红松(Pinus koraiensis)是东北林区种植最广泛的树种[1]。红松仁作为红松的种子,其富含蛋白质、维生素及多种生物活性物质等[2-3],具有较高的营养价值。松仁粕是松仁的榨油副产品,长期以来被用作动物饲料或有机肥料,附加值低,但其主要营养成分蛋白质含量很高(30%～42%),是开发新型植物蛋白产品的良好来源[4-5]。松仁蛋白(pine kernel protein,PKP)由18种氨基酸组成,其中25%为必需氨基酸,具有致敏性低、降血脂、抗衰老、抗氧化等优点[6]。但PKP形成的乳液稳定性较差,易出现絮凝、分层等不良现象[7],因此PKP在食品工业中的应用(如乳化剂)受到限制,需要对其进行适当的改性。物理改性对能源的利用率较低[8],酶法改性中酶的特异选择性限制了理想产物的形成[9],一部分的化学改性易诱发安全和环境污染问题[10],故通过添加外源物质多糖,使多糖与蛋白质发生美拉德反应,是改善蛋白质乳化性和其他功能性质的天然、无毒和简便的方法。多糖由于其多羟基结构而具有很好的持水性和增稠性,常被添加到乳液的水相中以提升稳定性[11]。目前,关于离子型多糖与蛋白质共价结合的研究已有文献报道,例如阿拉伯胶与豌豆蛋白和乳清蛋白的结合[12]、3种不同多糖与大豆分离蛋白的结合[13],但关于中性多糖与蛋白质共价复合的研究较有限。

刺槐豆胶(locust bean gum,LBG)是由甘露糖和半乳糖单元组成的中性多糖,80 ℃条件下可达到最大溶解性和黏度。LBG可用于烘焙食品[14]、冰淇淋、酸奶等产品中[15],其衍生物已被证明可改善人体健康并抑制慢性疾病[16]。研究发现,LBG和乳清蛋白在pH值为7.0的条件下相互作用使凝胶强度增强[17],采用交联法制备的LBG与牛血清白蛋白纳米微球具有一定的缓释能力[18-19]。然而,截至目前,针对PKP与LBG之间相互作用的研究鲜有报道。与离子型多糖不同,作为中性多糖,LBG因其pH不敏感性及热稳定性,是与PKP构建共价复合物的理想多糖。多糖、蛋白质及其复合物通常可作为Pickering乳液稳定剂颗粒,它们不可逆地吸附在乳液的油水界面并产生屏障,可以防止液滴聚结,由这些颗粒稳定的乳液比常规表面活性剂稳定的乳液具有更高的环境耐受性和稳定性[20]。乳液类型和特性很大程度上取决于乳液的乳化剂和油相体积分数[21]。目前关于LBG的研究主要集中于薄膜或水凝胶的制备,而关于其与蛋白质复合后作为植物来源乳化剂应用于Pickering乳液的研究仍较为有限。

本研究拟通过制备PKP-LBG共价复合物,研究其结构特征和功能特性,进而制备O/W型Pickering乳液,探讨不同油相体积分数对Pickering乳液特性和稳定性的影响,希望得到性质较好的共价复合物稳定Pickering乳液,拓宽松仁蛋白稳定乳液个性化产品的应用,旨在为拓展松仁蛋白在食品加工中的应用范围及开发其新型产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

松仁粕由黑龙江省林科院提供;LBG(纯度≥99%)、四硼酸钠、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠(SDS)、邻苯二甲醛、8-苯胺基-1-萘磺酸钠(ANS)、尼罗蓝、尼罗红、5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB),上海源叶生物科技有限公司;氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠,天津致远化学试剂有限公司;石油醚、甲醇,北京索莱宝生物科技有限公司;透析袋(截留分子质量3 kDa)、牛血清白蛋白,北京博奥拓达科技有限公司。实验所用试剂均为国产分析纯。大豆油,购自九三粮油工业集团有限公司。

1.2 仪器与设备

TDL-40B-W型高速离心机,上海恒勤仪器设备有限公司;FD-1A-50型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;NicoletiN10型傅里叶红外光谱仪,美国赛默飞公司;F-7000型荧光分光光度计,北京日立科学仪器有限公司;FA25型高剪切分散乳化机,上海欧河机械设备有限公司;Haake Mars 40型流变仪,美国赛默飞公司;90 Plus型纳米粒径电位仪,马尔文博纳科技有限公司;BA210-T型光学显微镜,麦克奥迪工业集团有限公司;LSM800型激光共聚焦显微镜,北京创诚致佳科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 松仁蛋白提取

松仁粕粉碎,过60目筛,采用索氏抽提法,以石油醚为溶剂进行脱脂,4 ℃储存。用蒸馏水将脱脂松仁粕溶解成0.1 g/mL的松仁粕溶液。用1 mol/L NaOH调pH值至9.0,室温磁力搅拌1 h,4 000 r/min离心15 min,收集上清液。用1 mol/L HCl调上清液pH值至4.6,磁力搅拌1 h,4 000 r/min离心15 min,收集沉淀。将沉淀蛋白质pH值调至7.0,冷冻干燥后储存备用。

1.3.2 共价复合物及物理混合物的制备

配制PKP和LBG质量比为1.0∶1.0、1.0∶0.5、1.0∶0.1的水溶液,磁力搅拌1 h后过夜水合。将溶液pH值调至11.0,磁力搅拌1 h后得到物理混合物,分别命名为P-L-1.0、P-L-0.5、P-L-0.1。将物理混合物与PKP在95 ℃下水浴130 min,随后在冰水浴中快速冷却,得到共价复合物和对照组,分别命名为M-P-L-1.0、M-P-L-0.5、M-P-L-0.1、H-PKP(PKP经美拉德反应条件处理的对照组)。将共价复合物和物理混合物以4 000 r/min离心20 min,收集上清液,3 kDa透析袋透析24 h,冷冻干燥后储存备用。

1.3.3 共价复合物接枝度测定

采用OPA法[22]测定共价复合物的接枝度,用新鲜制备的上清液进行实验。OPA试剂的配制:将80 mg邻苯二甲醛在2 mL甲醇溶液中搅拌;将50 mL 0.1 mol/L的四硼酸钠溶液、5 mL 200 mg/mL的SDS溶液、200 μL的β-巯基乙醇充分混匀后加入先前已搅拌均匀的甲醇中,定容至100 mL棕色瓶中。样品测定时,将200 μL样品溶液加入4 mL OPA试剂中,35 ℃水浴2 min,测定340 nm处吸光值,用去离子水作空白对照组。接枝度的计算方法见式(1)。

接枝度

(1)

式(1)中,A0为反应前溶液吸光度,At为取样样品溶液吸光度。

1.3.4 共价复合物的褐变程度测定

用新鲜制备的上清液进行实验,样品用1 mg/mL的SDS溶液稀释5倍,在420 nm处测定吸光度,空白样品为含SDS的蒸馏水。

1.3.5 共价复合物和物理混合物的色度测定

用色差计对样品进行色度分析。使用标准白板校准色差计,测量样品的a*值(红色值)、b*值(黄色值)、L*值(亮度值)。

1.3.6 共价复合物和物理混合物的结构性质表征

1.3.6.1 红外光谱检测

红外光谱分析条件:温度为25 ℃,扫描范围为 400～4 000 cm-1,扫描次数为64次,扫描速率为4 cm-1。 选择光谱中1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ带进行分析。

1.3.6.2 内源荧光光谱检测

将样品分散于浓度为0.01 mol/L的PBS缓冲液中(pH值为7.0),稀释至0.2 mg/mL,使用荧光分光光度计在280 nm的激发波长下获得295～500 nm波长的荧光光谱。狭缝宽度为5 nm,在pH值为7.0时收集荧光光谱。

1.3.6.3 粒径、Zeta-电位测定

将样品溶于浓度为0.01 mol/L PBS缓冲液中(pH值为7.0),稀释至0.1 mg/mL,4 ℃中保存过夜以确保完全溶解。使用电位/粒度仪测量样品平均粒径和Zeta-电位值。

1.3.6.4 表面疏水性测定

用ANS作为荧光探针测定样品的表面疏水性[23]。用去离子水将样品质量浓度调整为0.025、0.050、0.100、0.200 mg/mL。将10 mL样品溶液与600 μL 8 mmol/L ANS溶液混合并在黑暗中保持15 min。 激发波长为390 nm,发射波长为405 nm,激发和发射狭缝宽度为5 nm,记录荧光强度。

1.3.6.5 游离巯基含量测定

根据Jiang等[24]方法并稍加修改,将样品(2 mg/mL,1 mL)与Tris-甘氨酸缓冲液(1 mL,含有0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸和0.04 mol/L乙二胺四乙酸二钠,用6 mol/L HCl溶液将pH值调至8.0)混合,加入20 μL DNTB溶液(以4 mg/mL的Tris-甘氨酸缓冲液作为溶剂),5 ℃反应1 h,3 500 r/min离心30 min,取上清液于412 nm处测定吸光度。游离巯基含量的计算方法见式(2)。

游离巯基含量

(2)

式(2)中:游离巯基含量,μmol/L;73.53=106/(1.36×104),1.36×104为摩尔消光系数;A为吸光度;D为稀释倍数;C为样品质量浓度,mg/mL。

1.3.7 共价复合物和物理混合物的功能特性测定

1.3.7.1 相对溶解度测定

将新鲜制备的上清液(0.1 mL)与考马斯亮蓝试剂(5 mL)于25 ℃条件下反应2 min,测定595 nm处吸光度。将结果带入牛血清白蛋白(BSA)标准曲线(0～10 mg/mL),蛋白质溶解度的计算方法见式(3)。

溶解度

(3)

式(3)中:C0为上清液中的蛋白质质量浓度,mg/mL;C1为初始溶液中的蛋白质质量浓度,mg/mL。

1.3.7.2 乳化活性及乳化稳定性测定

根据Kan等[25]方法并稍加修改。将0.1 g样品分散于0.01 mol/L PBS缓冲液中(pH值为7.0)。将样品溶液与大豆油按体积比为1∶1混合,采用高剪切分散乳化机16 000 r/min均质3 min。30 s停顿一次,从底部迅速吸取50 μL乳液,溶于5 mL质量浓度为1 mg/mL的SDS溶液中。用SDS溶液作空白对照,于500 nm处记录其吸光度,10 min后再次测定吸光度。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)的计算方法见式(4)和式(5)。

式(4)和(5)中:EAI,m2/g;ESI,min;稀释倍数为100;C为蛋白质的质量浓度,g/mL;φ为油相体积分数,%;A0为立即测得的吸光度;A10为10 min后测得的吸光度。

1.3.8 O/W型Pickering乳液的制备

将复合物M-P-L-0.5溶于0.01 mol/L PBS缓冲液(pH值为7.0)中,得到质量浓度为20 mg/mL的水相,与大豆油混合,制备不同油相体积分数(10%～80%)的Pickering乳液,用PKP作空白对照组。采用高剪切分散乳化机将样品以16 000 r/min均质3 min,30 s停顿一次,将叠氮化钠(0.2 mg/mL)加入新制备的乳液中,4 ℃储存供进一步分析。

1.3.9 乳液特性测定

1.3.9.1 乳层析指数测定

室温条件下将制备好的乳液样品静置14 d,分别在第0、3、7、14 d的同一刻记录乳液在玻璃瓶中界面刻度。乳层析指数(CI)的计算方法见式(6)。

式(6)中:Hc为清液高度,cm;He为乳液总高度,cm。

1.3.9.2 粒径、Zeta-电位测定

将样品乳液于0.01 mol/L PBS缓冲液中(pH值为7.0)稀释100倍,测定方法同1.3.6.3。

1.3.9.3 激光共聚焦显微镜观察

根据Zhang等[26]方法并稍加修改。制备尼罗红染料(1 mg/mL乙醇)和尼罗蓝染料(1 mg/mL乙醇),并在使用前避光保存在4 ℃。将1 mL乳液样品加入20 μL尼罗红和20 μL尼罗蓝溶液并充分混合。将0.02 mL染色样品置于荧光测量板的中心,在激光共聚焦扫描显微镜下观察样品微观形貌。

1.3.9.4 流变学特性测定

采用模块化旋转流变仪测量乳液的表观黏度、储能模量(G′)和损耗模量(G″)。将乳液放在直径35 mm的平板平衡5 min,温度25 ℃。乳液黏度在稳定剪切模式下测量,剪切速率从1～100 s-1,在1～100 Pa的应变范围内,以1 Hz的角频率对乳液进行振幅扫描。设置应变程度为0.5%,扫描频率为 0.1～10.0 Hz,温度为25 ℃。

1.3.9.5 光学显微镜观察

参考Xu等[27]的方法并稍加修改。吸取10 μL乳液置于载玻片上,轻盖载玻片避免产生气泡,在400倍放大倍率(物镜40×,目镜10×)观察并拍摄乳液液滴形态。

1.3.10 乳液稳定性测定

1.3.10.1 储存稳定性测定

将乳液25 ℃静置14 d,分别在第0、1、3、7、14天的同一时刻测量乳液的乳层析指数、外观状态、微观结构和平均粒径。

1.3.10.2 离心稳定性测定

将乳液稀释100倍,测定490 nm波长下的吸光度(A1);4 000 r/min离心15 min后将上清液稀释100倍,490 nm波长下测定吸光度(A0),记录乳液外观状态。离心式稳定常数(K)的计算方法见式(7)。

式(7)中,A1为离心前的吸光度,A0为离心后的吸光度。

1.3.10.3 酸碱稳定性测定

将乳液pH值调至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0,低速涡旋振荡混合10 s,25 ℃静置24 h,记录乳液的外观状态和平均粒径。

1.3.10.4 离子稳定性测定

将200 μL不同浓度的NaCl溶液(50、100、200、400 mmol/L)添加到乳液中,低速涡旋振荡混合10 s, 25 ℃静置24 h,记录乳液的外观状态和平均粒径。

1.3.10.5 温度稳定性测定

将乳液在不同温度(-20、4、25、60 ℃)下静置24 h,记录乳液的外观状态和平均粒径。

1.4 数据处理

所有实验过程中样品均重复测定3次,数据以平均值±标准差(SD)表示。所有统计分析均采用SPSS Statistics 27和Origin Pro 2024软件处理。

2 结果与分析

2.1 共价复合物的理化性质分析

接枝度和褐变程度是美拉德反应程度的关键指标。共价复合物的接枝度、褐变程度及共价复合物和物理混合物的外观状态见图1。由图1(a)可知,随着LBG添加量的增加,共价复合物的接枝度升高,M-P-L-0.5的接枝度最高,为(55.18±0.83)%。研究结果说明,M-P-L-0.5容易与更多的氨基酸残基结合。随着接枝度的升高,大量的糖分子接枝到PKP上,促进交联的形成,增强了蛋白质分子之间的连接。共价复合物接枝度的增加也可能在蛋白质分子表面诱导空间位阻效应,促进氨基酸残基之间的相互作用[28]。褐变程度与美拉德反应程度直接相关,褐变强度显著升高(P<0.05),共价复合物产生褐色物质,颜色变化较明显。表1为共价复合物和物理混合物的色度分析结果。由图1(b)和表1可见,PKP和LBG的质量比为1.0∶1.0、1.0∶0.5时,共价复合物的L*值大于物理混合物。与物理混合物相比,共价复合物的a*值与b*值均有一定的提高,b*值显著提高(P<0.05),说明PKP与LBG发生了明显的美拉德反应,形成了共价复合物,生成褐色物质。

2.2 共价复合物和物理混合物的结构表征

2.2.1 二级结构分析

红外光谱分析结果可以揭示蛋白质的二级结构特征,二级结构分析结果见图2。由图2(a)可知,PKP的红外光谱在1 630.4 cm-1(CO拉伸振动)、1 525.4 cm-1(N—H弯曲和C—N拉伸振动)处显示了酰胺Ⅰ、Ⅱ的典型谱带[29];在3 274.0 cm-1处观察到的峰是—OH基团和N—H键的拉伸振动,而在2 923.1 cm-1处出现的峰可能与C—H拉伸振动有关[30]。添加LBG后,酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带均发生不同程度的移位,说明LBG与PKP中的CO、N—H、C—N结合,改变了蛋白质的二级结构。与物理混合物相比,共价复合物的峰值移位程度更大,且物理混合物在1 630.4 cm-1处峰值向高波数方向移动,这与Wang等[31]研究结果一致,表明共价复合物的内部可能存在静电相互作用。发生美拉德反应后,共价复合物峰吸收强度的变化原因可能是蛋白—NH2基团的损失、Shiff碱和吡嗪的增加,C—O和C—N拉伸振动以及N—H弯曲振动导致的[32]。共价复合物向低波数方向移动,且在1 055.3 cm-1处峰强度显著增加,表明LBG的—C—O—C和—C—O键发生拉伸振动,PKP和LBG之间形成了更多的氢键[33],说明二者形成了更稳定的复合结构。

使用PeakFit V4.12软件对1 600～1 700 cm-1波数的酰胺Ⅰ带区域吸收峰进行基线校正,并使用高斯二阶导数拟合计算蛋白质二级结构的组成。由图2(b)可知,PKP样品具有(22.46±0.20)%的α-螺旋、(46.90±0.10)%的β-折叠、(19.90±0.79)%的β-转角和(10.74±0.06)%的无规则卷曲。所有蛋白样品的β-折叠含量显著高于其他3种结构含量(P<0.05),说明β-折叠是PKP主要的二级结构。与PKP相比,共价复合物的二级结构在α-螺旋区和β-折叠区占比明显减少,而在β-转角和无规则卷曲占比明显增加。M-P-L-0.5转变程度较大,α-螺旋由(22.46±0.20)%降至(17.43±0.97)%,无规则卷曲含量由(10.74±0.06)%升至(13.33±0.33)%。其中,参与美拉德反应的氨基位于α-螺旋区,α-螺旋含量的下降表明蛋白质分子间氢键的破坏[34],促进了游离氨基与糖的接枝,推断α-螺旋含量与蛋白质的接枝度呈负相关,随蛋白质结构的拉伸而减少[35]。共价复合物无规则卷曲含量显著大于PKP(P<0.05),表明蛋白结构更松散无序,改善了PKP的溶解性和乳化性[36]。此外,有序的二级结构(α-螺旋和β-折叠)被埋藏在蛋白质分子内部,这种结构的减少证实了空间构象的变化,使蛋白质结构更松散,对蛋白的乳化性的提高具有一定的促进作用。

2.2.2 三级结构分析

蛋白与多糖发生美拉德反应会生成有色物质,荧光物质是有色物质的前体物,在280 nm的荧光激发波长下,以色氨酸为发射基团的荧光光谱可以准确地描述蛋白结构的改变以及氨基酸的损失[37]。样品的三级结构分析结果见图3,由图3可知,所有样品在330～335 nm处都有一个明显的峰值强度(Fmax),PKP的最大吸收波长(λmax)为330.8 nm,且具有最高的Fmax。与PKP相比,物理混合物的λmax轻微蓝移并伴随荧光强度的降低,PKP三级结构可能变得更紧凑[38],但并未对其色氨酸等芳香族氨基酸局部环境造成显著影响。Yang等[39]研究乳铁蛋白与小分子之间相互作用时也发现,当色氨酸基因蛋白质构象收缩时其发射峰蓝移,蛋白构象舒展而内部暴露至表面时,发射峰红移。共价复合物的λmax明显红移,M-P-L-1.0、M-P-L-0.5、M-P-L-0.1的λmax分别在332.6、332.8、335.4 nm处。伴随着荧光强度的显著下降,表明蛋白质结构在美拉德反应后展开,羰基基团充当淬灭剂导致蛋白质发生荧光淬灭,色氨酸转移到亲水环境中,肽链更加延伸,蛋白质的三级结构变化[40]。

2.2.3 粒径、Zeta-电位分析

蛋白复合物的平均粒径和Zeta-电位对乳化性具有关键意义,共价复合物和物理混合物的粒径、Zeta-电位分析结果见图4。由图4可见,天然PKP的平均粒径为(6.45±0.67)μm,加入LBG后,平均粒径显著降低(P<0.05),形成了稳定的混合体系。当LBG质量浓度降低时,物理混合物的平均粒径降低,原因可能是外层与PKP相互作用的LBG相对减少,球状结构变薄,物理混合物分子间可能通过静电络合形成相互缠绕的球状微结构。共价复合物的平均粒径显著低于物理混合物(P<0.05),原因可能是温度的升高破坏了蛋白质的二硫键,但M-P-L-0.5粒径略微增大,结合Zeta-电位结果,可能此时复合物净电荷迅速下降,斥力减弱,导致其颗粒聚集[41]。天然PKP的Zeta-电位为(-3.99±0.04)mV,共价复合物与物理混合物的Zeta-电位强度显著大于天然PKP(P<0.05),并呈现出良好的空间斥力,从而使其稳定存在。与Zha等[42]研究结论类似,共价复合物的Zeta-电位绝对值显著大于物理混合物(P<0.05)。本研究表明,LBG与PKP通过氨基共价相互作用,在降低PKP表面正电荷的同时改变了PKP的结构,共价复合物的乳化性提高。

2.2.4 表面疏水性分析

表面疏水性(H0)反映了蛋白质分子在体系中表面疏水基团的暴露程度,而这些疏水基团间的相互作用是维持蛋白质三级结构稳定的关键驱动力之一。共价复合物和物理混合物的表面疏水性分析结果见图5。由图5可知,天然PKP的H0为(11 090.00±48.27),物理混合物的H0显著降低(P<0.05),原因可能是PKP与含有大量亲水羟基的LBG分子相互作用,使体系产生聚合物包埋疏水基团;也可能与多糖链的屏蔽效应有关,该效应阻止ANS附着于疏水残基并降低H0[40]。具有较高接枝度的共价复合物M-P-L-0.5比其他共价复合物具有较高的H0值[40]。在PKP和LBG质量比相同时,与物理混合物相比,共价复合物的H0升高,原因可能是加热使PKP分子暴露更多的疏水基团并掩盖周围的亲水基团[43],直接影响蛋白质的空间构象与功能特性。

2.2.5 游离巯基含量分析

游离巯基之间可以形成二硫键,促进蛋白分子的共价结合,巯基参与维持蛋白质三级结构稳定性和弱二级键的形成,是蛋白质中重要的官能团。共价复合物和物理混合物的游离巯基含量分析结果见图6。由图6可知,与LBG结合后,游离巯基含量显著升高(P<0.05),可能有2个原因:1)蛋白分子结构展开,分子内部疏水基团暴露;2)二硫键的断裂导致亚基解离,从而暴露游离巯基[24]。随着LBG添加量的降低,PKP在复合物中的比例增加,含硫氨基酸含量增加(含硫氨基酸在PKP中是非限制性氨基酸),游离巯基含量增加。图6中,共价复合物的游离巯基含量大于物理混合物,说明美拉德反应打开了PKP的结构,暴露了分子内部的巯基,提高了共价复合物的接枝度,改善了蛋白的乳化性。

2.3 共价复合物和物理混合物的功能特性分析

2.3.1 溶解度分析

溶解度是蛋白质的基本功能特性,蛋白质的其他功能特性受到溶解度的显著影响。共价复合物和物理混合物的溶解度分析结果见图7。由图7可知,天然PKP溶解度为(48.01±0.70)%,除H-PKP外,其他共价复合物和物理混合物的溶解度与空白组相比都有显著的升高(P<0.05),M-P-L-0.5比PKP的溶解度提高了0.41倍,这可能归因于LBG的亲水性。共价复合物的溶解度显著高于物理混合物(P<0.05),因为PKP在较高温度下的展开,形成更小的可溶性蛋白质聚集体,进一步提高了溶解度。Wen等[44]研究表明,多糖将亲水—OH基团引入大豆分离蛋白使其在高温下发生美拉德反应,显著提高了蛋白质的溶解度。美拉德反应使PKP结构展开,当与PKP结合的多糖浓度增加时,蛋白二级结构变化,α-螺旋减少,无规卷曲含量增加。本研究表明,共价复合物溶解度随着蛋白结构的展开而升高[36],说明LBG的加入有效升高了PKP的溶解度。

2.3.2 乳化活性及乳化稳定性分析

共价复合物和物理混合物的乳化性及乳化稳定性分析结果见图8。由图8可知,加入LBG后乳液的EAI和ESI均显著高于天然PKP(P<0.05),说明LBG可能通过增加液滴之间的空间位阻和静电排斥来抑制液滴聚集[45]。共价复合物的EAI显著高于PKP(P<0.05),尤其是M-P-L-0.5,EAI比PKP提高了2.47倍,从(1.44±0.06)m2/g提高到(5.00±0.40)m2/g。这是因为:1)PKP与LBG共价复合显著提高了PKP的溶解度,加速了PKP在油水界面的扩散和吸收[29],提高了界面的迁移率;2)美拉德反应后,PKP与LBG液滴之间产生了更强的静电排斥力,促进LBG分子在油滴周围形成高黏弹性膜,防止乳液的聚结与絮凝[46];3)H0的增加促进了蛋白质在油水界面的吸附,增强了对油界面的亲和力,使其在大豆油液滴上有更高的吸收速率和更快的吸收速度[47]。M-P-L-0.5、M-P-L-0.1具有高ESI,表明它们能形成致密的界面层,更有利于乳液的稳定。此外,松散的蛋白质结构也有助于其在油水界面的重排和稳定。本研究表明,与LBG结合的PKP表现出优异的EAI和ESI,表明PKP乳化性能得到改善。

2.4 Pickering乳液特性分析

2.4.1 乳液外观及乳层析指数分析

不同乳液样品的乳液外观及乳层析指数观察与分析结果见图9。由图9(a)可知,油相体积分数为10%和20%的乳液储存24 h底部有较大相分离,说明乳液分散介质黏度低,分散相液滴运动速度快[48]。而油相体积分数为70%、80%时乳液出现絮凝状且上层油相析出,说明复合物颗粒不足以完全覆盖油相,低覆盖率下的乳液液滴会絮凝形成不规则界面,导致油水相分离[49]。故选择油相体积分数为30%～60%的乳液进行后续实验。由图9(b)和图9(c)可知,所有乳液在第0天均表现出均匀的外观。其中,M-P-L-0.5-50和M-P-L-0.5-60在静置1 h后,翻转玻璃瓶,发现乳液倒置不流动,说明该体系可能形成了类凝胶网络结构,与刘倩[50]的结果相同。产生该现象原因可能是油相体积分数大的乳液油滴数量多,产生范德华力等非共价作用,使体系黏度增加[51];第3天,PKP稳定乳液发生明显相分离,乳层析指数显著增加(P<0.05),而M-P-L-0.5-50和M-P-L-0.5-60形成凝胶网络结构,并未产生乳析现象。第7～14 d,乳液底部的混浊程度降低,乳层析指数持续增大。在同一储存条件下,油相体积分数大的乳液乳层析指数显著低于油相体积分数小的乳液(P<0.05)。所有乳液的乳层析指数和储存时间成正比,且M-P-L-0.5稳定乳液明显比PKP稳定乳液受储存时间影响小(P<0.05),说明M-P-L-0.5较PKP相比具有优异的乳化稳定性。

2.4.2 乳液平均粒径、Zeta-电位分析

不同Pickering乳液样品的平均粒径和Zeta-电位分析结果见图10。由图10可知,M-P-L-0.5稳定乳液平均粒径显著小于PKP(P<0.05),说明M-P-L-0.5作为乳化剂能快速吸附到油水界面,是高乳化性蛋白分子和多糖大分子空间位阻结合的结果[52]。随油相体积分数的增大,Pickering乳液平均粒径增大,M-P-L-0.5乳液的平均粒径从(5.23±0.30)μm增加到(6.88±0.35)μm。原因可能是油相体积分数增加后,蛋白颗粒不足以有效稳定在油滴表面上,吸附在油滴表面的颗粒减少,液滴间静电斥力降低使乳液聚结。Zeta-电位反映了Pickering乳液内油滴的表面电荷。随着油相体积分数增加,M-P-L-0.5乳液的Zeta-电位增加。M-P-L-0.5乳液Zeta-电位值显著低于PKP(P<0.05),表明美拉德反应后,共价复合物表面电荷对乳液中的相应颗粒具有排斥作用,阻止了液滴聚集,更强的电荷会产生更大的分子间排斥力,从而降低液滴之间聚集的可能性并增强乳液的稳定性[53]。

2.4.3 激光共聚焦显微镜观察

激光共聚焦显微镜可以从本质上反映Pickering乳液的粒径分布、分散性和稳定性[54]。图11为不同乳液样品的微观形态,由图11可知,被尼罗红染色的油相液滴分布在水相中,证实了该Pickering乳液是O/W型。在界面处,液滴周围存在绿色荧光循环,表明M-P-L-0.5在油水界面处被吸收。M-P-L-0.5-30、M-P-L-0.5-40发生了颗粒堆积效应,油滴不规则分散,液滴聚结。与Li等[55]研究结果一致,随着油相体积分数的增加,Pickering乳液液滴逐渐增大,间距逐渐减小,形成了更紧凑的结构。本研究表明,M-P-L-0.5-50、M-P-L-0.5-60形成了类凝胶网络结构,使其体系稳定性提高。

2.4.4 流变学特性分析

乳液的流变学测试可以对乳液的微观结构有更深的挖掘并预测乳液的储藏稳定性。图12为不同乳液样品的流变学特性分析结果,由图12(a)可知,随着剪切速率的增加,所有Pickering乳液的表观黏度均显著降低(P<0.05)。剪切速率为1～100 s-1时,M-P-L-0.5稳定的乳液表观黏度显著大于PKP(P<0.05),说明其流动性低,存在凝胶网络;剪切速率为1～10 s-1时,M-P-L-0.5与PKP之间表观黏度的差异明显大于剪切速率为10～100 s-1时的差异(P<0.05),说明共价复合物稳定乳液可能具有更强的分子间作用力[56]。由图12(b)可知,M-P-L-0.5稳定乳液在0.1～10.0 Hz频率范围内,储能模量(G′)均大于损耗模量(G″),表明乳液具有一定的凝胶状性质。油相体积分数为60%的乳液的G′显著高于G″(P<0.05),并显著高于其他乳液样品(P<0.05),其G′和G″值在0.1～10.0 Hz的频率范围内基本不受频率范围影响,有明显的凝胶状特征[21]。Zhao等[57]研究也发现了高油相体积分数的乳液形成紧密的乳液网络,液滴相互挤压,具有强大的变形阻力和有限的流动性,产生了更高的G′和G″。本研究表明,随着油相体积分数增加,Pickering乳液表观黏度、G′增大,表明油相体积分数大的乳液内部结构更紧密,受剪切速率变化影响小,体现出更优的乳化性与稳定性。

2.5 乳液稳定性评价

2.5.1 乳液储存稳定性分析

图13为不同储存时间乳液的微观形态与平均粒径。由图13可知,随着油相体积分数的增加,乳液液滴显著增大(P<0.05),间隙逐渐变小。所有乳液在储存一定时间后均出现了较大的液滴,部分乳滴发生了聚结。M-P-L-0.5-30和M-P-L-0.5-40的液滴随储存时间的增加而显著增加(P<0.05),而M-P-L-0.5-50和M-P-L-0.5-60液滴增加不显著(P>0.05)。Xu等[58]研究发现,随着油相体积分数的增加乳液的稳定性增强,可能是由于当乳化剂含量高于完全包裹界面所需的临界含量时,液滴大小受储存时间的影响变小。图13(b)中,在储存0～3 d时,乳液平均粒径无显著变化(P>0.05),7 d后,所有乳液平均粒径显著增大(P<0.05)。本研究表明,M-P-L-0.5-50和M-P-L-0.5-60的液滴增幅受储存时间影响相对较小,且液滴之间相互挤压,形成类凝胶网络结构,具有较好的储存稳定性。

2.5.2 乳液离心稳定性分析

离心可加速乳析,增大体系中单位面积液滴的数量,利用离心力将体系中互不相溶的成分分离是简单快速检验乳液体系是否均一的方法。图14为不同乳液样品的离心稳定常数及离心后外观状态,由图14可知,M-P-L-0.5稳定乳液的相分离程度显著低于PKP(P<0.05),K值显著高于PKP(P<0.05)。随着油相体积分数的增加,K值显著增加(P<0.05),M-P-L-0.5-60的K值最大,水层的高度或相分离的程度随着油相体积分数的增加而降低。M-P-L-0.5-60离心后依旧保持着稳定,因为凝胶状结构通过阻碍液滴自由运动稳定了乳液,防止了相分离的发生[59],说明共价复合物乳液有较好的离心稳定性。

2.5.3 酸碱、盐离子、温度稳定性分析

图15为M-P-L-0.5-60的酸碱、盐离子、温度稳定性的分析结果。由图15(a)和(b)可知,乳液在酸性条件下平均粒径较大且具有一定的流动性,其中pH值为3.0时乳液平均粒径最大,说明此时乳液中蛋白无法被包裹,乳液高度不稳定。而乳液在中性和碱性条件下得到了乳白色凝胶状倒置不流动的液体,平均粒径较小,乳液相对较稳定。由图15(a)和(c)可知,添加NaCl后乳液视觉外观并未发生明显变化,说明乳液有一定的盐离子稳定性。低盐浓度平均粒径增大,说明盐离子静电屏蔽了蛋白质表面的电荷,减弱了蛋白质分子间的静电排斥[60];而高盐浓度下增大的原因可能是蛋白变性,疏水氨基酸暴露,这些氨基酸通过疏水相互作用促进乳液中的液滴聚集、絮凝和相分离[61]。其中,盐离子浓度为400 mmol/L时平均粒径稍有降低,说明随着静电屏蔽作用的增强,蛋白质间吸引力增强,促进了蛋白质在界面上吸附[62]。由图15(a)和(d)可知,乳液在4 ℃时平均粒径较小,更适合储存乳液。-20 ℃时乳液外观无明显变化,说明乳液可有效防止油沉淀[63],但其平均粒径增大,可能是冷冻后内部结构受损所致[64]。60 ℃时乳液平均粒径增大且外观由白色变为微黄色,说明温度升高削弱了颗粒间静电排斥力和氢键,蛋白结构展开,巯基和非极性基团暴露,液滴聚集,稳定性降低[65]。本研究表明,蛋白和多糖的共价结合使乳液液滴表面空间位点阻力增加、降低了液滴间的吸引力,使该Pickering乳液在酸碱、温度等条件下展现出良好的稳定性,能够在一定条件下稳定储存。

3 结 论

本研究通过美拉德反应成功制备了PKP-LBG共价复合物,系统探究了LBG对PKP结构及功能的影响,并以其为稳定剂制备了Pickering乳液。研究结果表明,美拉德反应不仅促使PKP结构展开,LBG的共价结合更显著改变了其二级(如α-螺旋含量降低)和三级结构。光谱分析表明,共价结合导致蛋白结构趋于松散和无序,色氨酸残基微环境亲水性增强。加热过程暴露了PKP分子内部的疏水性残基,且与物理混合物相比,共价复合物展现出更高的H0和游离巯基含量,证实氢键和疏水相互作用在复合物形成中起关键作用。这些结构变化直接提升了共价复合物的功能特性,特别是M-P-L-0.5,表现出相对较高的溶解性和乳化性。以M-P-L-0.5作为Pickering颗粒稳定剂,以大豆油为油相制备的O/W型Pickering乳液具有良好的稳定性。随着油相体积分数的增加,乳液液滴平均粒径增大、间隙减小,内部可能形成的凝胶网络结构,显著增强了乳液的整体稳定性。本研究旨在阐明LBG通过共价修饰调控PKP结构与功能的内在机制,制备高稳定性的个性化Pickering乳液体系。希望通过本研究能够为松仁粕的高值化利用提供新途径,并为设计基于植物蛋白-多糖共价复合物的新型食品级乳化剂提供理论依据和实践参考。

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Structural Characterization of Pine Kernel Protein-Locust Bean Gum Conjugates and Its Pickering Emulsion Stability

JIANG Lai1,2, WANG Jiarong2, WANG Xuemei2, WANG Wenqi2, YANG Yuhua2, ZHAO Yuhong1,2,*

(1.State Key Laboratory of Utilization of Woody Oil Resources, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;2. School of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Abstract： To explore the effects of covalent modification of locust bean gum (LBG) on the physicochemical properties, structural characteristics and Pickering emulsion stability of pine kernel protein (PKP), infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy were used to analyze the structural differences between conjugates and physical mixtures. The mechanism of interaction between PKP and LBG at different mass ratios was revealed by measuring particle size, Zeta-potential and surface hydrophobicity. Pickering emulsions were prepared using PKP-LBG conjugates as emulsifiers, and the effects of oil phase volume fraction on emulsion properties and stability were investigated. The results showed that compared with the physical mixtures of PKP and LBG, the content of α-helix and β-sheet in the conjugates decreased, and the maximum fluorescence emission wavelength redshifted, indicating that covalent binding caused the protein structure to unfold and the spatial conformation to become loose. Particle size and Zeta-potential measurements showed that the average particle size of conjugates(especially M-P-L-0.5 conjugate with PKP: LBG mass ratio of 1.0∶0.5) decreased and the surface charge increased, which could resist protein aggregation. The surface hydrophobicity and free thiol content of conjugates were significantly higher than those of physical mixtures (P<0.05), indicating that heating changed the tertiary structure of the protein and exposed hydrophobic groups, which was significantly related to the improvement of solubility and emulsifying properties of conjugates (M-P-L-0.5 increased by 0.41 times and 2.47 times, respectively, compared with PKP) (P<0.05). Pickering emulsions were prepared using conjugates as emulsifiers. The average particle size of the emulsion was positively correlated with the volume fraction of the oil phase. Microscopic structure observations showed that M-P-L-0.5 could adsorb on the surface of oil droplets to form an interface layer and stabilize the emulsion. The droplets of M-P-L-0.5 with a 60% oil phase were large and the gaps were small, and the emulsion stability was significantly higher than that of other emulsions (P<0.05). Moreover, this emulsion had good storage, acid-base, centrifugation, salt ion and temperature stability. This study clarified the mechanism by which LBG covalent modification improved the functional properties of PKP and successfully prepared highly stable Pickering emulsions, providing a basis for increasing the added value of pine kernel meal and expanding the application of PKP in food.

Keywords： pine kernel protein; locust bean gum; conjugates; Pickering emulsion; emulsion stability

doi：10.12301/spxb202400482

文章编号：2095-6002(2025)04-0088-17

引用格式：姜来, 王佳蓉, 王雪梅, 等. 松仁蛋白-刺槐豆胶共价复合物结构表征及其Pickering乳液稳定性研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(4):88-104.

JIANG Lai, WANG Jiarong, WANG Xuemei, et al. Structural characterization of pine kernel protein-locust bean gum conjugates and its Pickering emulsion stability[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(4):88-107.

中图分类号： TS202.1

文献标志码： A

收稿日期： 2024-07-22

基金项目： 黑龙江省重点研发计划项目(2024ZX10B03)。

Foundation: Key Research and Development Program of Heilongjiang Province (2024ZX10B03).

第一作者： 姜 来,女,硕士研究生,研究方向为松仁蛋白功能调控。

*通信作者： 赵玉红,女,副教授,博士,主要从事坚果蛋白质功能调控及机制研究。

(责任编辑：叶红波)