酱香型白酒生产以高粱为原料,以大曲为糖化发酵剂[1],历经2次投料、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒,酿造周期长达1年,再经盘勾、陈酿、勾调而成[2]。酱香型白酒的风味成分呈“三高一低二多”特征,即酸高、醇高、醛酮高、酯低、高沸点成分多、杂环化合物多[3],具有酱香突出、幽雅细腻、入口绵柔醇厚、空杯留香持久等特点。根据国家统计局数据,2024年酱香型白酒的产能约为65万kL,同比下降13.33%;销售收入达2 400亿元,利润约970亿元,同比分别增长4.35%和3.19%[4]。

酱香型白酒的酿造工艺具有鲜明特色与严格时序性,探究酱香型白酒轮次酒风味形成机制,可为其精准勾调提供科学依据,有助于品质的提升和风味稳定性的增强。刘家欢等[5]使用气相色谱-氮磷检测器测定了酱香型白酒中的8种吡嗪类化合物,发现其质量浓度在第1、2轮次酒中较低,从第3轮次酒开始升高,在第3～6轮次酒中维持较高水平。孙优兰等[6]探索了不同轮次酒间的风味特征,发现酯类化合物和醇类化合物具有显著性差异。Wu等[7]基于顶空固相微萃取结合GC-MS技术分析不同轮次酒的差异化合物,发现共有16种,分别为11种酯类、1种醇类、2种醛类和2种酮类化合物,且轮次越高的酒中芳烃类、醇类、醛类、酮类化合物的含量越高。

酱香型白酒中挥发性含氮化合物种类包括吡嗪类、噻唑类、吡咯类、吡啶类和胺类等几大类,大多数挥发性含氮化合物在白酒中以痕量水平存在,质量浓度多低于FID、MSD等检测器的检测限。部分挥发性含氮化合物因其低气味阈值和强香气特征,对酒体的香气特征和品质具有显著影响。吴李玲等[8]使用全二维气相色谱-氮化学发光检测器联用仪(comprehensive two-dimensional gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detector,GC×GC-NCD)对贵州、湖南、广西等20个不同产地的酱香型白酒中痕量含氮化合物进行了分析,发现了2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪等3种对酱香型白酒风味有重要影响的挥发性含氮化合物。吡嗪类化合物在白酒分析研究中也颇受关注,如吡嗪类化合物的典型代表——2,3,5,6-四甲基吡嗪[9],具有烘烤、花生和可可等焙烤香气,兼具消炎[10]、保护神经[11]和治疗心脑血管疾病[12]等作用,是酱香型白酒中不容忽视的健康因子[13];噻唑类化合物,以2-乙酰基噻唑为例,具有类似坚果、稻谷和爆米花的香气,常常赋予食品以特殊香味[14]。

近年来,随着分析技术的进步,对酱香型白酒中挥发性含氮化合物的分析研究虽然取得了一定进展,但目前仍存在一些局限。首先是研究范围有限。现有研究多集中于吡嗪类化合物,而对噻唑类、吡咯类、吡啶类等其他挥发性含氮化合物的研究较少,尤其是在轮次酒中的分布规律和风味贡献尚未得到系统分析。其次是技术手段不足。传统的一维气相色谱技术难以有效分离和检测痕量挥发性含氮化合物,导致部分低浓度、低阈值的风味物质被忽视。再者,轮次差异机制不明确。虽然已有研究揭示了部分吡嗪类化合物在轮次酒中的含量变化,但对其他挥发性含氮化合物的轮次含量差异机制研究仍较为匮乏。

全二维气相色谱是一种具有更高分离能力的多维气相色谱技术,其检测限比一维气相色谱灵敏 3～5倍,可良好分离的峰数量最多可达一维气相色谱的10倍[15-17]。应用氮化学发光检测器检测氮元素,具有灵敏度高、选择性高和线性范围宽的优点,其检出限低于3 pg/s。因此,GC×GC-NCD技术可作为分析检测酱香型白酒中挥发性含氮化合物的有效工具。

研究通过液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)结合GC×GC-NCD技术,分析酱香型白酒不同轮次酒中挥发性含氮化合物的种类和含量,结合香气活性值(odor activity value,OAV)法与正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA),筛选不同轮次酒间的特征差异成分,揭示挥发性含氮化合物对轮次酒的风味贡献。研究旨在揭示噻唑类化合物、吡咯类化合物、吡啶类化合物等挥发性含氮化合物对酱香型白酒风味的贡献,通过明确关键风味物质、量化风味贡献,希望可为酱香型白酒风味品质的精准调控与优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒样品:贵州仁怀市茅台镇某酒厂提供的酱香型第1～7轮次酒(各500 mL),酒精度在53% vol～62% vol,各轮次酒由同一生产周期的3个不同发酵窖池取酒混合所得。所采集酒样统一置于冰箱中4 ℃保存,直至分析。

吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙酰基-3-甲基吡嗪、2-乙酰基-3-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-异丁基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-乙酰吡啶、3-甲基吡啶、3-苯基吡啶、2-乙氧基噻唑、2-乙酰基噻唑、苯并噻唑、烟酸乙酯、氨基甲酸乙酯、邻氨基苯甲酸乙酯、邻甲氨基苯甲酸甲酯、2-吡咯甲醛、2-乙酰基吡咯、N-甲基吡咯烷酮、1-乙基吡咯-2-甲醛、辛腈、二甘醇胺、己内酰胺、二乙酰一肟、5-甲基喹喔啉、2,4,5-三甲基口恶唑、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶(均为色谱纯),氯化钠(分析纯),北京百灵威科技有限公司;乙醇、二氯甲烷,色谱纯,上海阿拉丁试剂公司;无水硫酸钠,分析纯,北京国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC×GC-NCD联用仪,美国力可公司(配备7890B型气相色谱仪、225NCD型氮化学发光检测器,美国Agilent公司;四喷口制冷型调制器,美国力可公司);GGC-C型分液漏斗垂直振荡器,北京国环高科自动化技术研究院;N-EVAPTM型氮吹仪,美国Organomation Associates公司;GenPure UV-TOC Xcad plus型超纯水仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性含氮化合物的萃取

参考Song等[18]的LLE方法,取第1～7轮次酒各25 mL,各酒样均用自制超纯水稀释至酒精度10% vol,加入氯化钠至饱和,并加入100 μL 25 mg/L的3-乙酰基吡咯做内标。每次用50 mL二氯甲烷充分振荡萃取,重复3次,合并有机相,加入无水硫酸钠并放置在-20 ℃冰箱中静置进行过夜除水,过滤后,经韦氏蒸馏柱浓缩至1 mL后,在室温25 ℃下使用氮吹仪氮吹至0.5 mL。每次取1.0 μL进样,用于GC×GC-NCD分析。各酒样平行萃取3次。

1.3.2 GC×GC-NCD条件

第一维柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二维柱为DB-5(2 m×0.25 mm×0.1 μm),2根色谱柱以串联方式连接。一维柱温箱升温程序为初始温度50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至150 ℃,以5 ℃/min速度升至230 ℃,保持 10 min;二维柱温箱升温程序为高于一维柱温箱5 ℃。调制器温度高于一维柱温箱15 ℃,调制周期为5 s,热吹时间1 s,冷吹时间1.5 s。载气为氦气,纯度99.999%,流速1 mL/min,进样口温度250 ℃,压力207 kPa,进样量为1.0 μL,不分流进样。

NCD检测器温度为250 ℃,燃烧室温度为900 ℃,氢气和空气流速分别为5 mL/min和10 mL/min,臭氧压力为0.03 MPa,采集速率设置为100 Hz。

1.3.3 挥发性含氮化合物定性、定量方法

1.3.3.1 定性分析

GC×GC-NCD数据采用LECO Chroma TOF Pegasus 4D软件初步处理,生成包含保留时间、峰体积、信噪比(signal/noise,S/N)和体积百分比的数据表,排除S/N<3的化合物后,将以上数据表与自建谱库中标准品保留时间进行对比定性分析。定性条件为标准品的一维保留时间±10 s、二维保留时间±0.1 s。

1.3.3.2 定量分析

采用外标曲线法对目标化合物进行定量。以色谱级乙醇为溶剂制备含有37种目标化合物标准品的母液,用体积分数为53% vol的乙醇溶液母液按1∶1的体积比例逐级稀释为8个梯度的标准溶液,取各混合标准溶液1.0 μL进行GC×GC-NCD分析,分析条件与1.3.2节相同。以各标准品与内标物的浓度比值为横坐标(x),各标准品与内标物的峰体积比值为纵坐标(y),进行线性回归分析,制作每种标准品化合物的标准曲线。

1.4 数据处理

所有实验数据重复测量3次,结果以平均值±标准偏差表示。方差分析采用GraphPad Prism软件;OPLS-DA和变量差异投影(variable importance in projection,VIP)值采用SIMCA14.1软件计算。

2 结果与分析

2.1 酱香型白酒轮次酒中检出的挥发性含氮化合物分析

在酱香型白酒的7个轮次酒中,共鉴定出37种挥发性含氮化合物,包括16种吡嗪类、4种吡咯类、4种含氮酯类、3种噻唑类、3种吡啶类、7种其他类含氮化合物。7个轮次酒中总的挥发性含氮化合物的定性结果见表1。

第1～7轮次酒中依次鉴定出25、22、25、26、31、33、26种挥发性含氮化合物,结果见表2。第6轮次酒中检测到的挥发性含氮化合物最多,为33种;其次是第5轮次酒,为31种;第2轮次酒中检测到的挥发性含氮化合物种类最少,为22种。其余轮次酒中挥发性含氮化合物种类分别为第1轮次酒与第3轮次酒各25种、第4轮次酒与第7轮次酒各26种。在第1～7轮次酒中共定性出18种共有挥发性含氮化合物,包括9种吡嗪类(吡嗪、2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-乙酰基-3-乙基吡嗪)、2种含氮酯类(氨基甲酸乙酯、烟酸乙酯)、2种噻唑类(2-乙酰基噻唑、苯并噻唑)、2种吡咯类(2-乙酰基吡咯、t1为第一维柱保留时间,t1L为自建谱库中标准品第一维柱保留时间,t2为第二维柱保留时间,t2L为自建谱库中标准品第二维柱保留时间;a.气味描述来自www.thegoodscentscompany.com;b.气味描述来自参考文献[19];c.气味描述来自参考文献[20];d.气味描述来自参考文献[21];e.气味描述来自参考文献[22]; f.气味描述来自参考文献[23];—表示未查询到有气味描述。

1-乙基吡咯-2-甲醛)、2种吡啶类(2-乙酰吡啶、3-苯基吡啶)、1种其他类含氮化合物(己内酰胺),其中9种吡嗪类化合物、2-乙酰基噻唑、2-乙酰基吡咯和2-乙酰吡啶等12种挥发性含氮化合物均呈现焙烤香、烤玉米香,很可能与酱香型白酒中的烘焙香、焦香存在直接联系。此外,2-乙氧基噻唑、N-甲基吡咯烷酮仅在第1轮次酒中被检出,邻氨基苯甲酸乙酯仅在第5轮次酒中被检出,2,3-二乙基吡嗪、邻甲氨基苯甲酸甲酯仅在第6轮次酒中被检出。基于以上研究,在轮次酒中挥发性含氮化合物种类基本相似的前提下,推测其香气存在差异的原因可能与挥发性含氮化合物的质量浓度不同、阈值差异以及化合物之间的相互作用等因素有关。

2.2 酱香型白酒轮次酒中挥发性含氮化合物的定量分析

为了表征轮次酒之间挥发性含氮化合物的差异,对定性出的37种挥发性含氮化合物均进行定量计算,定量结果见附录附表1,挥发性含氮化合物总量及轮次变化见图1。

由图1(a)可知,轮次酒的挥发性含氮化合物总质量浓度之间存在差异。总质量浓度在第1～5轮次酒中随轮次增加而逐渐升高,在第6轮次酒有所下降,第7轮次酒略微升高。其中第5、6、7轮次酒的质量浓度较高,分别为(13 487.56±487.12) μg/L、(10 197.31±1 009.04) μg/L、(10 652.84±1 025.33) μg/L,其次是第3轮次酒[(6 013.91±102.47) μg/L]和第4轮次酒[(8 050.49±520.25) μg/L],二者质量浓度差距不大。第2轮次酒质量浓度为(3 042.28±301.9) μg/L,第1轮次酒质量浓度为(1 904.52±244.21) μg/L,属轮次酒中最低。

由图1(b)可知,第5轮次酒的吡嗪类化合物质量浓度最高,为(12 785.1±449.25) μg/L,其次高的是第7轮次酒[(9 879.67±978.13) μg/L]和第6轮次酒[(8 898.92±974.63) μg/L],第1轮次酒的质量浓度最低,仅为(1 361.85±217.46) μg/L。挥发性含氮化合物总质量浓度分布变化规律与吡嗪类化合物质量浓度变化相似,该研究规律与吴李玲等[8]对不同产地酱香型白酒中挥发性含氮化合物研究所得结论保持一致。吡嗪类化合物作为酱香型白酒的特征风味物质,其质量浓度的高低与第5、6、7轮次酒中突出的烘烤香和焦香密切相关。

吡嗪类化合物主要由耐高温的芽孢杆菌类微生物发酵代谢合成,多呈焦煳香、焙烤香,轮次酒中吡嗪类化合物的质量浓度差异对不同风味的形成具有重要影响。在酱香型白酒的生产进程中,酿造环境状况、理化指标水平以及微生物群落的动态变化[24]等因素,对于吡嗪类风味物质在质量浓度方面的改变具有关键作用。第1、2轮次酒的发酵期通常为12月至次年1月,此时期外界环境温度较低,微生物的生长、繁殖以及代谢活动相对迟缓。加之刚刚完成下沙及糙沙阶段的原料投放,酒醅内淀粉质量浓度处于较高水平[25],微生物对原料的利用效率不高,使得经由微生物发酵代谢所合成的吡嗪类化合物等风味物质,无论是在质量浓度方面还是种类方面均较为有限,但在此过程中会积累大量乙偶姻,而乙偶姻作为吡嗪类物质的前体物质,对于养护醩醅以及去除粮食中生沙味道能够发挥作用[26-27]。第3、4、5轮次酒的生产时间大致在2月至5月,在这一阶段,伴随着各类微生物对生产原料利用效率的提升,酒醅中淀粉的转化速度加快,微生物的生长速率增快,代谢合成活动逐渐趋于旺盛。同时,美拉德反应变得更加剧烈,推动了吡嗪类风味化合物的形成,并促使其质量浓度不断升高[28]。故轮次酒中吡嗪类化合物质量浓度通常从第3轮次酒开始激增,随着酿造轮次的增加,轮次酒中吡嗪类化合物总质量浓度会有所波动。

以2,3,5,6-四甲基吡嗪为例,其质量浓度从第3轮次酒开始迅速提升,并于第5轮次酒达到最高值,在第6轮次酒有所回落,于第7轮次酒再次回升。其中第7轮次酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪质量浓度再次回升,可能是由于发酵后期堆积培菌过程更加充分,各项反应加剧所致。其规律变化符合以上研究发现,但与刘家欢等[5]对不同轮次酱香型白酒中吡嗪类化合物含量分析的研究结论有所偏差,这可能是酒样差异或不同酒厂在不同轮次运用的微生物筛选和应用技术不同所导致。

2,3,5,6-四甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪在吡嗪类化合物总质量浓度中占比最高。酱香型白酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪的可能生成路径见图2。在白酒发酵体系中,微生物首先对糖进行降解,产生丙酮酸,两分子的丙酮酸缩合,生成α-乙酰乳酸,α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻。发酵体系内的乙偶姻与氨发生非酶促反应,得到2,3,5,6-四甲基吡嗪[29]。2,3,5,6-四甲基吡嗪的质量浓度在第5轮次酒[(10 861.11±372.83) μg/L]和第7轮次酒[(7 846.61±916.20) μg/L]较高,其次为第6轮次酒[(6 982.51±879.97) μg/L]和第4轮次酒[(6 439.04±431.29) μg/L],在第1轮次酒[(1 044.52±190.15) μg/L]的质量浓度最低。酱香型白酒中2,3,5-三甲基吡嗪的可能生成路径见图3。醛糖或酮糖的羰基与氨基酸的氨基发生美拉德反应[30],生成2,3,5-三甲基吡嗪。2,3,5-三甲基吡嗪的质量浓度在第5轮次酒[(1 179.78±39.21) μg/L]和第7轮次酒[(983.21±20.04) μg/L]较高,其次高的是第6轮次酒[(691.19±36.91) μg/L]和第4轮次酒[(574.6±19.92) μg/L],最低的是第1轮次酒,质量浓度仅为(111.25±6.78) μg/L。2,3,5,6-四甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪质量浓度变化趋势保持一致。2,3,5,6-四甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪的高质量浓度与轮次酒的典型风味特征密切相关,尤其是在第5、6、7轮次酒中,其高质量浓度可能是酒体中烘烤香和焦香的主要来源。

部分吡嗪类化合物质量浓度在前期便随酿造轮次增加而逐步上升,其中2,6-二甲基吡嗪质量浓度由(20.56±3.34) μg/L逐步上升至(277.80±2.99) μg/L,2-乙基吡嗪质量浓度由(9.57±2.58) μg/L逐步上升至(167.78±3.85) μg/L,2-甲基吡嗪质量浓度由(86.96±2.73) μg/L逐步上升至(368.51±9.70) μg/L,在第7轮次酒[(310.30±17.84) μg/L]稍有回落。这些吡嗪类化合物质量浓度的逐步升高反映了发酵过程中微生物代谢活动的持续增强,尤其是在中后期轮次中,其质量浓度的显著增加进一步丰富了酒体的风味层次。

吡嗪质量浓度范围为(4.57±0.14) μg/L到(19.01±1.71) μg/L,2-乙基-3,5-二甲基吡嗪质量浓度范围为(6.12±1.29) μg/L到(50.78±3.08) μg/L,以上2种化合物质量浓度均在酿造后期(第5轮次酒)随酿造轮次增加而逐步上升至最高浓度。2-乙酰基-3-乙基吡嗪质量浓度在吡嗪类化合物中占比最低,质量浓度范围为(0.10±0.01) μg/L到(2.68±0.08) μg/L,除首尾轮次酒外,该化合物质量浓度从第2轮次酒起随酿造轮次增加而逐步上升。尽管以上吡嗪类化合物的质量浓度较低,但在酱香型白酒风味中的贡献不容忽视,尤其是在后期轮次酒中,其可能对酒体的复杂香气起到补充作用。

2,3-二乙基-5-甲基吡嗪质量浓度范围为(37.12±2.66) μg/L到(496.39±10.87) μg/L,无明显分布规律。但在第3轮次酒中,该化合物质量浓度显著高于其余各轮次,可能是由于第3轮次酒的制曲、高温堆积、蒸馏等阶段,酒醅温度较高,美拉德反应更活跃,从而促进了2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的形成。这一现象进一步表明,美拉德反应在酱香型白酒风味形成中的关键作用,尤其是在高温条件下,其反应产物对酒体风味的贡献显著。

由图1(c)可知,噻唑类质量浓度仅次于吡嗪类,质量浓度为(187.19±0.44)～(556.52±12.26) μg/L,其中,2-乙酰基噻唑占比最高[(184.61±0.32) μg/L到(553.7±12.06) μg/L],达99%以上,而苯并噻唑最高质量浓度仅为(3.12±0.11) μg/L。噻唑类质量浓度在第1、2轮次酒较低,分别为(275.51±14.6)、(184.61±0.32) μg/L。2-乙酰基噻唑作为噻唑类化合物的主要成分,其高质量浓度可能对酱香型白酒的坚果香、稻谷香和爆米花香特征具有重要贡献,尤其是在第6轮次酒中,其质量浓度的显著增加进一步丰富了酒体的风味复杂性。

由图1(d)可知,含氮酯类化合物质量浓度为(66.33±2.91)～(194.75±8.20) μg/L。在含氮酯类化合物中,第1轮次酒质量浓度明显高于其余各轮次,这是因为第1轮次酒中烟酸乙酯质量浓度[(105.4±2.76) μg/L]较高,烟酸乙酯的高浓度可能是第1轮次酒中果香及酸香的重要来源。值得注意的是,氨基甲酸乙酯在各轮次酒中最高质量浓度仅为(89.35±5.44) μg/L,远低于加拿大、捷克和巴西等针对蒸馏酒中氨基甲酸乙酯制订的限量标准150 μg/L[31]。

由图1(e)可知,第6轮次酒中吡咯类质量浓度显著高于其余各轮次。吡咯类化合物的质量浓度范围为(33.41±5.73) μg/L到(479.77±12.95) μg/L。吡咯类化合物中,1-乙基吡咯-2-甲醛与2-乙酰基吡咯质量浓度呈现相同变化规律,均从第1轮次酒到第3轮次酒逐步降低,再从第4轮次酒逐步上升到最高质量浓度,其中1-乙基吡咯-2-甲醛最高质量浓度为(34.78±1.17) μg/L,2-乙酰基吡咯最高质量浓度为(259.25±5.68) μg/L,在第7轮次酒时质量浓度下降到最高质量浓度的一半以下。第6轮次酒中吡咯类化合物的高质量浓度可能与其风味特征密切相关,特别是2-乙酰基吡咯所呈现的烤可可香,可能显著提升酒体风味的复杂性和层次感。

由图1(f)可知,吡啶类化合物质量浓度为(6.94±0.18)～(40.23±1.95) μg/L,其中2-乙酰吡啶质量浓度为(0.62±0.02)～(35.40±1.82) μg/L,3-苯基吡啶质量浓度为(0.53±0.02)～(4.73±0.09) μg/L,3-甲基吡啶质量浓度为(0.10±0.04)～(4.98±0.13) μg/L。

2.3 酱香型白酒轮次酒中含氮化合物的正交偏最小二乘判别分析

采用有监督的OPLS-DA法建立了轮次酒的分类判别模型,以各酒样中挥发性含氮化合物定量结果作为x变量,以样品类别为y变量,进行OPLS-DA分析,得到该模型的预测能力参数Q2为0.937,对y矩阵的解释率R2y为0.976,见图4。Q2 ≥0.5,则表示模型未过拟合,预测能力较好。由图4可知,OPLS-DA模型直观地展示了第1～7轮次酒的分布特点。从整体来看,除第3、4、5轮次酒组分较为相似外,其余各轮次酒均可被显著区分。

造成第1～7轮次酒中挥发性含氮化合物各有异同的原因可能有4点。1)酒醅温度区别。不同轮次的酒醅温度对各阶段微生物生长速度影响较大[32],随着轮次的增加,温度逐渐升高,从第3轮次酒开始代谢合成旺盛,美拉德反应剧烈,促进吡嗪类风味化合物的形成与质量浓度的增加。反之,由于第1、2轮次酒醅温度较低,堆积酒醅容易出现“来温慢、冷心、达不到顶温”等发酵异常现象[33],微生物生长繁殖所需的养分受限,吡嗪类化合物的质量浓度远低于其余各轮次酒。2)轮次积累效应。酱香型白酒的酿造过程中,不同轮次酒的发酵和蒸馏都会经历多次的积累效应。例如,第1轮次酒与第7轮次酒的质量浓度差异,不仅是由于单次酿造过程中化合物的变化,还受到时间因素的影响。随着酿造轮次的增加,轮次酒中某些挥发性含氮化合物会逐步积累或发生转化,导致其质量浓度逐步变化。因此,不同轮次酒的质量浓度差异可能是长期积累的结果。3)酒曲影响。虽然酒曲种类在酿造过程中通常不变,但其所含微生物群落和酶(如蛋白酶、淀粉酶、脱羧酶等)可能在不同轮次酒中表现出不同的活性,从而间接调控挥发性含氮化合物的合成。4)人为操作影响。酿造过程中的人为操作(如温度调控、搅拌频率、取样方式等)可能对发酵条件的稳定性产生影响,进而影响挥发性含氮化合物的生成。

图5为第1～7轮次酒中挥发性含氮化合物的VIP值分析。筛选到对于模型分类起到重要作用的特征变量有13种:2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、氨基甲酸乙酯、己内酰胺、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪和烟酸乙酯。这13种挥发性含氮化合物可作为区分第1～7轮次酒的差异成分。

2.4 酱香型白酒轮次酒中挥发性含氮化合物的OAV分析

OAV指化合物浓度与该化合物的香气阈值浓度之比,表示该化合物对香气的贡献度。根据轮次酒定量结果,结合现有文献已报道的挥发性含氮化合物嗅觉阈值,计算了13种化合物的OAV值,其中吡嗪类占10种,见表3。其中,2-乙基-6-甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪在第5～7轮次酒中OAV>1,2-乙基-3,5-二甲基吡嗪与2,3-二乙基-5-甲基吡嗪在第1～7轮次酒中OAV>1,其余9种化合物OAV值均<1。

2-乙基-6-甲基吡嗪在体积分数为46% vol的乙醇水溶液中被检测为烤马铃薯香、烤榛子香,阈值仅为40 μg/L,该化合物在第1、2轮次酒中均未检出,而在第3轮次酒和第4轮次酒中因浓度最高仅为(31.6±1.41) μg/L,故OAV值均<1。在第5、6、7轮次酒中OAV值分别是2.36～2.52、5.63～5.81、2.53～2.77。表明该化合物对酿造后期轮次酒中所产生的焦煳香味可能具有重要贡献。

2,3,5-三甲基吡嗪在体积分数为46% vol的乙醇水溶液中阈值为729.86 μg/L,具有烤肉、土豆、巧克力味。该化合物在各轮次酒中均检出,但除第5、6、7轮次酒外,其余轮次OAV值均<1。第5、6、7轮次酒中OAV值范围分别为1.56～1.67、0.88～1.01、1.32～1.37。该化合物已被证实与浓香型白酒的焙烤香呈现正向相关作用[38]。

2-乙基-3,5-二甲基吡嗪嗅觉阈值仅为7.5 μg/L,呈现烤土豆香气,其在所有轮次酒中均检出且OAV值均>1,酿造后期轮次酒OAV值明显高于前期。第4～7轮次酒OAV值分别是2.99～3.28、5.68～6.03、5.86～6.41、6.36～7.18。其中第7轮次酒OAV值分别是第1轮次酒OAV值的7.11～11.58倍、第2轮次酒OAV值的2.39～3.24倍、第3轮次酒OAV值的4.52～4.66倍,可见2-乙基-3,5-二甲基吡嗪对各轮次酒的烘烤香均具有重要贡献。

2,3-二乙基-5-甲基吡嗪嗅觉阈值为18 μg/L,呈现咖啡香、炒花生香,其在所有轮次酒中检出且OAV值均>1。第3轮次酒OAV值(26.97～28.18)显著高于其余各轮次,分别是第1轮次酒的7.01～8.59倍、第2轮次酒的12.75～14.75倍、第4轮次酒的11.23～12.93倍、第5轮次酒的4.53～6.36倍、第6轮次酒的3.50～4.00倍、第7轮次酒的7.44～8.67倍。

值得注意的是,2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪虽在各轮次酒中质量浓度较高,但因阈值均远高于其质量浓度,故OAV值均<1。2,3,5,6-四甲基吡嗪虽是轮次酒中质量浓度最高的吡嗪类化合物,但其嗅觉阈值在体积分数为46% vol的乙醇水溶液中高达80 073.16 μg/L,故通常难以在酒体中被感知。2-甲基吡嗪是红砂糖饮料中的关键芳香化合物[39],其阈值在体积分数为46% vol的乙醇水溶液中高达121 927.01 μg/L,该化合物在各轮次酒中质量浓度远低于其阈值。在芝麻香型白酒中,2,6-二甲基吡嗪[(20.56±3.34)～(277.80±2.99) μg/L]对其烘烤香气具有重要贡献[40],该化合物在体积分数为46% vol的乙醇水溶液中阈值为790.79 μg/L,是其在各轮次酒中质量浓度的2.88～45.92倍。

为了能够进一步筛选出轮次酒中具有特征风味贡献的挥发性含氮化合物,将具有统计学意义的13种VIP>1的重要差异成分和4种OAV>1的风味贡献成分进行对比,绘制堆叠韦恩(Venn)图,见图6。

由图6可知,4种OAV>1的挥发性含氮化合物在各轮次酒中均具有风味贡献和统计学意义。按照其风味贡献由大到小依次为2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪,这些挥发性含氮化合物可作为轮次酒风味特征变化的关键化合物。具有统计学意义但OAV<1的成分有9种,以吡嗪类为主。

3 结 论

研究采用LLE前处理方法结合GC×GC-NCD联用检测技术,对酱香型白酒第1～7轮次酒进行定性、定量分析,共鉴定出37种挥发性含氮化合物。第1～7轮次酒中分别鉴定出25、22、25、26、31、33和26种挥发性含氮化合物,其中含共有挥发性含氮化合物18种。包括9种吡嗪类、2种含氮酯类、2种噻唑类、2种吡咯类、2种吡啶类和1种其他类,其中9种吡嗪类化合物、2-乙酰基噻唑、2-乙酰基吡咯、2-乙酰吡啶等12种挥发性含氮化合物均呈现焙烤香、烤玉米香,很可能与酱香型白酒中的烘焙香、焦香存在直接联系。对37种挥发性含氮化合物进行定量分析,结果表明,各类挥发性含氮化合物质量浓度从高到低依次为:吡嗪类、噻唑类、含氮酯类、吡咯类、吡啶类。第1～7轮次酒中,吡嗪类化合物在第5、6、7轮次酒中质量浓度较高,为(8 898.92±974.63)～(12 785.1±449.25) μg/L,第1轮次酒的质量浓度最低,仅为(1 361.85±217.46) μg/L。根据定量结果,采用有监督的OPLS-DA法对37种挥发性含氮化合物质量浓度进行分析,结果表明:除第3、4、5轮次酒组分成分较为相似外,其余各轮次酒均可被显著区分。同时,筛选出13种VIP值大于1的挥发性含氮化合物,可作为潜在区分轮次酒的差异性成分。在计算的13种化合物OAV值中,其中2-乙基-6-甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪在第5～7轮次酒中OAV>1,2-乙基-3,5-二甲基吡嗪与2,3-二乙基-5-甲基吡嗪在第1～7轮次酒中OAV>1。根据对比结果,以上4种挥发性含氮化合物在轮次酒中均具有风味贡献和统计学意义,可能是酒体烘焙香和焦香的主要来源。

尽管研究通过明确关键风味物质、量化风味贡献为酱香型白酒的风味品质精准调控与优化提供了新的理论依据,但仍存在样本来源单一、风味贡献的量化不足、生成机制研究有限等局限性,在未来研究中可通过扩大样本范围、结合感官评价进一步量化挥发性含氮化合物对酒体风味的实际贡献、结合代谢组学和微生物组学技术深入探讨挥发性含氮化合物生成机制等方面弥补这一研究的不足。

附录:补充数据

与本文相关的补充数据可以在http:∥dx.doi.org/10.12301/spxb202500023在线版本中找到。

Appendix：supplementary data

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Difference Analysis of Volatile Nitrogen-Containing Compounds in Different Rounds of Base Distillates of Soy Sauce Aroma Type Baijiu

DU Yachun, WU Liling, GENG Xiaojie, CHEN Erbao, ZHENG Fuping*, LI Hehe, SUN Jinyuan, SUN Baoguo

(Key Laboratory of Brewing Molecular Engineering of China Light Industry/Beijing Laboratory of Food Quality and Safety/Key Laboratory of Alcoholic Quality and Safety of China Light Industry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048,China)

Abstract：Volatile nitrogen-containing compounds account for a small proportion in soy sauce aroma type Baijiu, but they have the characteristics of strong aroma and low odor threshold, which have an important impact on the flavor of the Baijiu. In this study, the 1st～7th rounds of distillates of soy sauce aroma type Baijiu were selected as the research targets. The liquid-liquid extraction method combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detector technology was employed to conduct both qualitative and quantitative analyses of volatile nitrogen-containing compounds. A total of 37 kinds of volatile nitrogen-containing compounds were successfully identified, including 16 pyrazine compounds, 4 pyrrole compounds, 4 nitrogen-containing ester compounds, 3 thiazole compounds, 3 pyridine compounds, and 7 other compounds. The quantitative analysis results indicated that the mass concentrations ranked from high to low were pyrazines, thiazoles, nitrogen-containing esters, pyrroles, and pyridines. Based on these quantitative findings, orthogonal partial least-squares discriminant analysis was implemented to screen out 13 volatile nitrogen-containing compounds with variable projection values exceeding 1. The results further revealed that the compositions of the base distillates from the 3rd, 4th, and 5th rounds were relatively analogous and could be distinctly differentiated from those of the other rounds. By integrating the odor activity value (OAV) method, the OAVs of the 13 compounds were calculated. Notably, the OAVs of 2-ethyl-6-methylpyrazine and 2,3,5-trimethylpyrazine were greater than 1 in the 5th to 7th rounds, while the OAVs of 2-ethyl-3,5-dimethylpyrazine and 2,3-diethyl-5-methylpyrazine were greater than 1 across the 1st to 7th rounds. These four volatile nitrogen-containing compounds exhibited flavor contributions with statistical significance in different distillation rounds. The research aimed to elucidate the contribution of volatile nitrogen-containing compounds to the flavor of base Baijiu across different distillation rounds, addressing the research gap on thiazoles, pyrroles, and pyridines. By identifying key flavor compounds and quantifying their contributions, this study provided a theoretical foundation for the precise regulation and optimization of flavor quality in soy sauce aroma type Baijiu.

Keywords：soy sauce aroma type Baijiu; different rounds of base distillates; volatile nitrogen-containing compounds; odor activity value; comprehensive two-dimensional gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detector

中图分类号：TS261.7

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202500023

文章编号：2095-6002(2025)06-0053-15

引用格式：杜雅纯, 吴李玲, 耿晓杰, 等. 酱香型白酒轮次酒中挥发性含氮化合物差异分析[J]. 食品科学技术学报,2025,43(6):53-67. DU Yachun, WU Liling, GENG Xiaojie, et al. Difference analysis of volatile nitrogen-containing compounds in different rounds of base distillates of soy sauce aroma type Baijiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(6):53-67.

收稿日期：2025-01-12

基金项目：中国科协青年人才托举工程项目(2022QNRC001)。

Foundation: Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST(2022QNRC001).

第一作者：杜雅纯,女,硕士研究生,研究方向为白酒化学。

*通信作者：郑福平,男,教授,博士,博士生导师,主要从事传统酿造食品风味与品质方面的研究。

(责任编辑：李 宁)