黄曲霉(Aspergillus flavus)具有极强的环境适应能力,广泛存在于储粮、运输及加工环节中,极易污染玉米、花生、大米、小麦等高淀粉类和高油脂类食品原料[1]。黄曲霉产生的毒素,特别是B1型毒素(AFB1)具有强致癌性、致突变性及免疫抑制作用,严重威胁食品安全和人类健康[2]。开发安全、高效且适用于食品体系的黄曲霉防控手段已成为生物防治领域的重要研究方向之一。近年来,多种微生物及其代谢产物被发现具有抑菌、抗霉和降解毒素的潜力[3],其中,链霉菌来源的天然代谢产物因稳定性强、生物活性显著,在食品安全领域表现出良好的应用前景。

研究表明,白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1菌株在抑制黄曲霉生长及毒素产生方面表现出显著的生物防治潜力。该菌株在发酵过程中可分泌一种聚酮类十六元大环内酯型抗生素——帕马霉素。帕马霉素已被证实能够有效抑制黄曲霉等多种有害真菌的生长繁殖,对黄曲霉2219产生的AFB1的抑制率高达98.3%[4],具备向天然食品保鲜剂、饲料添加剂乃至食品包装防霉材料方向开发的潜力。目前,帕马霉素发酵产量较低、合成路径复杂,限制了其工业化生产与广泛应用。因此,提高帕马霉素的发酵产率、挖掘其代谢调控机制,已成为实现其食品应用价值的关键[5]。

磷酸盐作为微生物生长与代谢的重要因子,是调控链霉菌次级代谢产物合成的影响因素之一[6]。研究表明,高浓度磷酸盐对某些微生物次级代谢产物的合成起负面调节作用,而低浓度磷酸盐环境能够激发某些微生物的次级代谢产物的合成[7]。Lounès等[8]发现,高浓度磷酸盐显著抑制链霉菌(Streptomyces ambofaciens)螺旋霉素的合成;Masuma等[9]通过降低培养基中的磷酸盐浓度,使玫瑰色链霉菌(Streptomyces rosa subsp.)的七尾霉素的合成显著增加。本课题组前期研究发现,在低浓度磷酸盐环境下,白黄链霉菌TD-1不仅具有良好的适应性,而且其帕马霉素的合成水平大幅度提高[10]。在微生物中,低磷胁迫调控主要由PhoR-PhoP与SenX3-RegX3双组分信号系统介导。PhoR-PhoP系统在链霉菌的研究中较为充分,广泛参与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等链霉菌的磷感知、调控磷酸盐代谢及抗生素合成等相关基因的表达[11-13];目前,仅在2种微生物中有过对SenX3-RegX3系统的研究报道,涉及调控须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)的多菌杀素合成[14]和分枝杆菌(Mycobacterium)生长及膜囊泡的生成[15-17]。白黄链霉菌TD-1的低磷调控路径尚不明确,其对帕马霉素合成的调控机制尚不清晰,亟待进行深入研究。

本研究拟利用转录组测序技术,比较低磷与常规条件下白黄链霉菌TD-1菌株的基因组表达差异。利用整合基因本体论(gene ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能和代谢通路富集分析手段,挖掘低磷条件下合成帕马霉素的关键功能基因,阐明低磷条件下帕马霉素的高效合成机制,为提高白黄链霉菌TD-1菌株发酵液中帕马霉素产量,发挥其在防治黄曲霉中的应用,保障食品安全提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1菌株由本实验室从天津市宝坻区饲料厂周围的土壤中分离筛选获得,保藏编号为CGMCC No.4666[18]。

1.1.2 培养基制备

1)ISP4发酵培养基制备。可溶性淀粉10 g/L,K2HPO4·3H2O 1 g/L,MgSO4·7 H2O 1 g/L,NaCl 1 g/L,蛋白胨2 g/L,CaCO3 2 g/L,FeSO4·7 H2O 0.001 g/L,MnCl2·4 H2O 0.001 g/L,ZnSO4·7 H2O 0.001 g/L。 pH值为7.2,121 ℃灭菌20 min。

2)ISP4低磷发酵培养基制备。在ISP4培养基配方基础上,通过调整K2HPO4的添加量,使磷酸盐终质量浓度为20、40、60、80、100、120、140、160 μmol/L。同时,为确保各组培养基中K+浓度一致,在低磷培养基中补充KCl,使所有处理组中K+浓度达到8 760 μmol/L(相当于1 g/L K2HPO4)。

1.1.3 实验试剂

乙酸乙酯(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯),天津康科德科技有限公司;逆转录试剂盒与qPCR试剂盒,Takara公司;TRIzol试剂盒,索莱宝公司。

1.2 仪器设备

BLBIO-5GC型5L磁力搅拌发酵罐,上海百伦生物科技有限公司;1200型高效液相色谱仪、MX3000型荧光定量PCR仪,美国Agilent公司;Allegra X-30型台式高速离心机,美国贝克曼公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低磷酸盐条件下白黄链霉菌TD-1的批式发酵

设置低磷组(ISP4低磷培养基,含120 μmol/L K2HPO4)与对照组(ISP4培养基,含4 380 μmol/L K2HPO4),在5 L发酵罐(BLBIO-5GC型)中进行批式发酵实验,装液体积为3 L。发酵系统配备pH电极和溶氧(DO)传感器,使用前分别进行标准校准,DO传感器采用两点法进行校准[19],pH电极使用pH值为4.00与7.00的标准缓冲液进行校准。发酵过程中温度由循环水浴控制在28～30 ℃,pH值通过自动添加体积分数为13%的氨水和13%的冰乙酸维持在6.8。通气速率6 L/min,搅拌速率根据DO水平动态调节(200～800 r/min),使溶氧水平维持在40%。总培养时间为120 h,每12 h采集样本,参照刘秀雨等[20]的方法测定菌体干重。

1.3.2 帕马霉素的提取与检测

发酵液以8 000 r/min离心5 min,去除菌体,取上清液与等体积乙酸乙酯混合,常温条件下以1 500 r/min磁力搅拌20 min后静置分层,收集上层有机相,使用旋转蒸发仪(45 ℃,50 r/min)浓缩至干。凝结物以原体积1/100的甲醇溶解,经0.22 μm有机滤膜过滤后用于高效液相色谱检测。

色谱分析采用5020-8973 Inertsustain AQ-C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测器DAD,检测波长230 nm。流动相为8 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈(二者体积比为8∶92),流速1 mL/min,柱温 45 ℃,进样量20 μL,总分析时长35 min。白黄链霉菌TD-1中共检测到3种帕马霉素同系物,分别为 Pamamycin-593、Pamamycin-621和Pamamycin-607。帕马霉素的定量分析采用外标法,根据Pamamycin-607标准溶液的浓度与峰面积绘制标准曲线,样品中各同系物的浓度均依据Pamamycin-607的响应系数进行计算,最终以3种主要同系物的浓度加和作为帕马霉素的总浓度。

1.3.3 转录组文库构建和质量控制

将在低磷组和对照组条件下培养48 h与96 h的发酵液,4 ℃,8 000 r/min离心5 min,收集菌体并迅速置于液氮中冷冻保存。随后,将样品送至美吉生物公司进行后续的总RNA提取、cDNA文库构建以及RNA-seq双端测序,每组样品均设置3个独立的生物学重复。测序获得的原始数据通过fastp(v0.24.1)[21]质控软件去除接头序列和低质量reads,保留基于Q20、Q30确定的Clean reads。利用Bowtie2(v2.5.4)软件将Clean reads比对至NCBI数据库中白黄链霉菌TD-1参考基因组的序列上。

1.3.4 表达差异基因的筛选和功能富集分析

利用RSEM(v1.1.17)软件对测序数据进行基因表达量分析,以每百万条reads的转录本(transcript per million, TPM)为定量指标,进行归一化表示。差异表达基因用DEseq2(v1.48.0)软件进行分析[22],具体方法:基于各组样本的read count平均值计算差异倍数(Fold Change, FC),并根据显著性水平Padj及多重检验校正方法(Benjamini-Hochberg, BH),计算错误发现率(false discovery rate, FDR)[23]。定义|log2 FC|≥1,Padj≤0.05且FDR≤0.05的基因为显著差异表达基因(DEGs)。依据差异基因的检测结果进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,Padj<0.05的通路定义为显著富集的通路。

1.3.5 实时荧光定量PCR分析

为验证RNA-seq实验结果,选择senX3、regX3、pstS等与双组分系统相关的8个基因,pamA、pamB等与帕马霉素生物合成相关的8个基因以及pyk、accA、alaA、fabF、birA等与帕马霉素前体代谢相关的20个基因进行RT-qPCR分析,引物设计参照刘丹[10]的方法,引物序列见附录附表1。采用TRIzol法提取白黄链霉菌TD-1总RNA,并使用反转录试剂盒进行反转录。反应条件:37 ℃保持15 min;升温至85 ℃保持5 s;4 ℃保持。RT-qPCR程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,40个循环;58～95 ℃收集溶解曲线;最终 95 ℃保持15 s。以16S rRNA为内参基因,采用2-ΔΔCt方法进行相对定量。

1.4 数据处理

所有实验数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示,采用SPSS软件进行统计分析。通过单因素方差分析(ANOVA)或t检验进行显著性检验,显著性水平设定为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns表示差异无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对白黄链霉菌TD-1生长及帕马霉素合成的影响

依据前期LCMS-IT-TOF分析结果,帕马霉素的高效液相色谱及标准曲线如图1所示。由图1(a)可知,白黄链霉菌TD-1发酵液中共检测到3个主要同系物:Pamamycin-593(10.419 min)、Pamamycin-621(11.007 min)和Pamamycin-607(12.801 min)。利用Pamamycin-607标准品绘制标准曲线[图1(b)],其回归方程为y=37.908+482.29x,且R2=0.993,线性关系良好。

由于无法获得除Pamamycin-607外的其他2种同系物标准品,且其结构与Pamamycin-607相近,仅在侧链(H或CH3)上存在差异,对230 nm处的紫外吸收影响较小,因此,以Pamamycin-607的响应系数估算3者的浓度,最终计算总帕马霉素含量。

前期研究发现,培养基中磷酸盐浓度对白黄链霉菌TD-1的帕马霉素产量影响较大[10]。为进一步明确白黄链霉菌TD-1对磷酸盐浓度的响应规律,使用含有不同浓度磷酸盐的ISP4培养基培养白黄链霉菌TD-1,研究菌株生长与帕马霉素产量的变化规律,结果如图2所示。

由图2(a)可知,在基础培养基(含4 380 μmol/L K2HPO4)(对照组)中,TD-1菌株生长最快,108 h时菌体质量浓度达到最大值(4.43 g/L);当培养基中的磷酸盐浓度降低时,白黄链霉菌TD-1菌株的生长受到抑制,且呈现出磷酸盐浓度越低生长越缓慢的趋势。由图2(b)可知,培养基中的磷酸盐浓度能够显著影响帕马霉素的合成。对照组中白黄链霉菌 TD-1 的帕马霉素产量达到5.72 mg/L;随着磷酸盐浓度从0增加到160 μmol/L,帕马霉素的产量呈现先增加后降低的趋势,并在磷酸盐浓度为120 μmol/L时,TD-1菌株代谢产生的帕马霉素产量达到19.86 mg/L,比对照组提高了2.47倍(P<0.001)。

为系统研究低磷条件对菌体生长及帕马霉素合成的影响,选择了120 μmol/L的磷酸盐胁迫浓度,以基础培养基为对照,进行5 L发酵罐批式发酵培养,测定菌体干重及帕马霉素产量随时间变化规律,结果如图3所示。

在图3(a)中,TD-1菌株在2种培养基中的生长趋势相近,与对照组相比,低磷组生长较为缓慢,从36 h起,TD-1菌株在低磷培养基中的菌体干重显著低于对照组(P<0.05)。由图3(b)可知,对照组与低磷组的帕马霉素产量都随时间呈现先升高后降低的趋势,2个处理组均在96 h达到帕马霉素产量最大值,分别为14.55、29.22 mg/L;从48 h起,低磷组的帕马霉素产量显著高于对照组(P<0.01),且在96 h差异最大,此时低磷组帕马霉素的产量是对照组的2倍(P<0.001)。这一现象与已有研究中磷酸盐负调控多种抗生素与次级代谢产物的合成相一致[24-25]。

2.2 转录组数据处理与质量控制分析

为进一步探讨低磷酸盐胁迫下白黄链霉菌TD-1代谢产生帕马霉素的分子机制,选取低磷组和对照组批式发酵48 h菌体(命名为L2、N2)和96 h菌体(命名为L4、N4)进行转录组测序,数据质量统计结果见表1。表1显示,每个平均文库质控后读序数量都超过1 000万条;质控后总碱基数量均超过2亿bp;质控后碱基错误率稳定维持在0.02%左右,质控后Q20数据均不低于97%,质控后Q30数据均不低于93%,说明所有数据的测序深度高、覆盖度广,表1数据准确可靠。

2.3 低磷胁迫条件下白黄链霉菌TD-1差异表达基因分析

为探讨低磷酸盐胁迫对白黄链霉菌TD-1基因表达的影响,基于DESeq2算法(|log2FC|≥1,Padj≤0.05,FDR≤0.05),分析TD-1菌株在低磷组和对照组48 h和96 h的差异表达基因DEGs,结果如图4所示。由图4(a)可知,在TD-1菌株批式发酵48 h时,低磷组与对照组(L2与N2)的DEGs的数量较少,共鉴定出599个基因显著上调,56个基因显著下调;由图4(b)可知,在批式发酵96 h时,低磷组与对照组(L4与N4)的DEGs数量显著增加,共鉴定出1 777个基因显著上调,8 025个基因显著下调。两组处理的DEGs数量在96 h的大幅增加可能与菌体生长和磷源消耗过程有关。随着培养时间的延长,菌体生物量增加,导致磷源的持续消耗,环境中磷源减少,从而引发低磷胁迫调控的升级,表现为表达水平发生变化的基因大量增加。类似现象也见于番茄[26]、油棕[27]和大麦[28],这些植物在低磷胁迫时均表现出DEGs数量随时间增加的趋势。本研究中,DEGs在发酵96 h大量出现,说明此时低磷响应与调控更加活跃,因此,后续将聚焦于L4与N4转录组的DEGs分析。

2.4 低磷响应基因的GO功能分析与KEGG通路分析

2.4.1 低磷响应基因的GO功能富集分析

为深入解析低磷酸盐胁迫条件下白黄链霉菌TD-1转录过程中DEGs的主要功能分类,对转录组L4与N4的上调DEGs和下调DEGs进行了GO功能富集分析,结果如图5所示。由图5(a)可知,上调的DEGs,在P值排序前20条功能条目中,主要包括细胞过程、初级代谢过程、翻译过程、蛋白质代谢过程等生物过程类别条目和胞内非膜结合细胞器细胞组分类别条目。表明,低磷酸盐环境激活了白黄链霉菌TD-1的多种基础代谢功能。由图5(b)可知,下调的DEGs的前20条显著富集功能条目中,主要包括小分子传感器活性、磷酸转移传感器激酶活性、蛋白激酶活性等分子功能类别条目,磷酸转移信号传导系统、细胞内信号转导等生物过程类别条目,膜组分等细胞组分类别条目。该结果表明,低磷酸盐胁迫显著改变了白黄链霉菌TD-1的信号转导通路和膜结构。

2.4.2 KEGG通路富集分析

为识别DEGs在代谢通路中的位置及潜在功能,利用KEGG数据库对转录组L4与N4的DEGs进行了代谢通路富集分析,结果如图6所示。由图6(a)可知,上调的DEGs富集于173条通路[图6(a)中显示了前20条通路],其中,显著富集的通路包括核糖体(52个基因)、氧化磷酸化(42个基因)、三羧酸循环(25个基因)、细菌分泌系统(13个基因)、蛋白质输出(14个基因)以及丙酮酸代谢(29个基因)等能量代谢及分泌相关途径。由图6(b)可知,下调的DEGs富集于204条通路[图6(b)中显示了前20条通路],其中,显著富集的通路为生物素代谢(28个基因)和脂肪酸生物合成(40个基因)。这表明,白黄链霉菌TD-1可能通过增强能量代谢和胞外分泌能力适应低磷酸盐环境,同时抑制脂质与辅因子合成,完成代谢重编程。后续将重点解析与帕马霉素合成相关的关键代谢途径基因,阐明低磷酸盐胁迫促进帕马霉素合成的分子机制。

2.5 帕马霉素基因簇转录组基因表达水平分析

帕马霉素的生物合成途径及其基因转录水平见图7。由图7(a)可知,帕马霉素生物合成的前体物质包括乙酰辅酶A、丙二酰/甲基丙二酰辅酶A及琥珀酰辅酶A,这些前体物质经酮基合酶、酰基转移酶、酮还原酶、水合酶等作用,最终合成大环内酯类次级代谢产物——帕马霉素。由图7(b)可知,帕马霉素合成途径中各个酶的编码基因在基因组上组成了一个基因簇,在低磷酸盐胁迫下,帕马霉素合成基因簇整体基因表达量显著上调,仅pamH基因呈现下调趋势。其中,运输基因pamW的表达量水平最高,其编码假定的帕马霉素输出蛋白[5],表明帕马霉素分泌活性较高;其余基因中,聚酮骨架合成核心基因(pamA、pamB、pamD、pamO 等)上调幅度较大,修饰模块基因(pamY、pamC)的上调幅度较小。这些结果表明,低磷酸盐环境显著激活了白黄链霉菌TD-1帕马霉素合成基因簇的表达,增强了帕马霉素聚酮链的延伸和修饰过程,并促进其分泌,从而表现出帕马霉素产量的提高。研究表明,帕马霉素能够干扰金黄色葡萄球菌的核苷和游离碱基运输及无机磷酸盐的吸收[29],因此,白黄链霉菌TD-1在应对长期的磷限制压力时,可能通过合成帕马霉素来抑制竞争微生物的生长和无机磷酸盐的吸收,从而提高环境磷源可利用性,来获取生存优势[30-32]。

2.6 低磷胁迫诱导的全局转录调控

基于低磷组与对照组的代谢通路基因转录数据变化,绘制了全局代谢网络图,如图8所示。在低磷酸盐环境下,显著上调的基因中,糖酵解/糖异生途径基因(pfk、pgi、tpiA、pgk等)、丙酮酸代谢通路基因(pyk、ppc、aceE、pccB、accA等)、TCA循环基因(gltA、acnA、icd、sucA/B/C/D等)以及氨基酸代谢途径基因等表达的增强,有利于加快葡萄糖代谢,将其转化为乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A等帕马霉素合成前体。同时,氧化磷酸化途径基因F0F1-ATP合酶亚基基因(atpA-atpG)等表达量的上调,有利于提高能量供给,为帕马霉素的合成中聚酮链延伸、糖基化修饰等耗能步骤提供驱动力[33];nuo基因簇(nuoA-nuoN)基因的上调能够促进氧化还原平衡,恢复帕马霉素过量合成可能导致的还原力失衡[34-35]。

在显著下调的基因中,包括脂肪酸代谢途径基因(fabG、fabH、fabF、fadD等)以及生物素途径合成关键基因(birA、bioA、bioB、bioD等)。这些途径基因的下调有利于减少乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的消耗,提高帕马霉素的前体浓度;同时减轻还原力NADPH的消耗,用于供给帕马霉素合成。

类似前体调控策略已见报道,如Kong等[36]通过表达乙酰辅酶A合成酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶,使褐黄孢链霉菌纳他霉素产量分别提高了44.19%和20.51%;Wang等[37]通过表达基因支链氨基酸关键酶ilvE,有效促进支链氨基酸的合成,增加前体物质的供应,使纳塔伦链球菌的纳他霉素产量提高了78.72%。

2.7 低磷胁迫条件下白黄链霉菌TD-1的信号响应机制

在革兰氏阳性菌中,SenX3-RegX3与PhoR-PhoP是两类常见的参与磷源感知与调控的双组分系统,通常由一个膜上感知低磷环境刺激的组氨酸激酶(HK)和一个相应的调控蛋白(RR)组成。在本研究中,白黄链霉菌TD-1所有样品的转录组中仅能够检测到senX3和regX3基因的表达,而未检测到phoR和phoP基因的表达。提示白黄链霉菌通过SenX3-RegX3系统响应磷源感知,而不是PhoR-PhoP系统。此外,在已报道的白黄链霉菌基因组中均未发现与phoR和phoP基因同源的序列,表明PhoR-PhoP系统的缺失是白黄链霉菌的普遍现象。根据现有文献报道,阿维菌素[38]、格尔德霉素[39]、匹马菌素[40]等链霉菌次级代谢产物的合成均受到PhoR-PhoP系统调控,尚未在链霉菌中发现SenX3-RegX3系统调控次级代谢产物的报道。本研究发现,白黄链霉菌TD-1的SenX3-RegX3系统活跃,而PhoR-PhoP系统缺失,这表明白黄链霉菌TD-1在低磷感知与适应方面可能与其他链霉菌存在不同的进化过程。

SenX3-RegX3系统调控机制及基因表达量水平如图9所示。由图9(a)可知,senX3基因的编码蛋白能够感知低磷信号发生自磷酸化,从而被激活,活化的SenX3可将RegX3磷酸化,进而激活其调控功能,上调pstSCAB、phoA、phoD、ppk、glpQ1等基因的表达。磷酸盐转运系统PstSCAB是低磷条件下细胞主动摄取无机磷的主要途径;碱性磷酸酶PhoA、磷脂酶PhoD参与胞外有机磷的水解释放,多磷酸盐激酶PPK促进胞内多磷酸盐的分解再利用,甘油磷酸二酯水解酶GlpQ则参与膜磷脂的降解过程,这些基因的上调可提升细胞对磷源的获取和利用效率,从而提高菌体在磷缺乏条件下的生存和代谢适应能力。

由图9(b)可知,SenX3-RegX3系统表达水平的上调,反映出白黄链霉菌TD-1在受到低磷胁迫时主要启动SenX3-RegX3系统来调控低磷响应。SenX3-RegX3系统的研究目前在分枝杆菌中较为充分,发现SenX3-RegX3系统通过响应低磷酸盐信号转变细胞代谢,促进囊泡生成,使菌株在低磷条件下保持生长并形成毒力[41-42],另有研究表明,SenX3-RegX3也可调控须糖多孢菌次级代谢产物的合成,regX3基因的缺失会使须糖多孢菌持续增长,但丁烯基多杀菌素产量降低,其机理是磷酸化激活的regX3可能通过整合磷饥饿信号与初级代谢重编程,间接调控丁烯基多杀菌素生物合成基因簇的表达[14]。结合本研究中低磷条件下初级代谢(糖酵解、脂肪酸代谢等)、次级代谢(帕马霉素合成等)和SenX3-RegX3信号通路关键基因表达水平均发生显著变化,推测磷酸化的RegX3可能将磷饥饿信号与帕马霉素合成通路偶联,调控磷酸盐代谢并间接激活帕马霉素基因簇的表达,从而促进帕马霉素的生物合成。

SenX3-RegX3系统介导磷饥饿响应与代谢重编程,驱动帕马霉素高效合成的调控机制分析建立在发酵96 h转录组数据的基础上,与发酵48 h时的调控机制存在差异。发酵48 h时共检测到655个DEGs(599个基因显著上调,56个基因显著下调)。进一步对DEGs进行GO与KEGG分析,得到图10和图11。

由图10(a)和图11(a)可知,低磷条件下,上调基因主要富集于蛋白质合成与加工过程[BP1(翻译)、BP2(肽生物合成)等GO条目以及蛋白质在内质网上的加工等KEGG通路],高效的蛋白合成与加工有助于增强细胞的环境适应性;由图10(b)和图11(b)可知,下调基因主要富集于细胞壁成分的分解过程(如BP1:几丁质分解代谢过程等GO条目)和ABC转运蛋白等KEGG通路,说明菌体减弱了细胞壁的更新与重塑,同时降低了物质的跨膜运输,这有助于减少细胞消耗,实现对有限资源的保守利用。此时,帕马霉素前体代谢途径基因(除fbaA、nuoA、nuoB显著上调外)、帕马霉素合成基因簇(图12)、SenX3-RegX3双组分系统(图13)的表达水平均变化不大,推测此时环境磷浓度尚未达到SenX3-RegX3双组分系统的信号识别阈值。

研究结果表明,白黄链霉菌TD-1具有阶段性的低磷响应机制,在低磷胁迫前期(48 h),环境中存在一定的磷源,此时调控幅度较小,表现为蛋白翻译的增强和资源利用的节约;在低磷胁迫后期(96 h),环境磷源持续降低,激活SenX3-RegX3双组分系统,进而调控多个代谢过程,增强磷的利用,并高效合成帕马霉素,抑制环境中其他微生物对磷的吸收。

2.8 低磷调控相关基因表达水平的实验验证

为验证低磷胁迫下白黄链霉菌TD-1帕马霉素合成增强的调控机制,从转录组测序结果选取了36个相关基因,采用RT-qPCR法测定其表达水平。将RT-qPCR测定结果与基于转录组学测序结果进行比较,见图14。由图14可以看出,pamA、pamB、BioB、FabF、SenX3、ppk、pyk、atpA等大部分基因表达趋势与转录组数据结果相一致,pamJ、pamK、nuoA等基因未呈现出显著的差异。该结果进一步验证了RNA-seq数据结果的可靠性。

3 结 论

以白黄链霉菌TD-1为研究对象,通过RNA-seq揭示了白黄链霉菌TD-1在低磷酸盐条件下的基因表达模式,发现了低磷酸盐胁迫对白黄链霉菌TD-1的调控变化规律以及低磷信号通过SenX3-RegX3双组分系统介导磷饥饿响应的机制。低磷胁迫条件下,白黄链霉菌TD-1通过上调诱导帕马霉素合成途径基因的表达,促进帕马霉素合成前体物质(丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、琥珀酰辅酶A等)积累以及增强能量供给和还原力稳态等方面重构代谢网络,以大幅度加强帕马霉素的生物合成。

本研究主要集中于转录组层面的分析,虽然采用RT-qPCR技术对关键基因的转录水平进行了实验验证,但缺乏蛋白水平的实验支持。未来可结合蛋白质组学、代谢组学等多组学数据以及基因敲除与合成生物学等手段,进一步揭示白黄链霉菌TD-1菌株在低磷酸盐条件下促进帕马霉素高效合成的关键调控因子及其作用机制。本研究旨在从转录组水平揭示白黄链霉菌TD-1响应低磷信号、增强次级代谢产物——帕马霉素合成的分子机制,体现其在逆境中通过代谢调控提升次级代谢产物合成以增强其生存竞争力的适应策略,希望为帕马霉素的高效生产提供新型靶点与框架,也为其在防治黄曲霉污染、保障粮食及食品安全中的应用奠定理论基础。

附录:补充数据

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Appendix：supplementary data

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Study on Mechanism of Low-Phosphate Stress Activated Efficient Pamamycin Biosynthesis in Streptomyces alboflavus TD-1 Based on Transcriptomic Analysis

DONG Zehua1, ZHAO Hailei1, LI Wangqiang1, GUO Qingbin1,2, DING Wentao1,2,*, WANG Changlu1,2,*

(1.School of Food Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2. State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Abstract：Pamamycin, produced by Streptomyces alboflavus TD-1, showed good application prospects in the prevention and treatment of Aspergillus flavus due to its significant biological activity. In order to break through the bottleneck of low pamamycin production, the molecular regulation mechanism of low-phosphate conditions to promote the efficient synthesis of pamamycin was analyzed by transcriptome sequencing and RT-qPCR technology with Streptomyces alboflavus TD-1 as the research object. The results showed that compared with the control group, the low phosphorus condition significantly increased the level of pamamycin synthesis by Streptomyces alboflavus TD-1 (2.01-fold increase in pamamycin production at 120 μmol/L phosphate concentration). Transcriptome analysis showed that 655 differentially expressed genes (DEGs) were detected after 48 h of culture under low phosphorus conditions. At 96 h, the number of DEGs increased to 9 802, including 1 777 up-regulated genes and 8 025 down-regulated genes. GO and KEGG analyses showed that DEGs were significantly enriched in GO terms such as translation and primary metabolic processes, as well as KEGG pathways such as ribosome synthesis and TCA cycle. Metabolic pathway analysis further found that low phosphorus stress activated the expression of genes in the pamamycin synthesis pathway genes, the central carbon metabolism pathway genes, and the SenX3-RegX3 two-component system genes. At the same time, it inhibited the expression of genes in the precursor competitive pathway of pamamycin, such as biotin synthesis genes (bioA, bioB) and fatty acid synthesis genes (fabF, fabH). The results showed that under low phosphorus conditions, Streptomyces albus TD-1 sensed phosphorus signals through the SenX3-RegX3 two-component system, activated central carbon metabolism and inhibited fatty acid synthesis, so as to accumulate the precursor of pamamycin synthesis and activate the expression of pamamycin synthesis genes to promote its efficient synthesis. The aim of this study was to provide a basis for the efficient biosynthesis of pamamycin and promote its application in the biological control of Aspergillus flavus.

Keywords：Streptomyces alboflavus; low phosphate stress; pamamycin; transcriptomic analysis; secondary metabolites

中图分类号：TS201.3; TS210.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500218

文章编号：2095-6002(2025)06-0107-15

引用格式：董泽华,赵海磊,李王强, 等. 基于转录组学的低磷胁迫激活白黄链霉菌TD-1高效合成帕马霉素机制研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):107-121. DONG Zehua, ZHAO Hailei, LI Wangqiang, et al. Study on mechanism of low-phosphate stress activated efficient pamamycin biosynthesis in Streptomyces alboflavus TD-1 based on transcriptomic analysis[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):107-121.

收稿日期：2025-04-16

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31972177)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (31972177).

第一作者：董泽华,女,硕士研究生,研究方向为发酵食品与微生物新资源开发。

*通信作者：丁文涛,男,助理研究员,主要从事合成生物学等方面的研究;王昌禄,男,教授,博士生导师,主要从事食品生物技术等方面的研究。

(责任编辑：叶红波)