枸杞、苦荞富含功能性成分[1-2],具有抗氧化、降血脂、降血糖与抗肿瘤等重要生理功能[3-4],广泛应用于食品行业与医药行业。黄酒是很重要的中药药剂辅料,含有丰富的糖类、糊精、有机酸、高级醇、多种维生素等物质[5]。功能性黄酒以糯米、黍米等为主要原料,在生产过程中添加适合的功能辅料以引入功能因子,或后期在配制、调兑时引入功能因子,使成品具有一定功能特性[6]。但通过调兑引入功能因子,不仅口感不佳,且效果不理想。因此发酵时引入功能性原料,不仅可以提升黄酒的功效成分含量,还能使黄酒口感更丰富。近年来,越来越多的功能性原料被用于黄酒开发研究,例如将火棘、竹叶、当归、铁皮石斛叶等用于发酵黄酒[7],开发出具有独特风味和营养价值的功能性黄酒。

富硒酵母作为一种有机硒源,生物活性和安全性更高,是富硒功能性产品的理想添加剂[8]。目前市售发酵型枸杞酒多沿用葡萄酒酿酒酵母和葡萄酒发酵工艺,存在果香味不足、枸杞典型特征不突出等问题;且单一菌种发酵产品存在口味单一、风味欠佳的缺陷,而利用多菌种混合发酵,可以提高其发酵性能、风味等品质。

前人在枸杞内生酵母发酵相关枸杞酒方面研究较少,因此,本研究以糯米为原料,苦荞与枸杞原浆为辅料,拟使用课题组前期筛选的枸杞内生富硒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和增香葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)为发酵剂,开发新型枸杞苦荞黄酒。为提高发酵枸杞苦荞黄酒的品质,通过单因素实验与响应面试验优化其发酵工艺条件,测定枸杞苦荞黄酒理化指标、功能性成分、有机硒含量和DPPH 自由基清除能力;并进行相关动力学分析,构建发酵动力学模型。研究旨在将枸杞和苦荞2种功能性原料用于黄酒发酵,开发新型功能性黄酒,以期实现两者复配功能优化,也可为这2种药食同源植物的深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞原浆,宁夏中宁枸杞产业创新研究院有限公司;苦荞,云南滇鹏糖业有限公司;糯米,黑龙江稻旁土食品有限公司;黄酒曲AN01(糖化剂),安琪酵母股份有限公司。酿酒酵母M1-5(产酒精能力提升38.07%)和葡萄牙棒孢酵母M16-28(产酯能力提升107.62%)菌株,为课题组前期将原始菌株酿酒酵母M1和葡萄牙棒孢酵母M16菌株分别经ARTP筛选诱变保藏的具有富硒能力的菌种,原始菌株均是枸杞筛选出的内生酵母,保藏于宁夏大学生命科学学院,西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室。

氢氧化钠(分析纯),徐州天鸿化工有限公司;无水葡萄糖(分析纯),天津致远化学试剂有限公司;五水硫酸铜(分析纯),天津科密欧化学试剂有限公司;次甲基蓝(分析纯),天津风船化学试剂科技有限公司;酒石酸钾钠(分析纯),天津大茂化学试剂厂;酚酞(分析纯),天津津北精细化共有限公司;DPPH自由基清除试剂盒,北京雷根生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

NKLY-180S型立式全温振荡培养箱,常州诺基仪器有限公司;LDZF-50KB-Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1F型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;BSP-250型生化培养箱、FCD-3000 Serials型恒温鼓风干燥箱,上海琅轩实验设备有限公司;B83119553型分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TU-1810型紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;富美厨蒸锅,潮州市兴佳五金电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 硒标准溶液及培养基配制

1 000 μg/mL的硒标准溶液的配制:称取2.190 2 g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1 000 mL无菌水中(只计算硒元素的量),在超净台内用0.22 μm孔径滤膜过滤,稀释得到20 μg/mL的硒标准溶液[9]。酵母摇瓶培养基:YPD培养基。

1.3.2 M1-5和M16-28菌株相容性测定

分别对2株菌在YPD固体培养基上进行单独培养和共培养。将培养基分成4份,按4种方式接种:1)单独培养M1-5,取2 μL点涂于1/4平板上;2)单独培养M16-28,取2 μL点涂于1/4平板上;3)对2株菌进行共培养,取2 μL M1-5和M16-28菌液间隔0.5 cm和间隔1 cm点涂于1/4平板上;4)多次取2 μL M1-5点涂于1/4平板上,然后取2 μL M16-28菌液点涂于M1-5菌落之间。

1.3.3 枸杞苦荞黄酒的发酵

在传统摊饭法[10]的基础上,根据接种酵母菌的不同进行相应调整。

原料处理:挑选颗粒饱满、完整有色泽的糯米,完整无霉变的苦荞,清洗,分别称取适量糯米和苦荞加清水没至1～2 cm浸泡约24 h,糯米以可轻松搓散为宜,苦荞以膨大松软为宜,捞出沥干备用;枸杞原浆直接按比例加入。

蒸煮:原料(糯米、苦荞)加盖恒温蒸制30 min,得到膨胀发亮、松散柔软、颗粒分明的糯米和苦荞,摊凉至38 ℃以下。

配比装罐:固定糯米量为苦荞的10倍,枸杞和苦荞量按比例加入,并将饮用水适量加入(糯米能颗粒分明不发黏为宜)。

糖化:向发酵容器中添加发酵剂糖化剂。黄酒曲AN01剂量按糯米质量的0.6%添加,24 ℃糖化2 d,获得糖化醪。

酒精发酵:间隔48 h顺序接种酵母菌、预实验确定发酵温度为24 ℃。

过滤:用无菌纱布对发酵枸杞苦荞黄酒进行粗滤,后用无菌滤纸片进一步过滤。

煎酒:85 ℃高温杀菌30 min,进行杀菌处理,得到成品黄酒。

1.3.4 枸杞苦荞黄酒发酵菌株接种方式的确定

在接种量2%、接种体积比1∶1的条件下,酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母活化培养至对数期,使菌密度达到106～107 CFU/mL。枸杞苦荞黄酒发酵菌种接种方式见表1,24 ℃恒温发酵9 d[11-13]。

1.3.5 枸杞苦荞黄酒发酵工艺优化

1.3.5.1 单因素实验设计

固定干糯米质量为200 g/瓶(为苦荞质量的10倍),糖化时间为2 d。设置单因素实验分别考察枸杞原浆与苦荞复配质量比[2.0∶1.0、1.5∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0(g/g)]、接种比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)和发酵时间(5、7、9、11 d)的影响,测定枸杞苦荞黄酒酒精度、总糖、总酸和总酯的含量,并进行感官评价。

1.3.5.2 响应面试验设计

根据单因素实验,以枸杞原浆与苦荞复配质量比(A)、接种比例(B)、接种量(C)及发酵时间(D)为自变量,以感官评分(Y)为响应值,每个因素取3个水平,进行枸杞苦荞黄酒发酵工艺的Box-Behnken响应面优化。响应面试验因素与水平见表2。

1.3.6 枸杞苦荞黄酒理化指标的测定

总糖:按照GB/T 13662—2018《黄酒》中总糖的检测方法测定[14]。

酒精度:采用密度瓶法进行检测[15]。

总酸:采用标准NaOH溶液直接滴定法,取2 mL待测酒液于250 mL锥形瓶中,加入50 mL蒸馏水,滴入3滴0.1 g/L酚酞指示剂,用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红色,且0.5 min内不褪色,记录所消耗NaOH标准溶液的体积V1;另设空白组,记录所消耗NaOH标准溶液的体积V2。按式(1)计算总酸质量浓度(以乳酸计,g/L)[15]。

ρ(总酸)

(1)

总酯:将4 mL发酵液稀释10倍加入200 mL三角瓶中,滴加酚酞指示剂,用0.1 mol/L的NaOH滴至红色且30 s不变色后再加入25 mL 0.1 mol/L的NaOH。在沸水浴中加热45 min,冷却至室温,随即用0.1 mol/L HCl滴定至无色且30 s不变色,记录HCl消耗量[16]。总酯质量浓度(g/100 mL)计算见式(2)。

ρ(总酯)

(2)

式(2)中,c1为NaOH浓度,mol/L;c2为HCl浓度,mol/L;V1为HCl消耗体积,mL。

1.3.7 枸杞苦荞黄酒的感官评价

组织有相关专业知识背景的品评小组10人对枸杞苦荞黄酒进行感官评价,总分取平均值后即为最终感官评价得分。主要从色泽、香气和口味3个方面评价,枸杞苦荞黄酒感官评分标准见表3[17]。

1.3.8 枸杞苦荞黄酒功能性成分、总硒及无机硒含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样品中总黄酮含量。采用福林酚法测定样品[18]。采用GB 5009.93—2017《食品安全国家标准:食品中硒的测定》中的氢化物原子荧光光谱法测定糯米和黄酒的总硒含量;参考DBS42010—2018《食品安全地方标准:富硒食品中无机硒的测定方法》中的固相萃取得分取整数。

原子荧光光谱法检测黄酒的无机硒含量;有机硒含量由总硒含量减去无机硒含量得到[19]。

1.3.9 枸杞苦荞黄酒DPPH 自由基清除能力的测定

使用DPPH 自由基清除试剂盒,按照酒样:氮自由基提取物体积比为1∶9振荡混匀,10 000 r/min离心10 min,取上清液备用。样本测定管取样时分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL供试酒上清液于试管中,用无水乙醇补至1.1 mL,取0.9 mL DPPH溶液,混匀,避光静置30 min,于波长517 nm处检测吸光度(A1)。样本对照管取样时分别加入样液相对应体积的酒上清液于试管中,用无水乙醇补至 2 mL,混匀,避光静置30 min,于波长517 nm处检测吸光度(A2),空白管中分别加入样液相对应体积的氮自由基提取物,用无水乙醇补至1.1 mL后加入DPPH溶液0.9 mL,混匀,避光静置30 min,于波长517 nm处检测吸光度(A0)。根据式(3)计算清除率。

DPPH自由基清除率

(3)

1.3.10 枸杞苦荞黄酒菌落总数的测定

采用血球计数法测定枸杞苦荞黄酒发酵过程中所有酵母菌总体数量的变化[20]。活菌数采用平板计数法测定。

1.3.11 枸杞苦荞黄酒发酵动力学模型的建立

按优化工艺发酵制备未添加亚硒酸钠的枸杞苦荞黄酒(Z)和添加亚硒酸钠的富硒枸杞苦荞黄酒(XZ)并建立动力学模型。Z酒样发酵采用未添加亚硒酸钠处理的诱变菌株M1-5和M16-28。XZ酒样在酵母摇瓶培养时,按5%接种量将诱变菌株M1-5和M16-28加入含20 μg/mL硒标准溶液的发酵体系中,富硒酵母可以将亚硒酸钠中的无机硒转化为有机硒[21]。各菌株分别培养至对数期接种,从第0天开始,间隔2 d取适量样品,分别测定菌落总数及理化指标(总糖、酒精度、酯)变化,并建立枸杞苦荞黄酒发酵过程中菌落总数、乙醇生成、总酯生成和总糖消耗相关的动力学模型。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,采用SPSS 23进行单因素方差分析,P<0.05具有统计学意义,Design Expert 13中Box-Behnken模型进行响应面试验设计及分析。运用Origin 2021软件建立枸杞苦荞黄酒发酵动力学模型。

2 结果与分析

2.1 M1-5和M16-28菌株相容性分析

分别在YPD固体培养基上对2种酵母进行单独培养和共培养,结果见图1。由图1可知,2种菌单独培养时菌落生长良好。共培养时,无论是间隔0.5 cm还是间隔1 cm,M16-28菌落生长速度要比M1-5的菌落快;当2种菌株生长接触时,菌株均可正常生长,中间无抑菌带。当2株菌间隔1 cm和单独培养时,菌落边缘整齐且光滑,说明2株菌无拮抗作用。

2.2 不同发酵方式对枸杞苦荞黄酒品质的影响

以添加枸杞和苦荞但未接菌的处理组为对照(CK),分别对原始菌株及其顺序混合发酵、诱变菌株及其顺序混合发酵处理进行了比较,结果见表4。由表4可知,酵母单株发酵没有优势。诱变菌株M1-5、M16-28单菌株发酵时,酒精度与原始菌株M1和M16相比,差异不显著;但总糖含量均显著低于原始菌株,总酸和总酯含量均显著高于原始菌株单菌株发酵,因此,诱变菌株较原始菌株发酵是具有优势的。混合接种发酵产物的酒精度均高于原始菌株M1和M16单菌发酵产物,其总糖含量低于原始菌株,总酯含量均高于初始菌株的总酯含量。间隔48 h顺序发酵中,先接种酿酒酵母后间隔接种非酿酒酵母的方式较佳,其酒精度、总酯含量达最大,总糖最小,总酸也较低。根据感官评分可以看出,诱变菌株单菌发酵酒样评分均高于原始菌株单菌发酵酒样,M1-5+M16-28的间隔48 h顺序发酵酒样感官较佳。因此,后续选择这种方法进行单因素实验。

2.3 枸杞苦荞黄酒发酵工艺优化结果分析

2.3.1 单因素实验结果分析

不同单因素对枸杞苦荞黄酒理化指标和感官评分的影响见表5。由表5可知,酒精度随着苦荞占比增加呈先增加后减小并趋于稳定的趋势,总糖呈先减小后增大的趋势。当比例为1.5∶1.0时,总酯含量和酒精度达到最大,总酸和总糖含量均最小,表明产生的酯类物质丰富。各组感官评分差异不显著,但评分最高达(69.67±6.43)分。M1-5与M16-28接种量比为3∶1、2∶1和1∶1时,各样品酒精度和感官评分虽无显著差异,但2∶1时总酯含量要显著高于其余两组(P<0.05)。在接种量为6%时,酒精度达最大,同时总糖和总酸的含量最小;当酵母接种量过高时,发酵液中的糖消耗过快,用于转化酒精的糖分会相应减少,且发酵罐中的营养物质有限,总酯和酒精度的产生会受到限制[22]。接种量6%时,总酯含量最高,感官评分也最高[(79.33±1.53)分],所酿黄酒具有枸杞果香,香气协调。发酵第9天时,总酯含量最大,所得黄酒酒香浓郁,枸杞和苦荞口感协调,酒味柔顺可口,感官评分最佳[(76.00±2.00)分]。综上所述,优化w(枸杞原浆∶苦荞)(g/g)为1.5∶1.0,接种比例为V(M1-5)∶V(M16-28)=2∶1,接种量为6%,发酵时间为9 d时枸杞苦荞黄酒的品质较好。

2.3.2 响应面试验结果分析

Box-Behnken试验设计及结果见附录附表1,二次响应面回归模型方差分析结果见表6。

由表6可知,以酒精度(Y1)和感官评价(Y2)为响应值,模型P值差异均为极显著(P<0.01),失拟项P(酒精度)=0.292 4和P(感官评分)=0.079 3均不显著(P>0.05),表明该模型有效。

通过响应面软件对表6的结果进行分析,得到枸杞苦荞黄酒酒精度(Y1)的回归方程:Y1=16.34+0.34A+0.11B+0.25C+0.18D-0.015AB-0.038AC+0.28AD-0.020BC+0.13BD+0.19CD-0.71A2-0.69B2-0.75C2-0.84D2。该模型决定系数R2=0.930 0,校正决定系数说明其拟合效果好、数据可信度高,预测性好。Y1模型中A、C、A2、B2、C2、D2表现为极显著(P<0.01),D、AD表现为显著(P<0.05),其余均不显著(P>0.05),通过F值和P值得到各因素对酒精度的影响由强到弱依次为w(枸杞原浆∶苦荞)(A)、接种量(C)、发酵时间(D)、接种比例(B)。

通过响应面软件对表6的结果进行分析,得到枸杞苦荞黄酒感官评价(Y2)的回归方程:Y2=82.88+1.63A+0.78B+1.30C+1.45D-0.85AB+1.95AC+0.70AD+0.30BC+0.30BD-1.75CD-5.50A2-4.37B2-4.20C2-4.07D2。该模型决定系数R2=0.928 5,校正决定系数说明其拟合效果好、数据可信度高,预测性好。Y2模型中A、D、A2、B2、C2、D2表现为极显著(P<0.01),C、AC、CD表现为显著(P<0.05),其余均不显著(P>0.05),通过F值和P值得到影响感官评价的各因素顺序为w(枸杞原浆∶苦荞)(A)、发酵时间(D)、接种量(C)、接种比例(B)。

各因素交互作用对酒精度和感官评分的影响见附录附图1。由附录附图1可知,随着w(枸杞原浆∶苦荞)和发酵时间的增加,曲面呈现良好的拱形,酒精度存在最大值,其交互作用对枸杞苦荞黄酒的酒精度的影响显著(P<0.05)。w(枸杞原浆∶苦荞)和接种量、发酵时间和接种量的交互作用对枸杞苦荞黄酒的感官评分的响应曲面均呈凸形,等高线呈椭圆形,说明两两交互作用影响显著(P<0.05),但发酵时间和接种量交互作用的响应面曲线凸形较平缓,说明二者交互作用没有w(枸杞原浆∶苦荞)和接种量交互作用显著,与方差分析结果一致。

2.4 枸杞苦荞黄酒验证实验结果分析

根据响应面分析得出的优化工艺条件为w(枸杞原浆∶苦荞)(g/g)为1.6∶1.0,酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母接种比例为2.1∶1.0,酵母接种量6.3%,发酵时间9.3 d,Design-Expert 13软件优化参数,预测酒精度为16.43%vol、感官评价为83.286分。实际操作中,由于数值、比例等不好计算和把控,会对参数进行调整,使得调整后的条件更利于实际操作。调整后结果会较原最优参数结果略有下降,但整体在预测数值的合理偏差范围内,更适用于大规模操作。因此,调整优化工艺条件为,w(枸杞原浆∶苦荞)(g/g)为1.5∶1.0,酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母接种比例为2∶1,酵母接种量为6%,共发酵时间为9 d。在此条件下酿造枸杞苦荞黄酒,最终得到枸杞苦荞黄酒酒精度为(16.28±0.19)%vol,总糖为(6.85±0.17)g/L,总酯为(3.17±0.14)g/100 mL,总酸为(5.97±0.11)g/L,感官评价得分为(82.40±1.14)分,与预测的数值基本一致,在5%偏差范围内。说明该模型优化得到的工艺参数可靠,响应面分析得到的枸杞苦荞黄酒发酵工艺参数对其生产具有指导意义。

2.5 枸杞苦荞黄酒发酵动力学模型分析

2.5.1 酵母菌生长动力学模型分析

用Logistic、SGompertz和Boltzmann这3种模型分别对枸杞苦荞黄酒Z和富硒枸杞苦荞黄酒XZ酒样建立酵母菌生长动力学模型,其拟合方程及其相关系数见表7。由表7可知,对于Z酒样来说,其发酵过程中Logistic、SGompertz和Boltzmann这3种模型拟合系数R2依次为0.967 8、0.893 0、0.977 5,XZ酒样的拟合系数R2依次为0.958 4、0.911 1、0.970 5,SGompertz模型的拟合系数低于其他2种模型,但以上模型均能较好地反映枸杞苦荞黄酒发酵过程乙醇含量的变化。由于Boltzmann模型的R2更接近于1,所以选择Boltzmann模型用于定量描述和预测枸杞苦荞黄酒发酵过程中酵母菌生长情况(图2)。由图2(a)可知,糖化2 d时,酵母菌增长缓慢;接酿酒酵母2 d后(即第3、4天)及共接种发酵5 d(即第9天)时,酵母菌生长较快;共接种发酵时间大于5 d(即9 d后),酵母菌总数均趋于稳定,后期略有下降,这可能与细胞自溶有关。Boltzmann拟合曲线与实验结果基本相符,可以用于描述发酵液中酵母菌总数的动态变化情况。图2(b)为Z酒样发酵过程中酵母活菌数,可以看出葡萄牙棒孢酵母生长良好,先接种酿酒酵母后接种非酿酒酵母菌株对菌株抑制作用并不显著。

2.5.2 乙醇生成动力学模型分析

乙醇生成动力学模型拟合方程及其相关系数见表8。由表8可知,对Z酒样来说,其发酵过程中Logistic、SGompertz和Boltzmann这3种模型拟合系数R2依次为0.995 0、0.990 0、0.999 0,XZ酒样的拟合系数R2依次为0.994 7、0.989 3、0.998 4,以上模型均能较好地反映枸杞苦荞黄酒发酵过程中乙醇含量的变化,但SGompertz模型的拟合系数低于其他2种模型。由于Boltzmann模型的R2更接近于1,所以用于定量描述和预测枸杞苦荞黄酒发酵过程中乙醇生成情况(图3)。由图3可知,接种酿酒酵母2 d后及共接种发酵6 d(即第8天)时,乙醇生成较快;共接种发酵时间大于6 d时,乙醇生成趋于稳定。

2.5.3 总酯生成动力学模型分析

总酯生成动力学模型拟合方程及其相关系数见表9。由表9可知,对于Z酒样来说,其发酵过程中Logistic、SGompertz和Boltzmann这3种模型拟合系数R2依次为0.997 9、0.995 1、0.997 8,XZ酒样的拟合系数R2依次为0.995 3、0.992 6、0.992 3。由于Logistic模型的R2更接近于1,所以用于定量描述和预测枸杞苦荞黄酒发酵过程中总酯生成情况,拟合曲线见图4。由图4可知,接酿酒酵母2 d后及共接种发酵6 d(即第8天)时,总酯生成较快;共接种发酵时间大于6 d时,总酯生成趋于稳定。

2.5.4 总糖消耗动力学模型分析

总糖消耗动力学模型拟合方程及其相关系数见表10。由表10可知,对于Z酒样来说,其发酵过程中DoseResp和Boltzmann模型拟合系数一致,拟合系数R2=0.990 6,说明这2种模型均能较好地反映枸杞苦荞黄酒发酵过程总糖含量的变化,但均低于Logistic模型的拟合系数R2=0.991 4。XZ酒样DoseResp和Boltzmann模型拟合系数均为R2=0.996 2,同样均低于Logistic拟合系数R2=0.996 4,均能较好地反映枸杞苦荞黄酒发酵过程总糖含量的变化。综合比较,Logistic模型用于定量描述和预测枸杞苦荞黄酒发酵过程中总糖消耗情况,拟合曲线见图5。由图5可知,接酿酒酵母2 d后及共接种发酵6 d(即第8天)时,总糖消耗较快,表明枸杞苦荞黄酒主发酵即将结束;共接种发酵时间大于8 d时,总糖消耗趋于稳定。

2.6 枸杞苦荞黄酒功能性成分含量分析

分别对纯糯米黄酒(M)、枸杞糯米黄酒(M+G)、苦荞糯米黄酒(M+K)、枸杞苦荞黄酒(Z)和富硒枸杞苦荞黄酒(XZ)的总黄酮和总酚含量进行测定,结果见表11。酒样按优化工艺流程制备,总体积不变,按比例加入不同的原料,其中Z和XZ的区别是XZ在酵母摇瓶培养时加入体积分数5%的20 μg/mL硒标准溶液亚硒酸钠,将亚硒酸钠中的无机硒转化为有机硒。

多酚和类黄酮是黄酒的一些主要有效成分。它们是良好的功能性食品添加剂,具有镇咳、祛痰、护肝、抗氧化和抗衰老作用[23]。黄酮可有效清除体内的氧自由基,有防止细胞衰老、抗炎、镇痛等功效[24]。由表11可知,Z和XZ的总酚质量浓度为1.370、1.395 mg/mL,与M相比,总酚含量差异不显著(P>0.05),总黄酮含量差异显著(P<0.05);因此,添加功能性原料发酵黄酒主要是提高总黄酮含量。对比M+G和M+K样品可知,枸杞和苦荞分别和糯米发酵均可以提高黄酒的功能性成分含量,Z和XZ酒样中黄酮含量显著提高,均高于其他酒样。说明联合使用枸杞苦荞发酵所得的新型黄酒的功能性成分高于单纯的枸杞黄酒和苦荞黄酒,具有良好的保健效果。Z和XZ的总黄酮含量分别为0.131、0.118 mg/mL,Z的总黄酮含量略高于XZ样品,但XZ总酚含量略高于Z样品。

2.7 枸杞苦荞黄酒有机硒含量分析

枸杞苦荞黄酒的硒含量见表12。由表12可知,枸杞苦荞黄酒(Z)和富硒黄酒(XZ)的有机硒比例均高于76%,说明富硒黄酒中的硒以有机硒为主,在发酵过程中,有机硒得到了良好的保留,并充分释放到了黄酒酒液中。同时,XZ样品中有机硒是Z样品有机硒含量的16倍,分别为0.012 8、0.000 8 mg/kg。张标金等[19]以富硒糯米为硒源,制备了硒质量浓度为41.1 μg/L的富硒黄酒,并提出将富硒黄酒硒质量浓度的标准设定为0.01～0.08 mg/L的建议。本研究中富硒黄酒的硒质量比为0.016 7 mg/kg,说明在富硒酵母菌摇瓶培养时添加亚硒酸钠能够大大增加黄酒中有机硒的含量,因此富硒黄酒具有一定的补硒价值。

2.8 枸杞苦荞黄酒抗氧化性能分析

分别对M、M+K、M+G、Z和XZ酒样进行了DPPH自由基清除率的测定,结果见图6。由图6可知,M+G、Z和XZ酒样随着添加量增加对DPPH自由基的清除率呈先迅速上升后趋于稳定的趋势,各组酒样之间DPPH自由基清除率差异极显著(P<0.001)。当酒样体积大于0.6 mL时,M+G、Z和XZ酒样的清除能力趋于稳定,其最大清除率分别为84.09%、89.16%、94.49%;随着添加量的增加,M、M+K酒样的清除能力逐渐增大,最大清除率为73.48%、78.21%,表现出较强的清除能力。Z和XZ酒样对DPPH自由基的清除能力均优于M、M+K、M+G酒样。且XZ的DPPH自由基清除率是最大的,因此在摇瓶时加入亚硒酸钠发酵的黄酒(XZ)的抗氧化活性要高于枸杞苦荞黄酒(Z)。同时,枸杞和苦荞两者配伍时具有协同作用,可增加其活性物质含量,从而提高枸杞苦荞黄酒的抗氧化活性。参考黄婷[25]测得的市售黄酒(S-H)的最大DPPH 自由基清除率为72.66%,胡得妹[26]测得的会稽山黄酒的清除率最大达55%左右,其次是古越龙山50%左右、咸亨和塔牌各为30%。因此,本研究所得Z和XZ酒样的DPPH自由基清除率均高于市售和对照组黄酒,说明XZ和Z均具有较好的抗氧化活性,且XZ的抗氧化活性相较于Z更好。

3 讨 论

枸杞(Lycium barbarum)是宁夏五大瑰宝之一,已成为人们日常生活中不可或缺的保健食品。作为药食同源食品,人们更加注重枸杞产品和资源的开发与利用[3]。目前用枸杞发酵黄酒研究较少,主要集中在新型功能性黄酒护色、研发、工艺优化等方面。姬中伟[27]利用单因素实验、正交试验分析了枸杞黄酒发酵过程中还原糖以及酒精含量的变化,得到了优化酿造工艺参数,确定了枸杞的优化用量为大米原料的9%,并找到了一种适合保护枸杞黄酒色泽的方法。杨晓凤等[28]以大米为主要原料,山药、黑米、黄精、红枣和枸杞为辅料,研究养生黄酒的发酵工艺。于磊娟等[29]以松针和枸杞为主要原料,对松针枸杞黄酒的制备方法进行了研究,确定了优化松针汁与枸杞汁体积比为2∶3。同时,苦荞也是药食同源食物,有许多重要生理功能,也可以用于黄酒发酵,但相关研究较少。周金虎等[30]选用脱壳苦荞、糯米和苦荞比例2∶1∶1,制备出总黄酮含量较高的营养健康苦荞黄酒。许锡飚[17]使用苦荞和糯米为主要原料,采用双边发酵工艺确定了生产苦荞黄酒的工艺方法,得出苦荞的最适用量为总原料的40%,该发酵工艺生产的黄酒酒精度可达18.7%vol。这些研究均是单一添加枸杞或苦荞为辅料,本研究同时添加了枸杞和苦荞,以期获得两者复配的优质新型黄酒。研究结果显示,确定w(枸杞原浆∶苦荞)(g/g)1.5∶1.0,以10倍苦荞量的糯米为主料,通过单因素及响应面试验确定了发酵枸杞苦荞黄酒的优化发酵工艺,并研发出一款以枸杞和苦荞为辅料的新型功能性枸杞苦荞黄酒(Z)和富硒枸杞苦荞黄酒(XZ),其总酚含量分别为1.370、1.395 mg/mL,黄酮分别为0.131、0.118 mg/mL,其中总酚含量与纯糯米黄酒(M)差异不显著,但黄酮含量显著提高。Z黄酮含量相较于M提升了2.85倍,XZ相较于M提升了2.47倍,而枸杞糯米酒(M+G)和苦荞糯米酒(M+K)相较于M分别提升了0.44和1.21倍;因此,无论是Z还是XZ酒样的黄酮含量都要显著高于其他对照组。同时本研究所得Z和XZ酒样DPPH自由基清除率均高于市售和对照组黄酒,说明XZ和Z均具有较好的抗氧化活性,实现枸杞和苦荞复配后功效更优。此外,本研究中枸杞与苦荞2种辅料的最适添加量,与单一辅料应用时的最适添加量不同,这是因为需要平衡风味协调性,以赋予产品风味的多样性与立体感。但本研究也存在局限性,通过ARTP诱变筛选枸杞内生富硒酵母菌株时,筛选的标准主要是产酒精能力和产香特征,未将硒含量纳入评价标准,因此菌株硒转化能力较弱。后续可以在现有菌株的基础上,以硒含量为筛选指标,进行二次筛选或驯化,提升菌株富硒能力;或者可以在混菌发酵响应面优化体系中选择硒含量为响应值,探索出硒含量更多的枸杞苦荞黄酒的制备工艺,进一步提升黄酒品质。

非酿酒酵母与酿酒酵母相互作用可以提高产品质量,王晓蕊[31]从8株酿酒酵母和10株库德毕赤酵母中分别筛选出1株耐受性强、发酵性能良好的菌株用于混合发酵黄酒,并对发酵工艺进行优化,使得黄酒风味品质得到很大提升。以酿酒酵母jiangnan1诱变及生孢纯化筛选,获得1株产醇酯较佳的酿酒酵母Y28-23,并进一步优化酿酒酵母Y28-23与异常威克汉姆酵母Y34的共酵条件,发现在主发酵阶段的温度为20℃的条件下以 1∶10的添加比例共酵黄酒,对于黄酒醇酯比的优化效果较佳[32]。许明明等[33]对2株红曲霉(A5、B6)、2株米根霉(M1、M2)和1株酿酒酵母(NY02)进行组合混菌发酵,组合A5+B6+M2+NY02与A5+B6+M2+Y2发酵所得酒样清亮透明,呈红琥珀色,具有红曲黄酒特征风味及较爽适的口感,建立了纯种多菌混合发酵技术制备清爽型干红曲黄酒的方法,实现了红曲黄酒质量的可控性。郑超群[34]以酿酒酵母(S. cerevisiae)和异常汉逊酵母(Hansenula anomala)作为黄酒发酵菌种,考察复合酵母对黄酒发酵过程及产品风味的影响。本研究用实验室前期筛选出的高产酒精的酿酒酵母和高产香的葡萄牙棒孢酵母菌株(均为枸杞内生富硒酵母菌株)为发酵剂,酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母接种比例2∶1,且间隔48 h顺序发酵,酵母接种量6%,共发酵9 d酿造枸杞苦荞黄酒,所得酒样色泽棕红、透亮有光泽;有枸杞和苦荞独特香气且香味协调。本研究选择的酿酒酵母和非酿酒酵母间隔48 h顺序接种的方式,参考了前人研究。Lleixà等[11]发现前48 h内顺序接种酵母可提升发酵效果。肖世娣[13]通过理化指标、挥发性成分和感官品评对比,发现采用Z5和ZRF5酵母间隔48 h顺序接种的发酵性能较好。因此,本研究也采用48 h间隔顺序接种。本研究的接种顺序一方面是通过不同接种方式验证实验确定,另一方面是结合菌株特性确定。前期实验证明,M16-28酒精耐受性良好,可在12～16%vol下生长,且本研究中接种非酿酒酵母后仍需发酵9 d,后酵时间长,可为非酿酒酵母产香提供一定的时间。在相同接种量下,菌株M16-28的生长速度要明显比M1-5快,提前接种可能会抑制酿酒酵母的正常发育。Lleixà等[11]发现,先接种酿酒酵母对非酿酒酵母菌株的发酵具有稳定作用,且降低了发酵结束时的酵母多样性。因此,本研究在酒精度评价的基础上,结合耐受性和其他理论指标,确定了先接种酿酒酵母后接种非酿酒酵母的顺序接种方法。

发酵动力学模型的建立有助于理解发酵过程,可对实验过程进行定量分析,并进一步预测实验指标[35]。用于酵母菌发酵酒类的发酵动力学建立的经典模型有Logistic、Boltzmann、SGompertz和Dose-Resp模型等。前3个模型均适用于描述S形曲线,即在有限范围内因限制因素影响而趋于平衡的系统,常用于描述生长或产物的形成过程;DoseResp模型仅适用于底物或抑制剂的剂量效应,不适用于完整的生长曲线,常用于描述底物或抑制剂浓度对生长或产物形成的影响[36]。李雪等[36]通过这几种模型对仙人掌果酒发酵过程进行非线性拟合,其中用SGompertz模型拟合生长情况,Logistic模型拟合产物生成情况,DoseResp模型拟合基质消耗过程,拟合模型良好。张雪等[37]采用Origin软件选择4种模型分别对啤酒发酵过程进行拟合,其中酵母菌生长、乙醇生成用Boltzmann模型拟合度较高;糖类基质的消耗用DoseResp模型拟合度较高。潘立妮等[38]对樱桃果酒发酵过程进行了拟合,其中酵母菌生长及乙醇生成动力学模型均可用Boltzmann模型较好拟合,总糖消耗动力学模型均可用DoseResp和Boltzmann模型较好拟合。本研究利用Logistic、DoseResp和Boltzmann模型对菌株生长量、乙醇含量、总酯含量及总糖含量进行非线性拟合,应用Boltzmann模型建立酵母总数和乙醇生成动力学模型、Logistic模型方程建立总酯生成以及总糖消耗动力学模型,并采用拟合系数R2对拟合模型进行可靠性评价,所选模型均能够较好地描述枸杞苦荞黄酒的发酵动力学特征。枸杞苦荞黄酒的相关研究可以推动苦荞与枸杞2种药食同源植物资源的深加工研究,所得发酵型枸杞酒果香浓郁并具有枸杞典型香味,也满足了人们对营养保健方面的需求。通过对枸杞苦荞黄酒发酵动力学的研究可了解发酵过程中黄酒生理生化变化及动力学特征。

4 结 论

本研究以糯米为原料,枸杞原浆与苦荞为辅料发酵酿造枸杞苦荞黄酒,以酒精度与感官品质为考察指标,通过不同接种方式、单因素实验与响应面试验得到枸杞苦荞黄酒发酵的优化工艺。优化条件为w(枸杞原浆∶苦荞)(g/g)为1.5∶1.0,酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母接种比例为2∶1,且间隔48 h顺序发酵,酵母接种量为6%,共发酵9 d酿造枸杞苦荞黄酒,此条件下得到的成品品质较佳,酒精度为(16.28±0.19)%vol,总酯为(3.17±0.14) g/100 mL,感官评分为(82.40±1.14)分。酒体色泽棕红、透亮有光泽;有枸杞和苦荞独特香气且香味协调、浓郁;口味纯正且无异味。枸杞苦荞黄酒(Z)和富硒枸杞苦荞黄酒(XZ)的功能性成分含量要高于对照组的含量,其中黄酮分别为0.131、0.118 mg/mL,总酚含量分别为1.370、1.395 mg/mL,均具有较好的抗氧化活性,Z和XZ酒样的DPPH自由基最大清除率分别89.16%和94.49%,且XZ的抗氧化活性相较于Z更好,同时XZ酒样的有机硒含量为0.012 8 mg/kg,具有较高的补硒价值。对其进行发酵动力学模型的构建,应用Boltzmann模型建立酵母总数和乙醇生成动力学模型、Logistic模型方程建立总酯生成动力学模型以及总糖消耗动力学模型,模型的试验值与预测值之间的拟合度较高,X酒样的R2分别为0.977 5、0.999 0、0.997 9、0.991 4;XZ酒样的R2分别为0.970 5、0.998 4、0.995 3和0.996 4,均能很好地反映该黄酒在正常和富硒状态下发酵过程中的动力学特征。研究所得新型枸杞苦荞黄酒对丰富枸杞和苦荞的产品以及开发新型复合酒有一定的研究意义,旨在为工业发酵黄酒的发酵罐设计及发酵过程工艺控制提供数据参考。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http://dx.doi.org/10.12301/spxb202500024在线版本中找到。

Appendix：supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found in the online version, at http://dx.doi.org/10.12301/spxb202500024.

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Optimization of Fermentation Process and Establishment of Kinetic Models for Goji-Buckwheat Selenium-Enriched Huangjiu

WANG Guoqin1, SONG Yanxin1, ZHANG Siyu1, REN Yizhuo1, ZHANG Rui1, ZHENG Rui1, YU Junwei2, SU Jianyu1, YUE Sijun1,*

(1.College of Life Sciences/Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;2.Ningxia Zhongning Wolfberry Industry Innovation Research Institute Co., Ltd., Yinchuan 755100, China)

Abstract：Goji berry and buckwheat are two plant resources with both medicinal and edible values, rich in various functional components. A novel functional Huangjiu was developed, using glutinous rice as the main raw material and goji berry and buckwheat as auxiliary materials to enhance their economic value and diversify the utilization of goji berry. Through single-factor experiments and response surface methodology, using alcohol content and sensory evaluation as indicators, the fermentation process parameters were optimized. Additionally, the antioxidant activity of the Huangjiu was measured, functional components and the selenium content in selenium-enriched samples were analyzed. Kinetic models for the fermentation process were established. Results showed that the optimal fermentation conditions were as follows, a mass ratio of w (goji berry:buckwheat) of 1.5∶1.0, saccharification agent addition of 0.6%, sequential inoculation with an inoculation ratio of Saccharomyces cerevisiae to Clavispora lusitaniae of 2∶1 at 48 h intervals, inoculation amount of 6%, and fermentation time of 9 d. Under these conditions, the resulting Huangjiu had an alcohol content of (16.28±0.19)%vol, a total ester content of (3.17±0.14) g/100 mL, and a sensory score of (82.40±1.14) points, and the flavonoid content was significantly increased. Antioxidant activity tests indicated that the maximum DPPH free radical scavenging rates for goji-buckwheat Huangjiu (Z) and selenium-enriched Huangjiu (XZ) were 89.16% and 94.49%, respectively. Moreover, the organic selenium content in XZ was 0.012 8 mg/kg, which had a high value for selenium supplementation. Based on the fermentation conditions, the Boltzmann model was applied to establish kinetic models for total yeast population and ethanol production, and the Logistic model equation was used to establish kinetic models for total ester production and total sugar consumption. The models showed high fitting degrees between predicted and experimental values, with R2 values for XZ being 0.970 5, 0.998 4, 0.995 3, and 0.996 4, respectively, effectively reflecting the kinetic characteristics of the fermentation process. This study aimed to provide data support for the design of industrial fermentation tanks and the intelligent control of the fermentation process.

Keywords：Huangjiu; selenium-enriched; yeast; fermentation process; kinetic models; functional property

中图分类号：TS261.4; Q815

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500024

文章编号：2095-6002(2025)06-0068-16

引用格式：王国琴,宋妍欣,张思雨,等.枸杞苦荞富硒黄酒发酵工艺优化及动力学模型建立[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):68-83. WANG Guoqin, SONG Yanxin, ZHANG Siyu, et al. Optimization of fermentation process and establishment of kinetic models for goji-buckwheat selenium-enriched Huangjiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6): 68-83.

收稿日期：2025-01-12

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32460098);宁夏重点研发计划项目(2022BBF02010、2024BBF02008)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (32460098); Key Research and Development Program Project of Ningxia (2022BBF02010,2024BBF02008).

第一作者：王国琴,女,硕士研究生,研究方向为微生物资源开发与利用。

*通信作者：岳思君,男,教授,博士,主要从事微生物学与发酵工程方面的研究。

(责任编辑：张逸群)