黄酒是中国最古老的发酵酒类之一,有着丰富的文化底蕴,是中国传统饮食文化的重要组成部分[1],同时也带有浓郁的地域色彩。红谷是禾本科狗尾草属一年生草本植物,广泛分布于我国北部地区,其营养价值全面且突出,是兼顾主食与滋补的健康食材。红谷黄酒作为河南省南阳市的一种特色品种,因其富含氨基酸、有机酸、维生素和多糖等多种功能活性成分,不仅有益于身体健康,更以细腻清爽的口感和高雅的香气而深受人们喜欢。

传统红谷黄酒酿造依赖固态黄酒曲作为发酵剂,固态酒曲中多样的微生物组成有利于黄酒复杂风味的形成[2-3],但复杂的微生物菌群也会影响黄酒生产的可操控性和降低黄酒产品的稳定性。为了提高黄酒酿制过程中的可控性,已有研究尝试从固态曲中分离纯化出具有糖化功能的曲霉菌株,通过纯种培养制备酒曲并用于黄酒酿造,但该类液态纯种发酵黄酒在风味上与传统黄酒存在差异,例如戊酸与乙酸含量较高,以及高级醇含量较低等[4]。在其他酒类生产中,亦出现将霉菌与酵母分别纯种培养后按比例混合制成液态发酵剂(以下简称“液态曲”)的工艺,液态曲的使用不仅可以调控酒曲微生物种类与数量,还具备发酵特性稳定、制曲周期短的显著特点[5]。

合成微生物群落(synthetic microbial community)是指由两种或两种以上微生物在成分明确的基质中建立的共培养体系[6]。其结构较于自然微生物菌群更为简单,但在功能上优于单一菌株,能够实现更为复杂的代谢任务[7]。这一体系为解析天然菌群的代谢机制与功能联系提供了理想模型[8],并以其组成明确、易于调控的特点,可以显著增强发酵过程的稳定性与可重复性[9]。

本研究在前期解析黄酒曲核心微生物组的基础上,利用合成微生物群落的构建策略,开发了液态黄酒发酵剂(以下简称“液态黄酒曲”),并用于红谷黄酒的酿制。首先从固态黄酒曲中筛选、分离、纯化并鉴定得到可培养酒曲微生物;在此基础上以核心微生物菌株为实验因子,通过Plackett-Burman实验,确定了黄酒曲合成微生物群落的成员。通过监测液态黄酒曲制备过程中的理化指标与挥发性风味物质变化,系统评估其发酵特性。最终,将所构建的液态黄酒曲应用于红谷黄酒酿造,并全面分析所酿黄酒的基本理化性质与风味物质组成,从而验证其实际应用效能。希望研究可为开发稳定、可控的新型黄酒曲和黄酒提供理论依据与技术途径,也为发酵食品的工业化升级提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

酿酒所用红谷购自南阳市当地农贸市场。

实验所用的6种酿制红谷黄酒的酒曲分别购自河南润之酒业有限公司(Q1)、永州市零陵雅大酿酒酒曲厂(Q2)、麦仓科技有限公司(Q3)、丽水力克生物科技有限公司(Q4)、宜仟家酿酒设备有限公司(Q5)和湖北省楚寨发酵制品有限公司(Q6)。

酿酒酵母为高活性干酵母,购自安琪酵母股份有限公司;培养基(干粉)均购于北京索莱宝科技公司。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、冰乙酸、正己酸、可溶性淀粉、葡萄糖和氯化钠等试剂,分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;琼脂、胰蛋白胨、酵母粉、酵母提取物和蛋白胨等试剂,分析纯,北京奥博星生物技术有限责任公司;培养基(干粉),北京索莱宝科技公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型酸度计,上海仪电分析仪器有限公司;Victor Nivo型多功能微孔板检测仪,美国 Perkin Elmer 公司;L-8900型氨基酸分析仪,日本株式会社制作所;1260型高效液相色谱仪、8890-7250型全二维气相色谱-四极杆串联飞行时间质谱联用仪(GC×GC-Q-TOF MS),美国Agilent公司;固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)[配备DVB/CWR/PDMS萃取头,膜厚度80 μm,膜长度10 mm],美国Supelco公司;5424R型高速冷冻离心机,上海力申科学仪器有限公司;ZHWY-211C型卧式恒温培养振荡器,上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种筛选和核心微生物单菌纯培养

使用马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基、溶菌肉汤 (LB) 培养基、酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂 (YEPD) 培养基、查氏琼脂 (CDM) 培养基和马丁氏(Martin) 培养基作为菌种筛选的培养基。各培养基均由培养基干粉按说明书调配制得。

称取酒曲样品10 g于90 mL无菌水中,混匀后将其作为固态曲的1×10-1梯度菌悬液,然后逐级稀释至1×10-6梯度。取1×10-4、1×10-5、1×10-6 浓度的菌悬液各0.1 mL涂布于固体PDA、LB、YEPD、CDM和Martin培养基 (酵母和霉菌筛选时加入0.008 g/L的氯霉素),在28 ℃和37 ℃两个温度条件下进行倒置培养。挑选不同形态菌落进行分离纯化,纯化后的菌种接种于相应的培养基斜面上。纯化菌株的斜面培养物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序与鉴定,测序使用16S rDNA (338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,806R:5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)和ITS (F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′,R:5′-GCTGCGT TCTTCATCGATGC-3′)引物对分别扩增细菌16S rDNA基因V3-V4高变区和真菌ITS区。测序结果使用NCBI的Blast工具进行blastn比对和物种鉴定。

根据鉴定结果,使用液态黄酒曲培养基对分离纯化之后的黄酒曲核心微生物菌种进行纯培养。

液态黄酒曲培养基的配制参考隗程峰等[10]的方法。1)加水调浆:取粉碎过的小麦12.0 g于250 mL锥形瓶中,加150 mL水。2)调配可溶性淀粉、硝酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠和硫酸镁等补充碳源、氮源以及菌种生长所需的无机盐。3)冰醋酸调节pH值:将冰醋酸和水按体积比为1∶15的比例稀释后用于调pH值。4)煮沸:在搅拌的状态下煮沸 2 min 使小麦淀粉糊化。5)灭菌:121 ℃灭菌 20 min。

1.3.2 基于Plackett-Burman实验的菌种优选

采用1.3.1节的液态黄酒曲培养基对菌种进行纯培养,细菌的培养条件为37 ℃、150 r/min培养24 h;霉菌和酵母培养条件为30 ℃、150 r/min培养72 h,使用培养基将菌种浓度稀释至1×106 CFU/mL,检测微生物纯培养物的性能指标,将性能指标干重(Y1)、蛋白酶活力(Y2)、糖化力(Y3)、液化力(Y4)、酯化力(Y5)、发酵力(Y6)和酸度(Y7)作为实验因子进行Plackett-Burman实验设计[11],对核心微生物菌种的组合和添加量进行分析,确定最终的黄酒曲合成微生物群落成员以及菌株的比例。利用软件Minitab 19进行分析,因素水平表见附录附表1。

菌种微生物纯培养物的性能指标按照以下方法测定。水分、糖化力、液化力、酯化力和发酵力等酒曲的指标参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》测定,为便于统计分析,将水分测定结果换算成干重。蛋白酶活力测定方法按照GB/T 23527—2023《酶制剂质量要求 第1部分:蛋白酶制剂》进行测定。酒曲样品的酸度参照Li等的方法测定[12]。

1.3.3 液体曲的制备与酒曲特性检测

将纯培养之后的合成微生物群落成员菌种浓度调整至1×106 CFU/mL,按体积比1∶1∶1∶1的比例混合接种于液态黄酒曲培养基中,菌种添加总量为液态黄酒曲培养基的10%(体积分数),在30 ℃、150 r/min的条件下发酵9 d。设置3个重复,分别在发酵第1、2、3、4、5、6、7、8、9天取样200 g,用以进行黄酒曲基本理化指标的检测。将发酵效果较佳的液态黄酒曲命名为YT。

干重(Y1)、蛋白酶活力(Y2)、糖化力(Y3)、液化力(Y4)、酯化力(Y5)、发酵力(Y6)和酸度(Y7)等指标的检测方法同1.3.2节。

1.3.4 红谷黄酒的酿制

红谷淘洗干净后,清水浸泡24 h,蒸熟后取出摊凉至30 ℃左右,备用。

固态黄酒曲酿造红谷黄酒:添加1 000 g红谷质量分数为15%的固态黄酒曲(150 g)和质量分数为0.1%的酿酒酵母(1 g),均匀搅拌后落缸,再加入红谷1.5倍质量的水(1 500 g),并记下添加水后的水位刻度线,以此为水位标准刻度线。

液态黄酒曲酿造红谷黄酒:添加1 000 g红谷质量分数为15%的液态黄酒曲(150 g)和质量分数为0.1%的酿酒酵母(1 g),均匀搅拌后落缸,再加入适量的水至标准刻度线处。

分别在28 ℃条件下进行前发酵7 d,在此阶段每天进行取样,每天开耙2次进行搅拌;然后在24 ℃下后发酵21 d,最后以7 000 r/min的速度离心10 min,取上清液煮沸后冷却至室温,将样品保存在4 ℃冰箱备用。固体黄酒曲Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6酿造的黄酒分别命名为Q1J、Q2J、Q3J、Q4J、Q5J、Q6J;液体黄酒曲酿造的黄酒命名为CY。每组实验进行3个重复。

1.3.5 黄酒基本理化指标和游离氨基酸测定

总酸、氨基酸态氮、酒精度、非糖固形物和pH值等酒样的指标按照GB/T 13662—2018测定;总糖采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定[13-15];游离氨基酸依据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行测定,利用氨基酸自动分析仪L8900检测游离氨基酸含量。

1.3.6 黄酒风味物质检测

采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定挥发性风味物质种类及含量。

1) 样品前处理。取样品5 mL于顶空瓶中,加入25 μL 2-辛醇的乙醇溶液(100 μg/mL)、3 g NaCl,密封。

2) 固相微萃取(SPME)。平衡温度50 ℃,平衡15 min,萃取30 min,解析5 min 。

3) GC×GC-Q-TOF MS检测。一维柱HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm),二维柱DB-17 ms(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm)。MS/TOF条件:溶剂延迟3.5 min,采用EI电离源,电离电压为70 eV,离子源温度为200 ℃,接口温度为230 ℃。质谱扫描范围45～500 m/z,扫描频率为101次/s。柱温箱升温程序:起始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min的速率升温至230 ℃并保持5 min。调制柱:SV(C6～C40),调制周期为6 s。以高纯氦气作为载气,恒流模式,流速为1 mL/min。

4) 定性和定量。未知化合物经计算机检索后与NIST 20谱库匹配,筛选正反匹配度均大于700且3个平行实验中至少出现2次的化合物,去除因萃取头影响出现的硅氧烷类杂质峰,删除含有卤素和柱流失的化合物,最后使用平均值补充缺失值。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,数据为平均值±标准偏差。使用SPSS (IBM SPSS Statistics 22)软件对实验数据进行T检验和多重比较分析。使用R(v.4.2.2)软件对数据进行正交偏最小二乘法判别分析和主坐标分析。使用Origin 2023和prism 8 进行数据图形可视化分析。对挥发性物质数据相对含量进行标准化后采用ward.D2聚类方法进行聚类分析,利用R studio(v.2023.12.0+369)软件绘制聚类热图,并进行PCoA分析和绘制Upset图。

2 结果与分析

2.1 核心微生物的分离、鉴定与菌株选择分析

在前期判定黄酒曲核心微生物的基础上,分别采用马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基、溶菌肉汤 (LB) 培养基、酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂 (YEPD) 培养基、查氏琼脂 (CDM) 培养基和马丁氏(Martin) 培养基等5种培养基对6种黄酒曲中的微生物进行稀释涂布、分离和筛选,并对细菌16S rDNA基因V3～V4高变区和真菌ITS区的DNA序列对比,对分离得到的微生物菌株进行分子鉴定。共得到55个菌株,去除重复菌株后,得到21株菌株(见附录附表2),其中12株属于固态黄酒曲的核心微生物(表1[14-26]),包含4株细菌、2株酵母菌和6株霉菌。

根据文献报道,Enterobacter cloacae(X2)可能产生生物胺(如腐胺、尸胺),易引发头痛、心悸等不良反应,故不予选用[14]。而泡盛曲霉(Aspergillus awamori)可促进酚酸生成,增强抗氧化活性[15],符合当前黄酒产品开发需求。因此,实验选定X1(Bacillus amyloliquefaciens)、X3(Bacillus subtilis)、X4(Bacillus licheniformis)、J4(Hanseniaspora valbyensis)、J5(Clavispora lusitaniae)、M2(Aspergillus niger)、M3(Mucor circinelloides)、M5(Geotrichum candidum)、M6(Monascus purpureus)、M7(Aspergillus flavus)和M8(Rhizopus arrhizus)这11株菌株和实验室保藏的1株泡盛曲霉M1(A. awamori),共12株菌作为液态黄酒曲合成微生物群落的备选菌株。

2.2 核心微生物纯种培养性能分析

采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)[27]对12株备选微生物纯培养物的性能指标进行比较,结果见图1。性能指标按照酿酒大曲的评判指标分析,分别是干重(Y1)、蛋白酶活力(Y2)、糖化力(Y3)、液化力(Y4)、酯化力(Y5)、发酵力(Y6)和酸度(Y7)7个指标。由图1(a)可知,两类样本在0.95置信区间内明显分离:固态黄酒曲指标集中于左侧(粉色区域),而核心微生物纯培养物(见附录附表2～附表4)分布于右侧(绿色区域),表明二者在性能上存在显著差异。由图1(b)可知,OPLS-DA模型验证结果显示R2Y=0.848,Q2值为0.715,模型可靠性较高。

进一步分析识别出蛋白酶活力(Y2)、糖化力(Y3)、液化力(Y4)和发酵力(Y6)为固态黄酒曲与12株微生物纯种培养物关键差异指标[图1(c)]。固态黄酒曲中产酒精微生物丰度较低,导致其发酵力显著低于以非酿酒酵母和部分丝状真菌为主的核心微生物纯培养物[28-29]。

微生物纯培养物的性能与固态黄酒曲的性能存在显著差异,因此需通过人工组装构建合成微生物群落,以更好地模拟固态黄酒曲功能并应用于黄酒酿造。

2.3 液态黄酒曲合成微生物群落组成的确定

使用Plackett-Burman实验,评估各纯培养的菌株对糖化力、液化力、干重、蛋白酶活力、酯化力、发酵力和酸度等酒曲特性的贡献,以确定合成微生物群落的成员组成,结果见附录附表3。各性能指标的方差分析结果见附录附表4。结果表明:糖化力(Y3)和液化力(Y4)的回归模型极显著(P<0.01),酸度(Y7)的回归模型显著(P<0.05),干重(Y1)、蛋白酶活力(Y2)、酯化力(Y5)和发酵力(Y6)的回归模型不显著(P>0.05)。考虑到 Plackett-Burman 实验设计中,单菌株液化力的测定数值较小(见附录附表5～附表7),进一步探究其对整体效果的贡献意义有限,因此实验选择糖化力(Y3)作为该实验设计的评价指标。

以糖化力为指标的20组Plackett-Burman实验结果如附录附表8所示。利用Minitab进行回归建模,得到一次回归方程为:

Y3=82.62-7.52(X1)-3.68 (X3)-5.52 (X4)+2.52 (J4)+29.98 (J5)-2.08 (M1)+22.52 (M2)-10.18 (M3)+5.42 (M5)+17.18 (M6)+2.78 (M7)+15.02 (M8)

回归方程的方差分析表如附录附表9所示,方程极显著(P<0.01),决定系数R2=0.965 4,说明方程能解释96.54%的结果,模型可靠。

糖化力回归方程显示,J5(C. lusitaniae)、M2(A. niger)、M6(M. purpureus)和M8(R. arrhizus)对糖化力具有显著正向影响,因此选定这4株菌株构建合成微生物群落。为最大化糖化性能,在验证实验中按1∶1∶1∶1的体积比以高水平接种上述菌株。

2.4 液态黄酒曲的构建与特征检测分析

采用J5、M2、M6和M8菌株以1∶1∶1∶1的体积比混合,以糊化后的小麦为底物制备液态黄酒曲,并于第1至第9天每日取样测定理化指标,结果见图2,液态黄酒曲发酵过程指标及多重比较结果见附录附表9。液态黄酒曲的干重在第7天趋于平稳,表明液态黄酒曲中微生物的生长和代谢在第7天后趋于稳定[图2(a)]。由图2(b)和图2(c)可知,在制曲过程中,随着微生物数量的增加,液态黄酒曲的糖化力和酯化力在前7 d变化极为显著(P<0.05),随后趋于稳定。发酵力在整个过程中无显著差异[图2(d)]。酒曲的液化力是分解淀粉能力的体现,其在前3 d较低,后期显著上升,与霉菌生长延迟及淀粉酶活性表达相关[图2(e)][30]。酸度与蛋白酶活力也于第7天达到稳定或峰值[图2(f～g)],酒曲的酸度一定程度上影响了酒样的风味,为黄酒酿造提供了一定的酸性前体物质。蛋白酶可以将酒曲中的蛋白质降解为多肽和氨基酸,给微生物提供氮源,促进微生物发酵。

液态黄酒曲的性能指标结果见图3,Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6分别代表6种市售黄酒曲,YT代表液态黄酒曲。将培养7 d的液态黄酒曲(YT)和6种固体黄酒曲的糖化力、酯化力、发酵力、液化力、酸度和蛋白酶活力等基本理化指标对比分析,T检验分析结果见附录附表10。6个指标上都强于至少2种固体黄酒曲,其中在发酵力和蛋白酶活力指标上显著高于其他6种固体黄酒曲,说明液态曲的产乙醇能力和分解蛋白的能力较强,更有助于黄酒酿造。

检测在1～9 d内液态黄酒曲的游离氨基酸变化趋势和挥发性物质,结果见图4。游离氨基酸总量在第7天达到最高,包括 Asp、Glu 等酸味氨基酸,Gly、Ala 等甜味氨基酸,以及 Tyr、Phe 等苦味氨基酸,这些物质为风味形成的重要前体[31][图4(a)]。挥发性物质检测共鉴定出127种化合物,筛选其中65种(相对含量>0.1%)进行统计分析。第7天时挥发性物质种类达最大值(46种),主要包括异戊醇、乙酸异戊酯、4-羟基-2-丁酮、辛酸乙酯、苯乙醇等黄酒典型风味物质[32-33][图4(b)]。综合理化指标、氨基酸及风味物质的变化趋势,液态黄酒曲在第7天达到稳定且综合品质最优,因此选定该时间点制备的酒曲用于后续黄酒酿造。

2.5 液态曲酿黄酒的理化指标和风味特征

为了探究液态黄酒曲的实用性,以红谷为原料酿造红谷黄酒,所有7种黄酒(包括液态曲酒CY和6种固态曲酒)的基本理化指标如图5所示。由图5可知,均符合国家标准[ρ(总糖)≤15 g/L、pH=3.5～4.6、ρ(总酸)=3.0～10.0 g/L、ρ(氨基酸态氮)≥0.16 g/L、酒精度≥8.0 % vol],t检验分析结果见附录附表11。其中,液态黄酒曲酿造的黄酒CY总酸和总糖的含量显著高于大部分的固态曲酿造的黄酒;在pH值上,液态黄酒曲与传统黄酒曲酿造的黄酒没有显著差异;液态黄酒曲酿造的黄酒CY氨基酸态氮[(0.62±0.02) g/L]、非糖固形物[(35.51±0.48) g/L]和酒精度的含量低于固态黄酒曲酿造的黄酒。较高的总酸不仅有助于形成复杂香气(通过酯化反应),还可维持酸性环境以抑制杂菌、增强稳定性。总糖不仅作为黄酒分类的依据,同样也能影响黄酒的总体风味。此外,液态黄酒曲酿造的黄酒CY的非糖固形物显著低于固态曲酿造的黄酒。糊精和蛋白质类物质是非糖固形物中的重要组成成分,黄酒的发酵原料经微生物酶系边糖化边发酵的过程后,淀粉逐步水解为糊精和寡糖等不同分子大小的糖类、蛋白质则逐步水解为多肽和氨基酸等小分子物质。可能由于液态黄酒曲的蛋白酶活力较高,在发酵过程中分解蛋白质的能力较强,导致非糖固形物含量降低[34]。

为进一步探究不同的酒曲酿造的红谷黄酒之间的差异,对不同曲酿造黄酒的理化指标和风味化合物进行分析,结果见图6。对7种黄酒的基本理化指标进行PCoA分析,该分析采用Bray-Curtis距离计算不同样本间的相似性距离值矩阵[35],结果如图6(a)所示,液态曲酿黄酒CY和固态曲酿黄酒Q1J和Q3J的相似性矩阵距离较短,说明CY和Q1J、Q3J在基本理化指标上具有显著的相似性。

采用全二维气相色谱-四极杆串联飞行时间质谱联用方法检测黄酒中挥发性物质的种类和相对含量,分析结果如图6(c)所示。不同黄酒曲酿造红谷黄酒中的主要挥发性物质相对含量各不相同。正壬醛、丁二酸二乙酯、苯乙醇和辛酸乙酯等挥发性物质在CY中的相对含量高于大多数酒样,通过ROAV分析这些挥发性风味物质的香气贡献(见附录附表12),这些挥发性物质在CY酒样中的香气贡献值高于部分具有代表性的市售酒样品,正壬醛在含量较少时有具有令人愉悦的甜橙香味,异戊醇、苯乙醇和辛酸乙酯都具有类似玫瑰的香味,这些化合物的存在会使酒体香气更加丰富[36]。此外,从样品聚类结果上可以看出,CY与Q4J的挥发性物质成分差异较小。通过Upset图对不同酒样间的差异挥发性物质的种类进行研究,结果如图6(b)所示。7种黄酒样品中,Q1J、Q2J、Q3J、Q4J、Q5J、Q6J和CY中的相对含量较高的挥发性物质种类分别有13、10、3、6、1、35和5种。液态曲酿黄酒CY和6种固态曲酿黄酒之间共有的挥发性物质有9种,分别为癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、异戊醇、乙醇和苯乙醇等。这些都是黄酒中的标志性风味物质,具有令人愉悦的气味,且液态黄酒曲中还具有棕榈酸乙酯和紫罗兰酮等特别的挥发性风味物质,这些不同化合物的香气交织提升了酒体的层次感和丰富度。合成微生物群落仅由葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉、紫红曲霉和少根根霉4个成员组成,在这个简易的微生物群落中,葡萄牙棒孢酵母因其丰富的酯酶催化酯类的生成,黑曲霉、紫红曲霉和少根根霉不仅能产生淀粉酶和蛋白酶来完成原料的分解与能量的转化,黑曲霉和少根根霉可以在糖化过程中产生有机酸、紫红曲霉可以提供丰富的氨基酸和部分酯酶来参与酯类的代谢[22,26],4个成员通过多方协同来完成黄酒发酵过程中的代谢。

以合成微生物群落所制液态黄酒曲酿造的红谷黄酒,不仅基本理化指标符合国标,风味组成与传统固态曲酒高度一致,且部分特征风味物质相对含量更高,表明液态黄酒曲在实际应用中具有可靠的酿造效果。

3 结 论

以6个固态黄酒曲样品为原材料,采用5种平板培养基筛选、分离、纯化、鉴定、得到12株核心微生物菌株。以核心微生物菌株为实验因子,通过Plackett-Burman实验获得由J5(C. lusitaniae)、M2(A. niger)、M6(M. purpureus)和M8(R. arrhizus)组成的液态黄酒曲合成微生物群落,并以此制备液态黄酒曲,液态黄酒曲培养7 d后可用于酿造红谷黄酒。这种方法制备的液态黄酒曲,菌株组成简单、制曲周期短,提升了黄酒曲的可控性与稳定性。

液态黄酒曲酿造的红谷黄酒符合黄酒酿造国家标准,PCoA分析表明液态黄酒曲酿造的黄酒CY和固态曲酿黄酒Q1J、Q3J在基本理化指标上具有显著的相似性,但在非糖固形物含量上,液态酒曲酿造的黄酒显著低于其他黄酒样品,可能会导致其口感寡淡和香气单薄。在黄酒的挥发性风味物质方面,液态曲酿黄酒CY和6种固态曲酿造的黄酒之间共有的挥发性物质有9种,分别为癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、异戊醇、乙醇和苯乙醇等,这些都是黄酒中的标志性风味物质。通过相对含量结合ROAV分析发现正壬醛、丁二酸二乙酯、苯乙醇和辛酸乙酯等挥发性风味物质在CY中的香气贡献高于大多数固态曲酿黄酒,并且液态曲酿黄酒含有棕榈酸乙酯和紫罗兰酮等固态曲酿黄酒不具有的挥发性风味物质,这些特有的风味物质也表明了液态曲酿黄酒有独特的风味。因此,研究基于合成微生物群落制备的液态黄酒曲,具备降低黄酒生产成本、提升黄酒品质的工业化生产潜力。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202500444在线版本中找到。

Appendix：supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found in the online version, at http:∥dx.doi.org/10.12301/ spxb202500444.

参考文献：

[1] 孙宝国. 国酒[M]. 北京: 化学工业出版社, 2019.SUN B G. Baijiu &Huangjiu Chinese national alcohols[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2019.

[2] YANG Y J, XIA Y J, YAN X, et al. Insights into whereby raw wheat Qu contributes to the flavor quality of Huangjiu during brewing[J]. LWT-Food Science and Technology, 2023, 178: 114619.

[3] YANG Y J, AI L Z, MU Z Y, et al. Flavor compounds with high odor activity values (OAV>1) dominate the aroma of aged Chinese rice wine (Huangjiu) by molecular association[J]. Food Chemistry, 2022, 383: 132370.

[4] 柳旭,张倩,周森,等.清香型大曲中高糖化力霉菌的筛选、鉴定及其挥发性风味物质分析[J].中国酿造,2023, 42(6):72-78.LIU X, ZHANG Q, ZHOU S, et al. Screening, identification of mold with high saccharifying power from light-flavor Daqu and its volatile flavor compounds[J]. China Brewing, 2023, 42(6): 72-78.

[5] 闫晓雪, 伍时华, 吴军, 等. 糯米酒的液态发酵工艺优化[J]. 中国酿造, 2022, 41(3): 168-173.YAN X X, WU S H, WU J, et al. Optimization of liquid-state fermentation technology of glutinous rice wine[J]. China Brewing, 2022, 41(3): 168-173.

[6] GROßKOPF T, SOYER O S. Synthetic microbial communities[J]. Current Opinion in Microbiology, 2014, 18: 72-77.

[7] ORTIZ-MARQUEZ F C J, NASCIMENTO D M, ZEHR P J, et al. Genetic engineering of multispecies microbial cell factories as an alternative for bioenergy production[J]. Trends in Biotechnology, 2013,31(9):521-529.

[8] LIU C F, YI F, NIU C T, et al. Unravelling microbial interactions in a synthetic broad bean paste microbial community[J]. Food Microbiology, 2025, 130: 104767.

[9] PENG Q, ZHOU H.H, ZHENG H J, et al. Investigating the role of primary fungi in Huangjiu fermentation: insights from flavor orientation and synthetic microbiomes[J]. Food Microbiology, 2025, 129: 104765.

[10] 隗程峰. 液体曲黄酒酿造工艺研究[D].武汉: 湖北工业大学, 2016:71.KUI C F. Research on the brewing process of liquid Qu Huangjiu [D]. Wuhan: Hubei University of Technology, 2016:71.

[11] QIN Q Q, HU S M, DONG J J, et al. Application of plackett-burman experimental design for investigating the effect of eight phytohormones on malt quality parameters[J]. Journal of the American Society of Brewing Che-mists, 2023, 81(3): 416-423.

[12] LI P, LIN W F, LIU X, et al. Environmental factors affecting microbiota dynamics during traditional solid-state fermentation of Chinese Daqu starter[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1237.

[13] 高文军, 李卫红, 王喜明, 等. 3, 5-二硝基水杨酸法测定蔓菁中还原糖和总糖含量[J]. 中国药业, 2020, 29(9): 113-116.GAO W J, LI W H, WANG X M, et al. Determination of reducing sugar and total sugar in turnip by 3, 5-dinitrosalicylic acid colorimetry[J]. China Pharmaceuticals, 2020, 29(9): 113-116.

[14] 郝淑月, 任清. 北工商海洋杆菌诱导戊糖片球菌产生细菌素及降黄酒生物胺功效研究[J]. 食品科学技术学报, 2021, 39(1): 88-95.HAO S Y, REN Q. Study on bacteriocin production of Pediococcus pentosaceus induced by Pontibacter beigongshangensis and reduction the biogenic amines content in Huangjiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(1): 88-95.

[15] SHIN H Y, KIM S M, LEE J H, et al. Solid-state fermentation of black rice bran with Aspergillus awamori and Aspergillus oryzae：effects on phenolic acid composition and antioxidant activity of bran extracts[J]. Food Chemistry, 2019, 272: 235-241.

[16] CAI H Y, ZHANG T, ZHANG Q, et al. Microbial diversity and chemical analysis of the starters used in traditional Chinese sweet rice wine[J]. Food Microbio-logy, 2018, 73: 319-326.

[17] WANG Z M, WANG C T, SHEN C H, et al. Microbiota stratification and succession of amylase-producing Bacillus in traditional Chinese Jiuqu (fermentation starters)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2020, 100(8): 3544-3553.

[18] YANG Y, ZOU Y F, ZENG K J, et al. Effect of Bacillus subtilis fortified inoculation on the microbial communities in different niches of Daqu[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2022, 134(5): 407-415.

[19] LI R Y, ZHENG X W, ZHANG X, et al. Characterization of bacteria and yeasts isolated from traditional fermentation starter (Fen-Daqu) through a 1H NMR-based metabolomics approach[J]. Food Microbiology, 2018, 76: 11-20.

[20] XU Y, ZHAO G A, WANG L P. Controlled formation of volatile components in cider making using a combination of Saccharomyces cerevisiae and Hanseniaspora valbyensis yeast species[J]. Journal of Industrial Microbio-logy and Biotechnology, 2006, 33(3): 192-196.

[21] FAN G S, LIU P X, CHANG X, et al. Isolation and identification of a high-yield ethyl caproate-producing yeast from Daqu and optimization of its fermentation[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 663744.

[22] YU P B, DU J, CAO C L, et al. Development of a novel multi-strain wheat Qu with high enzyme activities for Huangjiu fermentation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2021, 101(11): 4808-4817.

[23] YANG J G, DOU X, HAN P J, et al. Microbial diver-sity in Daqu during production of Luzhou flavored liquor[J]. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2017, 75(2): 136-144.

[24] 贾丽艳, 田宇敏, 荆旭, 等. 果香风味导向白地霉M5的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 中国食品学报, 2020, 20(3): 210-220.JIA L Y, TIAN Y M, JING X, et al. Studies on the screening and identification of Geotrichum candidum M5 by fruity-flavor-oriented technology and it’s biological characteristics[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(3): 210-220.

[25] LIU S P, HU J, XU Y Z, et al. Combined use of single molecule real-time DNA sequencing technology and culture-dependent methods to analyze the functional microorganisms in inoculated raw wheat Qu[J]. Food Research International, 2020, 132: 109062.

[26] 刘晓玲, 鞠笑, 贾碧丝, 等. 少根根霉产孢能力、变种与发酵产物的相关性[J]. 微生物学报, 2022, 62(3): 1131-1149.LIU X L, JU X, JIA B S, et al. The correlations of fermentation metabolites with sporulation capability and varieties of Rhizopus arrhizus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(3): 1131-1149.

[27] ZHOU X Q, CHEN B Z, LI R T, et al. Determination of terpenes in traditional Chinese medicine (TCM) by comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GC×GC) coupled to high-resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry (QTOFMS) with orthogonal partial least squares-discrimination analysis (OPLS-DA)[J]. Analytical Letters, 2022, 55(16): 2621-2638.

[28] RODRGUEZ MADRERA R, PANDO BEDRIANA R, SUREZ VALLES B. Evaluation of indigenous non-Saccharomyces cider yeasts for use in brewing[J]. European Food Research and Technology, 2021, 247(4): 819-828.

[29] ANUPMA A, TAMANG J P. Diversity of filamentous fungi isolated from some amylase and alcohol-producing starters of India[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 905.

[30] 王佳丽, 朱丹, 孙列雄, 等. 山西老陈醋大曲霉菌生理代谢特征及优良菌株间的互作[J]. 中国食品学报, 2021, 21(4): 79-89.WANG J L, ZHU D, SUN L X, et al. Physiological and metabolic characteristics of molds from Daqu of Shanxi aged vinegar and interactions of excellent strains[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(4): 79-89.

[31] YIN H, HE Y, DENG Y, et al. Application of Plac-kett-Burman experimental design for investigating the effect of wort amino acids on flavour-active compounds production during lager yeast fermentation[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2017, 123(3): 300-311.

[32] PENG Q, ZHENG H J, LI J C, et al. Impact of Bacillus subtilis on Chinese yellow rice wine (Huangjiu) fermentation: method variations and flavor analysis[J]. Food Chemistry, 2024, 460: 140658.

[33] LIU S, YANG L, ZHOU Y, et al. Effect of mixed moulds starters on volatile flavor compounds in rice wine[J]. LWT-Food Science and Technology, 2019, 112: 108215.

[34] 刘俊, 徐岩, 赵光鳌. 黄酒非糖固形物成分的研究[J]. 中国酿造, 2009, 28(8): 24-28.LIU J, XU Y, ZHAO G A. Constituents of non-sugar solidity of Chinese rice wine[J]. China Brewing, 2009, 28(8): 24-28.

[35] YU H Y, WU S Q, LI Q W, et al. Novel insights into delayed bitterness control in traditional Huangjiu: regulating bacterial community by inoculated with Saccharomyces cerevisiae SC-6[J]. Food Chemistry: X, 2025, 25: 102065.

[36] CHEN L H, WANG S X, REN L X, et al. Flavour characteristics of rice wine fermented with mixed starter by moulds and yeast strains[J]. International Journal of Food Science &Technology, 2021, 56(11): 5791-5798.

Development of Synthetic Microbial Community-Based Liquid Starter and Flavor Profile of Honggu Huangjiu

LI Huixing1,2,3, XIAO Yanyu1,2, QIU Caixia1,2, LIU Yuqi2,3, SONG Jinbo2,3, SUN Guangzhao4, XIAO Yuanxi2,3, XU Bin2,3

(1. College of Life Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2. Henan Key Laboratory of Industrial Microbial Resources and Fermentation Technology, Nanyang 473004, China; 3. College of Biology and Chemistry Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China; 4. Henan Guoyun Guangzhao Liquor Industry Group, Nanyang 474150, China)

Abstract：To enhance the stability and controllability of Honggu Huangjiu production, a liquid Honggu Huangjiu starter based on a synthetic microbial community was developed. 12 core microorganisms were screened from commercially available solid Huangjiu starters. A synthetic microbial community consisting of Clavispora lusitaniae, Aspergillus niger, Monascus purpureus, and Rhizopus arrhizus was optimized through Plackett-Burman experiment. The four strains were compounded at a 1∶1∶1∶1 ratio of microbial concentrations, and liquid Huangjiu starter (YT) was prepared using gelatinized wheat as the substrate. Using Nanyang Honggu as the raw material and liquid starter for Huangjiu fermentation, the resulting product (CY) complied with the national standard for Huangjiu. Compared with most Huangjiu brewed with solid-state starter, CY had significantly higher contents of total acids and total sugars, while there was no significant difference in pH value between CY and Huangjiu brewed with traditional Huangjiu starter. The contents of amino acid nitrogen [(0.62±0.02) g/L], non-sugar solids [(35.51±0.48) g/L], and alcohol degree of CY were lower than those of Huangjiu brewed with solid-state Huangjiu starter. Further research on the flavor compounds of CY showed that nine characteristic flavor substances of Huangjiu were detected, including ethyl caprate, phenethyl acetate, ethyl caprylate, diethyl succinate, ethyl nonanoate, ethyl laurate, isoamyl alcohol, ethanol, and phenethyl alcohol. Compared with traditional solid-state starter Huangjiu, CY exhibited higher relative contents of key aroma components such as n-nonanal, diethyl succinate, phenethyl alcohol, and ethyl caprylate. It was demonstrated that Honggu Huangjiu brewed with liquid Huangjiu starter based on a synthetic microbial community showed excellent performance in both physicochemical properties and flavor composition. It was hoped that this research could provide technical references for the standardized production of Honggu Huangjiu.

Keywords：synthetic microbial community; Plackett-Burman experiment; liquid Huangjiu starter; Huangjiu brewing; flavor substances

中图分类号：TS261

文献标志码：A

doi：12301/spxb202500444

文章编号：2095-6002(2025)06-0084-12

引用格式：李慧星, 肖焰宇, 邱彩霞, 等. 红谷黄酒的合成微生物液态发酵剂开发与风味研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):84-95. LI Huixing, XIAO Yanyu, QIU Caixia, et al. Development of synthetic microbial community-based liquid starter and flavor profile of Honggu Huangjiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):84-95.

收稿日期：2025-08-25

基金项目：河南省科技攻关项目(252102110110、252102311248); 河南省高等学校重点科研项目(26A180021)。

Foundation: Henan Provincial Science and Technology Research Project (252102110110, 252102311248); Key Scientific Research Project Plans of Higher Education Institutions in Henan Province (26A180021).

第一作者：李慧星,男,教授,博士,主要从事发酵工程方面的研究。

(责任编辑：李 宁)