, stability, sensory and digestive-release study[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 29(1): 57-67.

[26] JI F Y, XU J J, LIU H H, et al. Improved water solubility, antioxidant, and sustained-release properties of curcumin through the complexation with soy protein fibrils[J]. LWT, 2023, 180: 114723.

[27] CHEN M H, LI R Y, GAO Y Y, et al. Encapsulation of hydrophobic and low-soluble polyphenols into nanoliposomes by pH-driven method: naringenin and naringin as model compounds[J]. Foods, 2021, 10(5): 963.

[28] CONG J L, CUI J M, ZHANG H H, et al. Binding affinity, antioxidative capacity and in vitro digestion of complexes of grape seed procyanidins and pork, chicken and fish protein[J]. Food Research International, 2020, 136: 109530.

[29] BENZIE I F, STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1): 70-76.

[30] DONG Z Q, WANG R, WANG M Y, et al. Preparation of naringenin nanosuspension and its antitussive and expectorant effects[J]. Molecules, 2022, 27(3): 741.

[31] MINEKUS M, ALMINGER M, ALVITO P, et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food: an international consensus[J]. Food &Function, 2014, 5(6): 1113-1124.

[32] LI W F, ZHANG X H, TAN S, et al. Zein enhanced the digestive stability of five citrus flavonoids via different binding interaction[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2022, 102(11): 4780-4790.

[33] PENG X, LIU K, HU X, et al. Hesperetin-Cu(II) complex as potential α-amylase and α-glucosidase inhibi-tor: inhibition mechanism and molecular docking[J]. Spectrochimica Acta Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2023, 290: 122301.

[34] SHAKLAI N, YGUERABIDE J, RANNEY H M. Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore[J]. Biochemistry, 1977, 16(25): 5585-5592.

[35] 刘金杰, 马梦瑶, 谢岩黎, 等. 2种黑豆球蛋白与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相互作用研究[J]. 食品科学技术学报, 2024, 42 (4): 101-113.LIU J J, MA M Y, XIE Y L, et al. Study on interaction between two black bean globulins and cyanidin-3-O-glucoside[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024, 42(4): 101-113.

[36] 许雨晗, 孔宇, 杨本旭, 等. 亚麻籽水溶蛋白与红曲黄色素相互作用及其对色素稳定性的影响[J]. 食品科学技术学报, 2024, 42(4): 86-100.XU Y H, KONG Y, YANG B X, et al. Interaction between water-soluble flaxseed protein and Monascus yellow pigments and its effect on stability of pigments[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024, 42(4): 86-100.

[37] ZHANG X Y, SU J Q, WANG X Y, et al. Preparation and properties of cyclodextrin inclusion complexes of hyperoside[J]. Molecules, 2022, 27(9): 2761.

[38] 孙佳悦, 钱方, 姜淑娟, 等. 基于红外光谱分析热处理对牛乳蛋白质二级结构的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 82-86.SUN J Y, QIAN F, JIANG S J, et al. Effect of heat treatments on the secondary structure of milk proteins analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Food Science, 2017, 38(23): 82-86.

[39] YE G Y, WU T L, LI Z H, et al. Preparation and characterization of novel composite nanoparticles using zein and hyaluronic acid for efficient delivery of naringenin[J]. Food Chemistry, 2023, 417: 135890.

[40] TOMCZYSKA -MLEKO M, KAMYSZ E, SIKORSKA E, et al. Changes of secondary structure and surface tension of whey protein isolate dispersions upon pH and temperature[J]. Czech Journal of Food Sciences, 2014, 32(1): 82-89.

[41] WANG Y Y, WANG J P, WANG S J, et al. Modification of glutenin and associated changes in digestibility due to methylglyoxal during heat processing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(38): 10734-10743.

[42] 刘万路. 柚皮素磷脂酰胆碱复合物滴丸处方优化及口服药动学评价[J]. 中草药, 2023, 54(19): 6253-6263.LIU W L. Formulation optimization of naringenin-phosphatidylcholine complex dropping pills and oral pharmacokinetics evaluation[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2023, 54(19): 6253-6263.

[43] 何小燕, 彭颖, 何婉莺, 等. 柚皮素磷脂复合物的制备及其理化性质的研究[J]. 华中农业大学学报, 2019, 38(5): 137-142.HE X Y, PENG Y, HE W Y, et al. Preparation and physico-chemical properties of naringenin phospholipid complex[J]. Journal of Huazhong Agricultural Univer-sity, 2019, 38(5): 137-142.

[44] YANG F, HU S H, SHENG X, et al. Naringenin loaded multifunctional nanoparticles to enhance the chemotherapeutic efficacy in hepatic fibrosis[J]. Biomedical Microdevices, 2020, 22(4): 68.

[45] 李文洁, 赵渊, 付连霏, 等. 负载柚皮素的表没食子儿茶素没食子酸酯共价修饰的玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒的构建与表征[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(17): 139-147.LI W J, ZHAO Y, FU L F, et al. Fabrication and characterization of naringenin-loaded gallocatechin-gallate covalently modified zein-hyaluronic acid composite nanoparticles[J]. Food and Fermentation Industries, 2024, 50(17): 139-147.

[46] BEERMANN C, EULER M, HERZBERG J, et al. Anti-oxidative capacity of enzymatically released peptides from soybean protein isolate[J]. European Food Research and Technology, 2009, 229(4): 637-644.

[47] REN Y F, ZHU Y H, QI X, et al. Noncovalent interaction of chlorogenic acid and/or gallocatechin gallate with β-lactoglobulin: effect on stability and bioaccessibility of complexes and nanoparticles[J]. LWT, 2023, 175: 114493.

[48] QIE X J, YIN Z C, HE Z, et al. Interaction between β-casein and phlorizin induced by thermal treatment and its effect on the antioxidant activity and bioavailability of phlorizin in vivo[J]. Food Bioscience, 2023, 52: 102479.

[49] WANG Y F, WANG X Y. Binding, stability, and antioxidant activity of quercetin with soy protein isolate particles[J]. Food Chemistry, 2015, 188: 24-29.

[50] GAO H H, HOU N C, GAO X, et al. Interaction between Chinese quince fruit proanthocyanidins and bovine serum albumin: Antioxidant activity, thermal stability and heterocyclic amine inhibition[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 238: 124046.

[51] STASIOWICZ-KRZEMIE A, GOBIEWSKI M, PAZISKA A, et al. The systems of naringenin with solubilizers expand its capability to prevent neurodegenerative diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(2): 755.

[52] CHEN Y L, SU J Q, DONG W X, et al. Cyclodextrin-based metal-organic framework nanoparticles as superior carriers for curcumin: study of encapsulation mechanism, solubility, release kinetics, and antioxidative stability[J]. Food Chemistry, 2022, 383: 132605.

[53] CHAURASIA S, PATEL R R, VURE P, et al. Oral naringenin nanocarriers: fabrication, optimization, pharmacokinetic and chemotherapeutic efficacy assessments[J]. Nanomedicine, 2017, 12(11): 1243-1260.

[54] CHEN X, LEE D S, ZHU X T, et al. Release kinetics of tocopherol and quercetin from binary antioxidant controlled-release packaging films[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(13): 3492-3497.

[55] ZHU W W, LONG J J, SHI M W, et al. Release kine-tics model fitting of drugs with different structures from viscose fabric[J]. Materials, 2023, 16(8): 3282.

[56] KABAY G, DEMIRCI C, KALELI CAN G, et al. A comparative study of single-needle and coaxial electrospun amyloid-like protein nanofibers to investigate hydrophilic drug release behavior[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 114: 989-997.

[57] PULICHARLA R, MARQUES C, DAS R K, et al. Encapsulation and release studies of strawberry polyphenols in biodegradable chitosan nanoformulation[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 88: 171-178.

[58] PICOS-SALAS M A, LEYVA-LPEZ N, DE JESS BASTIDAS-BASTIDAS P, et al. Supercritical CO2 extraction of naringenin from Mexican oregano (Lippia graveolens): its antioxidant capacity under simulated gastrointestinal digestion[J]. Scientific Reports, 2024, 14: 1146.

[59] LAMMARI N, FROIIO F, LOUAER M, et al. Poly(ethyl acrylate-co-methyl methacrylate-co-trimethylammoniethyl methacrylate chloride) (eudragit RS100) nanocapsules as nanovector carriers for Phoenix dactylifera L. seeds oil: a versatile antidiabetic agent[J]. Biomacromolecules, 2020, 21(11): 4442-4456.

Effect of Heat-Treated Soybean 7S/11S Protein on Stability and Bioaccessibility of Naringenin and Their Interactions

DU Kexin1, WANG Mengfan1,*, PENG Xin1,2,*

(1. School of Life Sciences, Faculty of Medicine, Tianjin University, Tianjin 300072, China;2. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China)

Abstract：Naringenin (Nar), a natural flavonoid compound, exhibits diverse bioactivities. However, its application and development are limited by poor water solubility and stability. Soybean protein, a plant-based protein, is commonly used as a carrier for natural bioactive compounds, providing protection and delivery functions. In this study, heat-treated soybean 7S [H7S(pH 7.4),H7S(pH 2.0)]and 11S [H11S(pH 7.4),H11S(pH 2.0)] proteins were prepared at pH 7.4 and 2.0 to investigate their interaction mechanisms with Nar and to analyze the effects of complex formation on Nar’s stability and bioaccessibility. Fluorescence spectroscopy results indicated that Nar formed a 1∶1 complex with H7S/H11S through a static quenching mechanism. The binding forces between H7S and Nar, as well as H11S (pH 2.0) and Nar, were dominated by hydrogen bonds and van der Waals forces (ΔH0<0, ΔS0<0), whereas the primary interactions between H11S (pH 7.4) and Nar involved hydrogen bonds and hydrophobic interactions (ΔH0<0, ΔS0>0). Three-dimensional fluorescence spectroscopy, UV-Vis absorption spectroscopy, and infrared spectroscopy analyses revealed that their interaction altered the secondary structure of the proteins and increased the polarity of the microenvironment surrounding tryptophan and tyrosine residues. The maximum encapsulation efficiency of Nar by H7S/H11S reached 90.37%, and the formation of complexes significantly enhanced Nar’s water dispersibility, with maximum solubility increasing by 34.85-fold (in PBS with pH 7.4) and 48.84-fold (in PBS with pH 2.0), respectively. ABTS+ radical scavenging and FRAP assays demonstrated that the antioxidant capacity of the complexes was significantly higher than that of free Nar. Additionally, the complexes improved Nar’s hydrophilicity by reducing interfacial tension between Nar and the release medium, thereby promoted its release. The maximum release rates of Nar in PBS dialysis medium increased by 49.37% (pH=7.4) and 48.55% (pH=2.0) compared to its free state, with the release mechanism being non-Fickian diffusion, where the release rate was influenced by protein swelling and Nar’s diffusion path. Simulated digestion experiments showed that the complexes hindered digestive enzymes from contacting Nar, increasing its retention rate by 150.24% and improving bioaccessibility by 3.69-fold. The inhibitory effect of the complexes on enzyme activity exhibited a positive correlation with the release rate but was also influenced by the steric hindrance of the proteins. Except for the H7S-Nar complex prepared at pH 2.0, all other complexes enhanced Nar’s inhibitory effect on α-amylase activity, while slightly reducing its inhibitory activity against α-glucosidase. These findings provided new insights for further expanding the application of Nar in the food industry.

Keywords：soybean protein; heat treatment; naringenin; interaction; stability; antioxidant activity; bioaccessibility

中图分类号：TS214.2; TS201.2

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500189

文章编号：2095-6002(2025)06-0122-25

引用格式：杜可心, 王梦凡, 彭鑫. 热处理大豆7S/11S蛋白与柚皮素的相互作用及其对柚皮素稳定性和生物可及性的影响[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):122-146. DU Kexin,WANG Mengfan,PENG Xin, et al. Effect of heat-treated soybean 7S/11S protein on stability and bioaccessibility of naringenin and their interactions[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):122-146.

收稿日期：2025-04-04

基金项目：国家自然科学基金青年项目(21506152); 成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室开放基金资助项目(SKLTCM202315)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (21506152); Foundation of State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (SKLTCM202315).

第一作者：杜可心,女,硕士研究生,研究方向为天然产物提取与功能研究。

*通信作者：王梦凡,女,教授,博士,主要从事天然产物研究与开发方面的研究;彭 鑫,男,副教授,博士,主要从事天然产物研究与开发方面的研究。

(责任编辑：李 宁)