α-D-葡萄糖-1-磷酸(α-D-glucose-1-phosphate, α-G1P)是由一分子的葡萄糖和一分子的磷酸缩合而成,有治疗脂肪肝[1]、增加骨骼和牙齿中钙的积累[2]、治疗癌症[3]的潜在功效。在生物能源应用方面,α-G1P可以用于糖驱动的酶燃料电池[4](enzymatic fuel cells, EFCs),在新兴的绿色能源中具有发展潜力。除此以外,α-G1P是糖原分解反应产生的第一个中间产物[5],也可以进一步转变成α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-glucose-6-phosphate, G6P)参与更多的代谢和级联反应[6],生产如阿洛酮糖[7]、塔格糖[8]等多种功能糖,应用于食品工业领域。α-G1P可由酶催化形成,主要涉及催化蔗糖的蔗糖磷酸化酶和催化可溶性淀粉的α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphory-lase, αGP)[9]。蔗糖磷酸化酶在生成α-G1P的反应中[10],糖基单元未被充分利用,导致理论转化率仅为50%,而αGP则不存在这样的问题[11]。

αGP属于GT35糖基转移酶家族(EC 2.4.1.1)[12],可以催化α-1,4-糖苷键连接的长链葡聚糖与磷酸发生磷酸解反应生成α-G1P[13]。αGP的产物广泛应用在食品、医药领域,但目前关于αGP的重组表达大多使用的是模式微生物大肠杆菌(Escherichia coli),关于其食品级表达制备的研究虽然已有报道[14],但是研究较少且深度不足。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生长培养基成本低廉[15],并且在工业发酵中具有良好的稳定性[16],同时还具有优秀的蛋白分泌表达能力[17],因此被广泛地用于食品相关蛋白基因的重组表达[18]。与常用的发酵宿主大肠杆菌相比,枯草芽孢杆菌作为食品代谢工程表达宿主更具有优势[19],其不含有内毒素[20],不具有致病性,并且同样是模式生物,具有清晰的遗传背景[21],适应于各种基因操作手段[22]。

本研究将热袍菌SG1(Thermotoga sp. SG1)来源的α-葡聚糖磷酸化酶ThαGP在枯草芽孢杆菌中进行异源表达,并且优化其启动子这一表达元件,填补新型菌株来源的ThαGP基因在枯草芽孢杆菌中异源表达的空缺。同样为了能够实现工业化生产应用,研究进一步优化了摇瓶发酵条件以提高ThαGP基因的表达水平。此外,探究了在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的宿主中发酵的ThαGP生产α-G1P的能力,并复配普鲁兰酶(pullulanase, PA)和4-α-葡聚糖转移酶(4-α-glucosyltransferase, 4GT)以提高 α-G1P 的转化率。希望研究可为ThαGP的食品级发酵制备和α-G1P的工业化生产提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 质粒与菌株

大肠杆菌JM109、载体pHY300PLK,大连宝生物有限公司;枯草芽孢杆菌WS9,本研究团队前期构建与保藏[23];4GT,本研究团队前期构建及保藏[24];质粒pET-20b(+)-thαgp,南京安升达生命科学技术有限公司合成。

1.1.2 主要试剂

质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,北京天根生化科技有限公司;G6P检测试剂盒(WST-8法)、P0015L蛋白上样缓冲液(5×)、Bradford蛋白浓度试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司;琼脂糖、溶菌酶、氨苄青霉素、四环素,上海生工生物工程股份有限公司;蛋白胶快速制备试剂盒,美国Bio-Rad公司;DNA分子量标准试剂,烟台市东盛生物科技有限公司;彩色预染蛋白分子量标准试剂(8～180 kDa),上海翌圣生物科技股份有限公司;PA、隆科特豆粕粉(TP),山东隆科特酶制剂有限公司;酵母浸膏(AR),上海麦克林生化科技有限公司;骨蛋白胨(TP),青岛瑞斯凯尔生物科技股份有限公司;牛肉蛋白胨(AR),杭州木木生物科技有限公司;棉籽饼粉(TP),北京鸿润宝顺科技有限公司;西王豆粕粉(TP),山东西王集团有限公司;安琪酵母粉(AR),湖北安琪酵母股份有限公司;玉米浆干粉(TP),上海维塔化学试剂有限公司;牛肉浸膏(AR)、大豆蛋白胨(AR),北京沃凯生物科技有限公司;葡萄糖(AR)、甘油(AR)、马铃薯淀粉(AR)、一水合麦芽糖(AR)、蔗糖(AR)、玉米糊精(AR)、果糖(AR)、木糖(AR)、乳糖(AR)、可溶性淀粉(AR)、蔗糖(AR)、NaCl(AR)、酵母粉(AR)、蛋白胨(AR)、KH2PO4(AR)、K2HPO4(AR),上海国药集团化学试剂有限公司;玉米淀粉,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验所用其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ProFleTM型PCR仪、Mini Protein Tetra型蛋白胶电泳仪、GelDoc-It型凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司;ZQZY型振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;UV-1800型紫外可见分光光度计,上海棱光仪器仪表厂;小型台式离心机,德国Eppendorf公司;SCIENTZ-IID型超声破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基及培养条件的确定

1)LB液体培养基。10 g/L NaCl,5 g/L酵母粉,10 g/L蛋白胨。

2)LB固体培养基。LB液体培养基加入质量分数2%琼脂粉制成。

3)TB液体培养基。24 g/L酵母粉,2.31 g/L KH2PO4,5 g/L甘油,12 g/L蛋白胨,12.54 g/L K2HPO4。

4)摇瓶种子液培养。将保存在-80 ℃冰箱中的甘油管里的目的菌株接种到10 mL的LB中,接种量为2‰,而后在37 ℃、200 r/min的条件下培养8～10 h。

5)摇瓶发酵培养。将培养好的种子液转接到优化后的发酵培养基中,接种量为5%,在37 ℃、200 r/min的条件下培养2 h后,而后将温度降至33 ℃或指定温度条件下继续培养36 h或更长时间。

1.3.2 ThαGP酶活的测定

酶活单位的定义:每分钟ThαGP催化1 μmol麦芽糊精分解产生α-G1P所需的酶量。

体系中含有50 μL终浓度50 g/L的底物麦芽糊精、30 μL终浓度600 mmol/L的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH=7.0)中,在50 ℃水浴锅中预热10 min后,向体系加入稀释一定倍数的20 μL酶液,准确反应60 min后沸水浴20 min终止反应,所得终产物偶联α-磷酸甘油酸变位酶(α-phosphoglucomutase, α-PGM)与G6P检测试剂盒(WST-8法)在450 nm波长处测定吸光值[25],根据标准曲线对应的吸光值计算α-G1P的含量。

1.3.3 重组菌株的构建

根据本研究团队前期挖掘的热袍菌SG1来源的α-葡聚糖磷酸化酶ThαGP(NCBI 登录号: WP_101513542.1),通过一步克隆[26]的基因操作手段将质粒载体pET-20b(+)-thαgp更换为质粒载体pHY300PLK,构建流程如图1所示。

图1 重组质粒构建流程

Fig.1 Recombinant plasmid construction process

以引物300-ThαGP-F/300-ThαGP-R对目的基因进行PCR扩增,以引物ThαGP-300-F/ThαGP-300-R对载体进行PCR扩增(具体引物序列如表1所示),扩增条带经过琼脂糖凝胶电泳验证后,切割目的条带进行胶回收,使用一步克隆法进行片段连接。而后通过化学转化法转入大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布到含有氨苄青霉素的固体平板上,在 37 ℃ 条件下过夜培养12 h,挑取转化子进行菌落PCR验证,同时测序片段是否突变。

表1 引物序列信息

Tab.1 Sequence information of primers

引物名称引物序列(5′→3′) ThαGP-300-FCAAATAAGGAGTGTCAAGAATGCTGAAAAAACTGCCGGAA300-ThαGP-RCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTG300-ThαGP-FTAAAAGCTTGGTAATAAAAAAACACCThαGP-300-RTTTTTATTACCAAGCTTTTAGCCCAGCACTTTTTTCCACACgapA-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCATGATTGTTTCCTCCTTTAAATAAGgapA-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATCGAGGCTTACTTTAAAAAGCCgsiB-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCTATCGAGACACGTTTGGCTGGsigB-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATTTTGAATTCCTCCTTTAATTGGTGhag-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCATTGTTTTGTTCCTCCCTGhag-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATGGATTTTTTTATTTTTGTATTAACAAAATCmdh-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCATGTCTCTCTTCTCCTTTATGGCmdh-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATCGACTGAAGTGAAATGTTCAGAGsigX-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCTTTGAAACCCCTCCGTTCACsigX-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATAGGTTATAAATTTGAGGTCGGCSpovG-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCAAAAGCAGTCCACACAAAACATGSpovG-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCCTATATAAAAGsrf-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCsrf-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATATTGTCATACCTCCCCTAATCTTTATAAGHpall-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCAAGCTTCTAGATTCTCAAAAAATACTACCHpall-RGTTTTCCGGCAGTTTTTTCAGTAAATCGCTCCTTTTTAGGTGGamyE-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCTAGAGTGATTGTGATAATTTTAAATGamyE-RGGTTTTCCGGCAGTTTTTTCAGCATTCTTGACACTCCTTATTTGfusA-FCTATGGAAAAACGCTTTGCCCCTGGTGCTGCTGTTAAGAAACfusA-RGGCAGTTTTTTCAGCATTGGGTAATTTCTCCTTCCTTATTAGSpovG-amyQ-FGGGAAAAGGTGGTGAACTACTGGCGGCGTTCTGTTTCTGCSpovG-amyQ-RGGTTTTCCGGCAGTTTTTTCAGCATCATTCTTGACACTCCTTASpovG-srf-FGGGAAAAGGTGGTGAACTACTATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCSpovG-srf-RCCGGCAGTTTTTTCAGCATATTGTCATACCTCCCCTAATCTTTATAAG

1.3.4 重组ThαGP的表达与分析

将验证正确的重组质粒pHY300PLK-amyQ-thαgp通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌WS9感受态细胞中,而后涂布于含有四环素的固体平板上,在37 ℃条件下过夜培养8～12 h后,挑取转化子菌落PCR验证。验证成功的转化子经过LB活化,转接到发酵所用的摇瓶中,发酵36 h。而后,将菌株发酵的菌液稀释一定倍数,在600 nm波长下,使用紫外可见分光光度计读取稀释菌液的吸光值,再乘以稀释倍数得到的值称作菌体浓度,简称OD600值,记录菌株发酵的OD600值。吸取1 mL菌液,12 000 r/min离心5 min后的上清液即为发酵上清液。由于枯草芽孢杆菌内存在大量的非目的蛋白,因此在分析其胞内蛋白表达时,往往根据实际菌体浓度计算出OD600值为5时所对应的菌液体积,吸取菌液进行研究。12 000 r/min离心5 min后弃去上清液,加入1 mL的pH为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(4-hydroxyerhyl piperazine erhanesulfonic acid, HEPES)复溶,经过超声破碎仪破碎细胞后,12 000 r/min离心5 min后的上清液即为破壁上清液,此时的沉淀即为破壁沉淀。测定发酵上清液和破壁上清液的酶活,同时在20 μL的发酵上清液和破壁上清液分别加入5 μL的蛋白上样缓冲液(5×),在破壁沉淀中加入20 μL的蛋白上样缓冲液(5×),混合均匀后在100 ℃条件下金属浴15 min,12 000 r/min离心1 min。按照蛋白胶快速制备试剂盒说明书配制蛋白胶,发酵上清液和破壁上清液分别上样8 μL,破壁沉淀上样3 μL,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析[27]。使用Bradford蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度,以牛血清白蛋白为参比。

1.3.5 重组ThαGP的启动子优化

将验证正确的重组质粒pHY300PLK-amyQ-thαgp通过大引物全质粒PCR(megaprimer PCR of whole plasmids, MEGAWHOP-PCR)技术[28]连接到目标启动子上,构建流程见图2,引物序列见表1。以不同的上下游引物对枯草芽孢杆菌进行PCR扩增,扩增条带经过琼脂糖凝胶电泳验证正确后,切割下目的条带进行胶回收,根据Megawhop原理进行PCR连接到载体上。而后通过化学转化法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中,涂布到含有氨苄青霉素的固体平板,在37 ℃条件下过夜培养12 h后,挑取转化子进行菌落PCR验证,同时测序片段是否突变。

图2 启动子构建流程

Fig.2 Promoter construction process

1.3.6 摇瓶发酵条件的优化

为满足工业化生产应用,优化了重组ThαGP在枯草芽孢杆菌摇瓶发酵时的培养基、发酵温度和发酵时间。

培养基的优化。研究在进行碳氮源种类优化时,以胞内酶活为主要筛选标准,胞外酶活与菌体密度为辅助筛选标准。选取10种氮源代替TB培养基中的蛋白胨及酵母粉,筛选出胞内酶活较高的2种氮源进行浓度优化并对TB培养基的氮源浓度进行了优化;同时在进行碳源种类优化时选取10种碳源代替TB培养基中的甘油,筛选出胞内酶活较高的5种碳源进行浓度优化并对TB培养基的碳源浓度进行了优化。

发酵温度和发酵时间的优化。确定合适的碳氮源浓度后在不同的温度下进行发酵并记录发酵曲线,以酶活数据分析为主要标准,SDS-PAGE分析为次要标准的来确定发酵条件,最终确定重组ThαGP的摇瓶发酵最佳发酵温度、碳氮源及其浓度。

1.3.7 优化条件下基于重组ThαGP的α-G1P制备

在优化后的摇瓶培养基中进行发酵获得ThαGP的破壁上清粗酶液和纯酶液。使用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH=7.0)为溶解液,配制浓度为100 g/L的麦芽糊精底物,取50 μL底物于1.5 mL离心管中保温在50 ℃、200 r/min的水浴摇床内,加入终体系中浓度为0.2 g/L的ThαGP破壁上清粗酶液或纯酶液,反应24 h左右。其中ThαGP的破壁上清粗酶液在终体系中的加酶量为SDS-PAGE分析和灰度分析得出的实际蛋白浓度所对应的体积,以减少粗酶液中非目的蛋白所造成的偏差。沸水浴20 min终止酶转化反应,而后以12 000 r/min离心2 min去除变性蛋白,所得终产物偶联α-PGM与G6P检测试剂盒(WST-8法)在450 nm波长处测定溶液吸光值计算α-G1P的含量。转化率为产物α-G1P摩尔浓度与麦芽糊精底物所对应的葡萄糖当量摩尔浓度的百分比。

1.4 数据处理

采用Origin 2021软件对实验结果进行分析。采用ImageJ软件对SDS-PAGE图进行灰度分析,获得目的蛋白占比,从而计算出目的蛋白表达量和实际蛋白浓度。数据以平均值±标准差(SD)表示。所有实验独立重复3次。P<0.05视为数据间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 ThαGP在枯草芽孢杆菌中的重组表达及启动子优化

将构建好的质粒pHY300PLK-amyQ-thαgp转入到枯草芽孢杆菌WS9中,菌落PCR验证后得到重组菌株。重组ThαGP启动子优化的SDS-PAGE分析结果见图3。由于质粒不带有信号肽,因此,优化启动子的主要目的是提高ThαGP的胞内表达水平。由图3可知,该重组菌株经摇瓶发酵36 h后,破壁上清液的酶活为6.62 U/mL,胞内蛋白表达量为0.024 g/L,OD600值为10.12,表明ThαGP在枯草芽孢杆菌WS9中可以正常表达。但启动子amyQ对ThαGP的表达能力不是很理想[图3(a)],在发酵上清液、破壁上清液的95.9 kDa(ThαGP的理论蛋白分子质量)处的目的蛋白条带过细。因此,从数据库中筛选了10种枯草芽孢杆菌的内源性组成型启动子gapA、gsiB、hag、mdh、sigX、SpovG、srf、Hpall、amyE、fusA,进行启动子优化。不同启动子表达的ThαGP的胞内酶活、胞内蛋白表达量及OD600值的结果见表2。由图3(b)和表2可知,启动子SpovG的胞内酶活是单启动子中最高的,其蛋白表达水平也远胜其他单启动子,在发酵上清液、破壁上清液的95.9 kDa处有更加明显的蛋白条带。因此,将启动子SpovG分别叠加了ThαGP蛋白表达量较优异的启动子amyQ和胞内酶活较高的启动子srf,得到了两种不同的双启动子,并且将本实验室前期构建的通用性较好的双启动子Hpall-amyQ[29]同时构建到pHY300PLK-thαgp载体上,最终验证这3种双启动子的表达效果。由图3(c)和表2结果可知,pHY300PLK-SpovG-amyQ-thαgp的胞内表达情况优于其他的组合启动子,胞内酶活可以达到53.05 U/mL,相较于amyQ启动子(6.62 U/mL)提高了7.01倍,蛋白表达量也提高了6.79倍。故选择B. subtilis WS9/pHY300PLK-SpovG-amyQ-thαgp开展后续实验。

表2 不同启动子表达的ThαGP的胞内酶活、胞内蛋白表达量及OD600值

Tab.2 Intracellular enzyme activity, intracellular protein expression and OD600 value of ThαGP expressed by different promoters

启动子蛋白表达量/(g·L-1)胞内酶活/(U·mL-1)OD600amyE0.0153.368.14fusA0.0154.528.08gapA0.0151.669.14gsiB0.0153.0111.38hag0.0141.038.03mdh0.0142.047.90sigX0.0142.779.06SpovG0.02238.049.09srf0.02213.297.66Hpall0.0223.018.24Hpall-amyQ0.09041.188.28SpovG-amyQ0.18753.058.52SpovG-srf0.06024.646.20

M表示彩色预染蛋白分子量标准;1. 发酵上清液;2. 破壁上清液;3. 破壁沉淀。

图3 重组ThαGP启动子优化的SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant ThαGP promoter optimization

2.2 重组ThαGP发酵培养基优化结果

研究数据表明培养基的配方对酶活影响较大[30],因此优化了发酵培养基的碳氮源种类及浓度。考虑到质粒pHY300PLK-SpovG-amyQ-thαgp不带有信号肽序列,因此发酵优化一开始的目标是尽可能地提高胞内表达。由于摇瓶培养具有易操作、发酵周期等优点,本研究选取了10种不同的氮源代替TB培养基中氮源,在相同摇瓶条件下培养36 h后检测OD600值记录细菌培养液的浓度,同时检测发酵上清液、破壁上清液的酶活。重组ThαGP摇瓶发酵碳氮源优化结果见图4。由图4(a)可知,棉籽粉、西王豆粕粉是效果较优异的2种氮源,因此选取这2种氮源继续优化浓度。但由于棉籽粉和西王豆粕粉在培养基中不能完全溶解,存在大量不溶物使得OD600值的检测偏高,从而导致胞内酶活的数值偏高。同时由于TB培养基中的胞内酶活不低,因此,为了不遗漏可能存在的有效氮源,对于TB培养基中的蛋白胨和酵母粉的浓度也进行了进一步的优化。在氮源总浓度为24、36、48 g/L的梯度下进行优化,并且尽量避免棉籽粉和西王豆粕粉的难溶物的影响,由图4(b)可知,在蛋白胨18 g/L和酵母粉30 g/L的氮源浓度配比下有利于ThαGP的胞内表达。

1.TB培养基;2.骨蛋白胨;3.安琪酵母粉;4.西王豆粕粉;5.隆科特豆粕粉;6.棉籽粉;7.玉米浆干粉;8.牛肉蛋白胨;9.牛肉浸膏;10.大豆蛋白胨;11.酵母浸膏;12.棉籽粉,24 g/L;13.棉籽粉,36 g/L;14.棉籽粉,48 g/L;15.西王豆粕粉,24 g/L;16.西王豆粕粉,36 g/L;17.西王豆粕粉,48 g/L;18.酵母粉,18 g/L + 蛋白胨,6 g/L;19.酵母粉,24 g/L + 蛋白胨,12 g/L;20.酵母粉,30 g/L + 蛋白胨,18 g/L;21.玉米淀粉;22.马铃薯淀粉;23.乳糖;24.葡萄糖;25.玉米糊精;26.果糖;27.可溶性淀粉;28.麦芽糖;29.木糖;30.蔗糖;31.可溶性淀粉,5 g/L;32.可溶性淀粉,10 g/L;33.可溶性淀粉,15 g/L;34.马铃薯淀粉,5 g/L;35.马铃薯淀粉,10 g/L;36.马铃薯淀粉,15 g/L;37.玉米淀粉,5 g/L;38.玉米淀粉,10 g/L;39.玉米淀粉,15 g/L;40.乳糖,5 g/L;41.乳糖,10 g/L;42.乳糖,15 g/L;43.木糖,5 g/L;44.木糖,10 g/L;45.甘油,10 g/L;46.甘油,15 g/L。1～11组中氮源的质量浓度均为36 g/L。21～30组中氮源的质量浓度均为5 g/L。

图4 重组ThαGP摇瓶发酵碳氮源优化

Fig.4 Nitrogen source and carbon source optimization of recombinant ThαGP in shake flask fermentation

选取了10种不同的碳源代替TB中的甘油,在相同条件下培养36 h后检测OD600值记录细菌培养液的浓度,同时检测发酵上清液、破壁上清液的酶活。由图4(c)可知,可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、乳糖、木糖是较好的5种碳源,选取这5种碳源优化浓度。由于淀粉类底物在高浓度下易出现结块沉淀,并且随着细菌的生长该沉淀能被细菌利用消耗。为了尽可能摸索到合适的碳源及浓度,对TB培养基中的甘油的浓度也进行了优化。在碳源总浓度为5、10、15 g/L的梯度下进行优化,其中由于高浓度木糖对芽孢杆菌有一定的抑制生长的效果,木糖浓度为15 g/L的培养基中菌株未正常生长,故未检测数据。由图4(d)可知,在可溶性淀粉15 g/L、木糖10 g/L的碳源浓度下是有利于ThαGP的胞内表达。

此外,在本研究中,意外发现以双启动子SpovG-amyQ在棉籽和牛肉浸膏为氮源、玉米淀粉和木糖为碳源的培养基中,ThαGP基因的胞外分泌表达优于胞内表达,推测是由于双启动子SpovG-amyQ能够在枯草芽孢杆菌WS9中提高ThαGP基因表达水平的同时,促进非信号肽介导的胞外分泌,以及一些培养基中的成分组成也能够增强重组蛋白的这种胞外分泌。该发现为增强ThαGP基因的胞外分泌表达提供了研究思路。

2.3 重组ThαGP发酵温度和发酵时间的优化结果

在工业发酵生产时,发酵温度对菌株的生长及基因的表达也有一定程度的影响[31]。同时,不同菌株的发酵周期也不尽相同,并不是所有的蛋白均能够适应长时间的工业发酵。本研究在确定蛋白胨18 g/L和酵母粉30 g/L为最优氮源浓度后,与15 g/L可溶性淀粉和10 g/L木糖这两种碳源分别进行复配,替换TB培养基的配方,对摇瓶条件下的发酵温度进行优化,并记录了发酵曲线。重组ThαGP摇瓶发酵温度优化结果见图5。由图5可知,在18 g/L蛋白胨和30 g/L酵母粉为复合氮源,10 g/L 木糖为碳源的培养基中,重组菌株在37 ℃发酵的胞内酶活远高于其他温度条件,并且随着发酵时间的延长胞内酶活在不断地提高,在37 ℃发酵60 h达到了162.53 U/mL。在18 g/L蛋白胨和30 g/L酵母粉为复合氮源,15 g/L可溶性淀粉为碳源的培养基中,重组菌株在33 ℃发酵的胞内酶活远高于其他温度条件,并且随着发酵时间的延长胞内酶活在不断地提高,在33 ℃发酵60 h达到了173.38 U/mL,其发酵温度和发酵时间符合工业发酵的基本需求。此外,胞外酶活达到峰值后,会随着发酵时间的延长而逐渐降低。虽然双启动子和培养基的组成成分可能会一定程度增强ThαGP基因的胞外表达,但由于质粒不带有信号肽,无法源源不断地产生新的蛋白,因此这些已经分泌出的蛋白会被枯草芽孢杆菌WS9的蛋白酶降解掉一部分,造成胞外酶活的降低。对发酵上清液、破壁上清液中的ThαGP基因的表达情况进行SDS-PAGE分析,分析结果见图6。由图6可知,目的蛋白电泳条带与酶活数据基本一致。其中,发酵上清液的蛋白条带比破壁上清液的蛋白条带更粗,这是由于破壁上清液的蛋白是由OD600值为5的菌液所破碎细胞壁所得,发酵上清液的蛋白是由整个摇瓶中OD600值远大于5的所有细菌分泌出的。但这也进一步证明了,重组ThαGP的胞外分泌表达量并不低,为该酶的胞外分泌表达的研究提供了理论基础。综合菌株生长情况及酶活数据等考虑,B. subtilis WS9/pHY300PLK-SpovG-amyQ-thαgp菌株在氮源为18 g/L蛋白胨和30 g/L酵母粉,碳源为15 g/L可溶性淀粉的培养基中,33 ℃发酵60 h可达到最高胞内酶活,为TB培养基在原始发酵条件下胞内酶活的4.13倍。因此,最终确定优化后摇瓶培养基为15 g/L可溶性淀粉、2.31 g/L KH2PO4、12.54 g/L K2HPO4、18 g/L蛋白胨、30 g/L酵母粉。

图5 重组ThαGP摇瓶发酵温度优化

Fig.5 Fermentation temperature optimization of recombinant ThαGP in shake flask fermentation

M表示彩色预染蛋白分子质量标准;1. 发酵温度为25 ℃;2. 发酵温度为28 ℃;3. 发酵温度为30 ℃;4. 发酵温度为33 ℃;5.发酵温度为37 ℃。

图6 重组ThαGP的SDS-PAGE分析

Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant ThαGP

2.4 重组ThαGP制备α-G1P结果

研究团队在前期研究中,获得了大肠杆菌发酵的ThαGP的粗酶液,并且经镍柱蛋白纯化后获得了ThαGP的纯酶液。通过大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种表达系统获得的酶液,在50 ℃、200 r/min、1 mol/L 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH值为7.0)反应24 h。重组ThαGP制备α-G1P的结果见图7。由图7(a)可知,枯草芽孢杆菌发酵的ThαGP粗酶液在制备α-G1P时略具有优势,因此枯草芽孢杆菌的发酵并不会减弱ThαGP的催化效率。PA是一种可以切断支链淀粉的α-1,6-糖苷键进行脱支处理的酶,4GT是一种可以将淀粉侧链的α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖转移到主链从而延长主链的葡聚糖长度的酶。将枯草芽孢杆菌发酵的ThαGP分别与上述两种酶液进行复配,α-G1P转化率得到了一定的提升,α-G1P滴度达到158.98 mmol/L,转化率最高为51.62%[图7(b)]。

1. ThαGP的纯酶液;2. ThαGP的大肠杆菌发酵的粗酶液;3. ThαGP的枯草芽孢杆菌发酵的粗酶液。

图7 重组ThαGP制备α-G1P

Fig.7 Produce of α-G1P by recombinant ThαGP

3 结 论

本研究将ThαGP在枯草芽孢杆菌中进行了异源表达,并且通过启动子和摇瓶发酵条件优化提高了ThαGP表达水平,为ThαGP的发酵制备提供了技术支撑,并为其工业化生产应用的工艺适配提供了科学依据。双启动子SpovG-amyQ的通用性虽未得到验证,但研究推测该组合启动子可以提高某些基因在枯草芽孢杆菌的表达水平,为其他基因的高水平表达提供了新的可行思路。此外,研究填补了微生物来源ThαGP基因在枯草芽孢杆菌中异源表达的空缺,为更多新型ThαGP基因在食品级宿主中的表达奠定了基础,相较现有大肠杆菌重组表达宿主更为安全,有利于该酶后续应用于多酶级联体系制备功能糖产品。研究提高了新型菌株来源的ThαGP在枯草芽孢杆菌中的表达水平,有望推动ThαGP在食品生产中的工业化应用。

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Expression and Application of α-Glucan Phosphorylase from Thermotoga sp. in Bacillus subtilis

LIANG Xinsheng, WU Jing*, XIA Wei*

(School of Biotechnology/Key Laboratory of Ministry of Education for Industrial Biotechnology/State Key Laboratory of Food Science and Resources, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract：α-D-Glucose-1-phosphate (α-G1P) is a metabolic intermediate involved in a variety of metabolic reactions, and is also a potential drug, which has great development potential in the field of medicine and health supplements. It is mainly produced by α-glucan phosphorylase (αGP) using starch as substrate. In this study, α-glucan phosphorylase ThαGP from Thermotoga sp. SG1 was heterologously expressed in Bacillus subtilis. Then the types of promoters, fermentation medium formulation, temperature and time were optimized. And the application experiment of preparing α-G1P was carried out. The results showed that the enzyme activity of recombinant strain B. subtilis WS9/pHY300PLk-SpovG-amyQ-thαgp was 7.01-fold higher than that of the original strain fermentation. After optimization of shake flask fermentation conditions, the total activity of ThαGP reached 173.38 U/mL after fermentation at 33 ℃ for 60 h in a shaking flask using medium with 18 g/L tryptone and 30 g/L yeast extract as complex nitrogen source and 15 g/L soluble starch as carbon source, which was 4.13 times that of the original fermentation. When ThαGP was combined with pullulanase and 4-α-glucosyltransferase, the conversion rate of α-G1P catalyzed by ThαGP was up to 51.62%. It was hoped that the study would provide a reference and technical foundation for the food grade fermentation preparation of ThαGP and industrial production of α-G1P.

Keywords：α-D-glucose-1-phosphate; α-glucan phosphorylase; Bacillus subtilis; promoter optimization; fermentation optimization

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500210

文章编号：2095-6002(2025)06-0096-11

引用格式：梁新胜,吴敬,夏伟. 热袍菌α-葡聚糖磷酸化酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):96-106. LIANG Xinsheng,WU Jing,XIA Wei, et al. Expression and application of α-glucan phosphorylase from Thermotoga sp. in Bacillus subtilis[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):96-106.

收稿日期：2025-04-15

基金项目：国家重点研发计划项目(2022YFC2104900)。

Foundation: National Key Research and Development Program of China (2022YFC2104900).

第一作者：梁新胜,女,硕士研究生,研究方向为功能糖的酶法制备。

*通信作者：吴 敬,女,教授,博士,主要从事酶工程方面的研究;夏 伟,男,副研究员,博士,主要从事功能性低聚糖生物法制备方面的研究。

(责任编辑：李 宁)