大豆粕,是指以大豆为原料经浸提法取油后副产物。因其蛋白含量高(达40%～47%),在我国动物饲料工业中发挥着至关重要的作用。我国作为大豆油生产大国,豆粕产量大。近年来,相关报道显示豆粕中含胰蛋白酶抑制因子、非淀粉多糖和植物血凝素等抗营养因子,容易导致动物难以消化吸收[1],从而影响动物的健康生长,因此一直牵制着豆粕在饲料工业的发展。随着研究的不断深入,酶解方式可以破坏、消除抗营养因子,提高蛋白利用率[2-3]等结论已被充分证明。

值得关注的是,酶解过程会促进更多的生物活性小肽产生,并且从中制备多肽。例如,研究发现仔猪食用的豆粕发酵物具有较好的抗氧化作用,但受酶的种类差异性影响,水解过程中专一性不相当,导致豆粕酶解产物的抗氧化性不尽相同[4]。此外,大豆肽还具备增强免疫[5]及调节肠道健康[6]、抗疲劳[7]等功能。尽管目前已有研究表明大豆粕酶解物中可以分离出抗氧化肽[8-9]等活性小肽,但其潜在的抗炎功能鲜有报道。

当前,利用生物酶解方法所得豆粕酶解物的呈味特性主要表现为鲜味突出、苦味明显,同时具有增强厚味的协同效果[10],因此深入挖掘豆粕酶解产物背后的利用空间,有望深入开发成鲜味肽。研究表明,秀珍菇蛋白水解物进行γ-谷氨酰基化反应后,呈味特性得到一定改善,尤其表现在厚味及鲜味特性方面[11];利用谷氨酰胺酶对猪血红蛋白酶处理后,产品苦味降低,而鲜味和厚味的味感有所提升[12]。当前,γ-谷氨酰肽作为一种新型的呈味肽逐渐受到关注[13],解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶具有γ-谷氨酰转肽酶酶活(酶活力为100 U/g),若能够利用γ-谷氨酰基化修饰蛋白酶解液的整体味感,将为豆粕源产品的开发及加工利用提供新的思路。

因此,研究以大豆粕为原料,酶解及谷氨酰基化反应后制备获得大豆粕酶解物与大豆谷氨酰肽粗产物,观察其对滋味及抗炎活性的影响。通过蛋白质相对分子质量测定、肽分子量分布情况、游离氨基酸含量以分析样品中蛋白质及氨基酸变化情况,探讨当中呈味特性与功能肽之间的联系,以期优化酶解液风味,提高大豆粕的商业价值及经济效益,同时为更多潜在功能的大豆肽开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆粕购于阳江市漠阳花业有限公司,样品量约2 kg,4分法取样,粉碎过60目筛,用于分析。

解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶(100 U/g),中国天野酶制剂有限公司;风味蛋白酶(20 U/mg),上海源叶生物科技有限公司;蒸馏水、食盐、味精、蔗糖、鸡汤均为市售;细胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511 Da)、氧化型谷胱甘肽(621 Da)和Glu-Gly-Gly(189 Da),上海阿拉丁生物试剂股份有限公司;Caco2细胞,美国Abcam公司;48孔细胞培养板,美国康宁公司;DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲溶液,加拿大英杰公司;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)人肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(JL10208)、人白细胞介素8(IL-8)试剂盒(JL19291),江莱生物公司。

1.2 仪器与设备

FiveEasy Plus型pH计,梅特勒-托利多公司;DYY-6C型电泳仪,北京市六一仪器厂;SPH-108B型恒温摇床,上海优宁维生物科技股份有限公司;Eppendorf 5810型高速冷冻离心机,德国艾本德公司;HWS-12型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;BIO-RADXR型电泳成像仪,美国Bio-Rad伯乐有限公司;BS223S型电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;LC-10N型冷冻干燥机,上海力辰邦西仪器科技有限公司;L-8080型日立全自动氨基酸分析仪日立科学仪器(北京)有限公司;Synergy H1型多功能酶标仪,美国安捷伦科技有限公司;CLM-170B-8-CN型二氧化碳培养箱,太仓艺斯高医疗器械科技有限公司;1260型高效液相色谱仪,美国Agilent科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆粕酶解物的制备

参考Ji等[14]的方法处理大豆粕。首先将大豆粕粉碎,过60目筛,取4.5 g大豆粕粉末于离心管中,加入30 mL的蒸馏水,调节pH值至8.0,放置于85 ℃水浴锅中水浴10 min,当温度降至60 ℃时,加入质量分数0.75%风味蛋白酶(以大豆粕的蛋白质质量计),60 ℃酶解9 h,再经过沸水浴灭酶15 min,在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,收集上清液,即为大豆粕酶解物。

1.3.2 大豆粕酶解物的γ-谷氨酰基化处理

将1.3.1节中大豆粕酶解物冻干样以40 mg/mL调制成溶液,按照方法略加修改,用3 mol/L NaOH溶液将大豆粕水解物溶液的pH值调至10.0置于水浴锅中,37 ℃水浴10 min,添加质量分数2.00%谷氨酰胺酶(以大豆粕的蛋白质质量计),35 ℃处理3 h,再经过沸水浴灭酶10 min,降至室温后,pH值调至7.0,在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,即为大豆谷氨酰肽粗产物。

1.3.3 滋味的评价方法

参考Tu等[15]的感官评定方法进行调整,选用10名经过专业培训的研究生(5名男性和5名女性,年龄在23～25岁之间,其中6名已有2年以上相关感官评定经验)作为本次感官实验的评价员。配制质量分数分别为1%蔗糖水溶液、0.5% L-异亮氨酸水溶液、0.08%柠檬酸水溶液、0.35%氯化钠水溶液、0.35%味精水溶液、含浓度0.005 mol/L谷胱甘肽的鸡汤溶液,作为甜味、苦味、酸味、咸味、鲜味、厚味的评价标准品。

采用5分制评分法,0分表示被检测的样品没有味道,5分则表示被检测样品具有显著的味道,标准品呈味得分设置为2.5分。感官评价员品尝各样品量为10 mL,食用后保持样品在嘴里停留25 s再缓慢吞咽。评价完一个样品后,评价员需要使用纯净水漱口再进行下一个样品的品尝。记录各个样品的基本味觉评分。

1.3.4 抗炎活性的评价方法

参考文献[16]和[17]方法培养细胞,使用细胞实验对产物的抗炎活性进行评价。在体外炎症研究中,Caco2细胞贴壁生长于添加20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM培养液中,置于37 ℃、体积分数为5%CO2、100%湿度培养箱中培养,每2 d更换新鲜培养基。Caco2细胞以 2×105个/mL接种于48孔板中,细胞生长5～7 d,直到获得融合单层(细胞密度超过80%)。融合细胞在刺激前用缓冲盐溶液洗涤融合细胞。将10 mg/mL的2组样品加入细胞中孵育2 h,然后加入TNF-α(2 ng/mL)处理4 h,以刺激炎症反应。收集细胞培养上清液,按照ELISA试剂盒操作说明书步骤检测TNF-α和IL-8水平,重复3次。

1.3.5 蛋白质相对分子质量的测定

使用SDS-PAGE电泳法测定大豆粕、大豆粕酶解物的相对分子质量。

将10 mg/mL大豆粕及大豆粕酶解物样品加入上样缓冲液中,于100 ℃下煮沸5 min,1 200 r/min下离心5 min,分离胶质量分数为12%,浓缩胶质量分数为5%。恒压电泳80 V跑胶30 min,再调至120 V,通电1 h。停止电泳后加入固定液淹没浸泡10 min,采用低分子质量的标准蛋白,用考马斯亮蓝R-250染色60 min后加脱色剂脱色,脱色后保存并利用蛋白成像仪拍照。

1.3.6 肽分子质量分布情况的测定

采用HPLC法分析大豆粕、大豆粕酶解物、大豆谷氨酰肽粗产物中的肽分子质量分布。

标品为细胞色素C(12 384 Da)、抑酞酶(6 511 Da)、杆菌肽(1 423 Da)、氧化型谷胱甘肽(621 Da)和Gly-Gly-Gly(189 Da)。测定色谱柱为TSKGel-G2000-SWXL(7.8 mm×300 mm),流动相为乙腈、水、三氟乙酸(体积比为40∶60∶0.1),流速0.5 mL/min;柱温30 ℃,紫外检测波长214 nm,进样量20 μL。

1.3.7 游离氨基酸含量的测定

参考文献[18]的方法,使用氨基酸分析仪分析大豆粕酶解物、大豆谷氨酰肽粗产物中的游离氨基酸。

取适量样品溶于超纯水,经振荡混合均匀后,常温静置30 min,定容至50 mL容量瓶中,取定容后样液4 mL,按V(样品)∶V(质量分数为15%的磺基水杨酸)=4∶1加入磺基水杨酸,混合均匀,置于4 ℃冰箱中冷藏静置60 min后,于4 ℃下离心15 min(1 000 r/min),取上清液重复离心,完成后经0.22 μm的滤膜过滤后于氨基酸分析仪进行检测。

1.4 数据分析

作图采用Origin 2018,用IBM SPSS Statistics 20进行方差分析和Duncan’s多重极差比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 谷氨酰基化处理对大豆粕酶解物滋味和抗炎活性的影响

2.1.1 感官效果变化

大豆粕酶解、谷氨酰基化处理前后的滋味变化结果见图1。由图1可知,未加酶的大豆粕味感以咸味、鲜味、厚味为主,经风味蛋白酶处理后,风味有所改善,主要体现在酸味、厚味、咸味、鲜味均有所提升。结合当前报道可知,生物酶解技术可以较好地优化豆粕肽的味感,如提升原酿酱油的风味品质[19],尤其是酱油鲜味、浓厚感及酱香味提升效果显著。风味蛋白酶的加入较好地促使豆粕蛋白质及多肽的降解,进而生成更多的小肽和呈味氨基酸,为鲜味、厚味氨基酸的产生提供条件,使大豆粕的呈味特性有所改善。

图1 大豆粕、大豆粕酶解物、大豆谷氨酰肽粗产物的滋味变化
Fig.1 Taste changes of soybean meal, soybean meal hydrolysate and soybean glutamyl peptide crude products

与大豆粕酶解前后样品相比,大豆谷氨酰肽粗产物呈味效果显著增强,尤其在厚味及鲜味方面,得分分别提高了1.0、0.9分(标品得分为2.5)。这种较好的厚、鲜味提升效果很可能与γ-谷氨酰胺酶催化产物(γ-谷氨酰肽)生成相关。截至目前,已有超过100种γ-谷氨酰肽被证实具有厚味特性[20],是厚味的主要来源。在谷氨酰胺酶作用条件下,谷氨酰胺的γ-羧基与氨基酸或多肽的氨基基团经脱水缩合生成产物γ-谷氨酰肽。相关报道显示γ-谷氨酰肽除可以较好地提高食品的厚味强度外还呈现酸涩味感,该特性对咸鲜味具有一定的协同增效作用,能够丰富整体感官效果[21-22]。

2.1.2 抗炎活性评价结果

炎症是机体对于炎症介质刺激的一种防御反应, 炎症反应过程往往伴随着大量炎性细胞因子的产生,它们参与了多种炎症及免疫反应过程。同时,已被证实的是,这些慢性炎症是造成许多肿瘤疾病发生的重要影响因素[23]。因此,在构建炎症细胞模型后,加入大豆粕酶解物及大豆谷氨酰肽粗产物,观察TNF-α和IL-8两组促炎因子表达水平的变化,以表征样品在抗炎活性方面的影响,实验结果见图2。

不同字母表示组间数据具有显著性差异(P<0.05)。
图2 大豆粕酶解物及大豆谷氨酰肽粗产物对炎症因子TNF-α、IL-8表达水平的影响
Fig.2 Effects of soybean meal hydrolysate and soybean glutamyl peptide crude products on expression levels of inflammatory factors TNF-α and IL-8

TNF-α作为一种重要的促炎细胞因子,在机体炎症疾病(急性或慢性炎症疾病)发展过程中发挥着不可忽视的作用,包括协同调节其他细胞因子产生、细胞存活等方面[24-25]。由图2可知,与阳性对照组相比,2组实验组均下调炎症因子TNF-α、IL-8的表达水平,且下调后与正常组(空白对照)接近。同时,2组实验组均与阳性对照组呈显著差异,具体表现在炎性细胞因子TNF-α和IL-8表达水平在10 mg/mL酶解组预处理后分别降低了约22%和15%(P<0.05);γ-谷氨酰基化反应液预处理后分别降低了约22%和15%(P<0.05)。可见,2个实验组在同样的浓度条件下,γ-谷氨酰基化反应组更有效降低炎症水平。

通常认为,IL-8与TNF-α往往作为一种前炎症介质参与到多种炎症反应过程,若TNF-α表达水平上调,则表示其处于炎症反应的上游阶段,可直接或间接诱导量的细胞因子和趋化因子产生从而加剧炎症反应和组织损伤,而IL-8的合成与释放又可通过TNF-α诱导刺激来完成。因而,两者在炎症发生及发展过程中起着重要作用。此前,已有研究通过TNF-α等炎症细胞因子的表达水平有效下调现象以表征其对炎症的抑制作用[26]。而γ-谷氨酰基化反应产物(γ-EV)也被证实在猪和小鼠结肠炎的模型中,激活钙离子敏感受体CaSR从而起到抗炎作用[17,27]。因此,可以推测:大豆粕酶解物及大豆谷氨酰肽粗产物缓和炎症作用的原因与自转肽反应密切相关,且生成的产物γ-谷氨酰肽具有潜在的抗炎效果,促使TNF-α和IL-8的活性表达得到缓和。未来,结合γ-谷氨酰肽潜在的抗炎活性及其他生物活性可有望开发成生物医药类产品,应用于炎症等慢性疾病的治疗当中。

2.2 谷氨酰基化处理对大豆粕酶解物组成的影响

2.2.1 蛋白质相对分子质量的变化

豆粕经过风味蛋白酶酶解以及γ-谷氨酰基化反应后取样测定相对分子质量,结果见图3。由图3可知,SDS-PAGE的未酶解阶段(空白组)在10～95 kDa可见大量条带,且该区间内条带颜色较深,蛋白含量高。大豆粕原料富含疏水性氨基酸,形成较为紧密的分子结构,酶解反应前呈现出典型多肽蛋白结构。加入风味蛋白酶后,与原料谱带相比,原聚集在大于10 kDa区间谱带消失。这是由于蛋白酶可以较好地降解蛋白抗营养因子,而大豆粕中主要的抗营养因子为大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白,它们的分子质量分别在18～45 kDa和42～83 kDa[28]。可见,风味蛋白酶酶解反应在水解蛋白抗营养因子等大分子蛋白及肽上发挥着重要作用。

“M”为蛋白标准品,“大豆空”为大豆粕,“大豆酶”为大豆粕酶解物
图3 大豆粕酶解反应对蛋白质相对分子质量的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis of soybean meal on relative molecular weight of protein

此外,大豆粕酶解物相对分子质量大小主要取决于酶水解底物的程度。由图3可知,经过酶解处理后,大豆粕分子量最终集中分布在小于6.5 kDa处,说明在风味蛋白酶能够较好地水解原料中的大分子肽,进而降解为更多的小分子肽以及游离氨基酸,该现象与之前的研究结果一致[10,29]。当豆粕中大分子蛋白降解成更多短链小肽时,这意味着更多具有营养特性和生物功效的小肽可加以利用。有研究发现,在酶解大豆提取液中小于1 kDa的小肽鲜味最强,能够增强豆粕滋味,提升香味[30],因此大豆粕蛋白酶解液的鲜味提升程度较好,该结论与感官研究结果一致(图1)。此外,已有报道显示,水解获得的豆粕源抗氧化肽具备预防酒精性肝损伤的潜力[31],因而,酶解大豆粕能够较好解决蛋白利用率低的难题,同时其水解肽在生物活性方面还具有极高的开发潜力。

2.2.2 肽分子量分布情况的变化

通常认为,酶解液肽分子量分布情况可以侧面反映出蛋白酶酶解情况,因此对大豆粕酶解物及大豆谷氨酰肽粗产物的具体分子量分布情况进行测定,结果见图4。由于豆粕中富含抗营养因子等大分子蛋白,原料中10 kDa以上的多肽占比高达66%。经酶解,大于10 kDa的肽含量显著减少,小于10 kDa的肽含量明显增多。可见,酶解过程中大豆粕的大分子蛋白逐步被降解为相对分子质量更小的多肽,该结果符合图3推断。

图4 大豆粕γ-谷氨酰基化处理前后的肽分子质量分布
Fig.4 Molecular weight distribution of peptides before and after γ-glutamylation of soybean meal

经谷胺酰基化处理后,可以明显看到整体的分布情况均有明显变化,其中分子量在3 kDa以下的多肽占比显著增多,即γ-谷氨酰基化反应过程很可能促使分子量在3 kDa以下的小肽合成。目前,已有许多成熟的研究表明分子量在3 kDa以下的肽多为呈味小肽[21-22],且部分呈味肽具备潜在的生物活性。结合谷氨酰胺酶自身的特性,既能使γ-谷氨酰基化合物发生水解反应从而释放出游离的谷氨酸,还具备将单体转移至氨基酸和肽上,生成γ-谷氨酰肽的能力。因此,当氨基酸或小肽作为受体发生了转肽反应时,产物即为γ-谷氨酰肽。近年来,诸多学者实验证明了谷氨酰胺酶可以增加产物中的浓厚味,且具有浓厚味感的γ-谷氨酰肽类物质主要是γ-谷氨酰肽中的二肽和三肽类物质[32]。

2.2.3 游离氨基酸含量的变化

大豆粕经过酶解及γ-谷氨酰基化两种不同处理方式下利用氨基酸自动分析仪测定其游离氨基酸含量,结果见表1。根据结果可知,大豆粕谷氨酰基化处理前后测得氨基酸总量分别为:(150.24±0.04) mg/g、(128.49±0.04) mg/g。可见,大豆粕蛋白酶解液经过γ-谷氨酰基化反应后,大豆粕酶解液中绝大部分游离氨基酸含量有所降低。

表1 大豆粕谷氨酰基化前后游离氨基酸含量变化
Tab. 1 Changes in free amino acids before and after γ-glutamylation of soybean meal mg/g

w(游离氨基酸)大豆粕酶解物大豆谷氨酰肽粗产物天冬氨酸Asp4.83±0.01a4.16±0.01b苏氨酸Thr13.43±0.01a10.32±0.02b丝氨酸Ser7.38±0.01a7.15±0.02a谷氨酸Glu17.32±0.01a8.95±0.02b甘氨酸Gly3.42±0.01a3.36±0.01a丙氨酸Ala5.98±0.01a5.76±0.01a半胱氨酸Cys2.05±0.02a1.73±0.01b缬氨酸Val9.25±0.01a9.02±0.01a蛋氨酸Met3.03±0.01a2.21±0.02b异亮氨酸lle10.33±0.01a9.56±0.01b亮氨酸Leu17.68±0.02a16.67±0.01b酪氨酸Tyr5.68±0.01a5.64±0.01a苯丙氨酸Phe19.44±0.02a18.49±0.04b赖氨酸Lys9.68±0.01a7.38±0.01b组氨酸His4.45±0.01a3.98±0.01b精氨酸Arg15.19±0.02a13.06±0.01b脯氨酸Pro1.07±0.01a1.05±0.01a总游离氨基酸150.24±0.04a128.49±0.04b

不同上标小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05)。

值得注意的是,谷氨酸是典型的鲜味氨基酸,经过γ-谷氨酰基化反应后其含量变化显著。结合感官结果可知,谷氨酰基化反应对鲜味、厚味味觉提升效果十分显著,根据常见的谷氨酰胺酶反应机制,我们可以推测产物γ-谷氨酰肽生成路径为:大豆粕酶解液受谷氨酰胺酶的作用,其中鲜味氨基酸(谷氨酸)等作为底物受体参与到肽的合成中,与γ-谷氨酰供体相互作用,最终生成产物γ-Glu-AA或者γ-Glu-Glu-AA(γ-谷氨酰二肽或三肽)[33],因此游离氨基酸总量有所降低,而这一变化情况符合合成γ-谷氨酰肽的规律[34]。结合γ-谷氨酰肽的特性以及游离氨基酸减少量可预测,该过程转化为潜在的γ-谷氨酰肽含量为:每克大豆粕酶解液冻干样中Glu、Thr、Lys、Arg、Leu等约转化成32.24 mg相应的主要γ-谷氨酰二肽。

3 结 论

酶解豆粕中抗营养因子含量大幅度降低,大分子的蛋白质等被分解成小分子寡肽、游离氨基酸等。但是仅利用具有协同作用的蛋白酶进行水解还无法得到更具营养价值的小分子短肽。研究使用了解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶处理酶解豆粕产物。结果表明:大豆粕经过风味蛋白酶、谷氨酰胺酶作用后所得酶解液整体呈味效果得到较好优化,尤其体现在其咸鲜味及厚味水平的提高;结合酶解前后豆粕在SDS-PAGE、肽分子量分布、游离氨基酸含量的变化情况可推测,γ-谷氨酰转移酶添加至酶解豆粕液中,可以促进γ-谷氨酰肽的合成,该小肽在鲜厚味味觉特性优化方面做出一定贡献。此外,γ-谷氨酰肽还可作为功能肽发挥其潜在的活性功能,除目前已报道的抗氧化、免疫调节等外,研究还发现其具有较好的抗炎活性,为作为抗炎剂及相关药物开发提供了新思路。该研究结果可为酶解豆粕源蛋白制备呈味肽和功能肽的工业化提供了一定的技术支持和理论参考。

参考文献：

[1] 王珂. 不同来源豆粕在经产母猪不同生理阶段的营养价值评定[D]. 雅安: 四川农业大学, 2024.WANG K. Evaluation of nutritional value of soybean meal from different sources in different physiological stages of multiparous sows[D]. Yaan: Sichuan Agricultural University, 2024.

[2] 黄宸.减盐大豆肽的美拉德中间体制备及其加工风味形成[D].无锡:江南大学,2023.HUANG C. Preparation of Maillard reaction intermediates of salt-reducing soybean peptide and their processing flavor formation [D].Wuxi: Jiangnan University,2023.

[3] 刘新旗, 夏绍琪, 张弛. 大豆蛋白与大豆肽的生物活性及加工特性研究进展[J]. 食品科学技术学报, 2020, 38(3): 1-10.LIU X Q, XIA S Q, ZHANG C. Research progress on bio-logical activity and processing characteristics of soybean protein and peptides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020, 38(3): 1-10.

[4] 郭顺堂, 徐婧婷. 我国大豆食品产业发展现状及存在的问题[J]. 食品科学技术学报, 2023, 41(3): 1-8.GUO S T, XU J T. Development status and existing problems of soybean food industry in China[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023, 41(3): 1-8.

[5] 左倩. 大豆肽对仔猪免疫和消化功能的影响[D]. 无锡: 江南大学, 2016.ZUO Q. Effects of soybean peptide on immunity and digestive function of piglets[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2016.

[6] 李英洁. 酶解大豆蛋白对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响及可能机制研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2022.LI Y J. Effect of enzymatic hydrolysis of soybean protein on growth performance and intestinal health of weaned piglets and its possible mechanism[D]. Yaan: Sichuan Agricultural University, 2022.

[7] 陈园园. 大豆肽的酶解制备与抗疲劳、抗氧化功能研究[D]. 无锡: 江南大学, 2008.CHEN Y Y. Preparation of soybean peptide by enzymatic hydrolysis and study on its anti-fatigue and anti-oxidation functions[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2008.

[8] 孔繁根. 酶解豆粕对獭兔生产性能、免疫、抗氧化和肠道健康的影响[D]. 保定: 河北农业大学, 2022.KONG F G. Effects of enzymatic hydrolysis of soybean meal on production performance, immunity, antioxidant and intestinal health of rex rabbits[D]. Baoding: Hebei Agricultural University, 2022.

[9] 杨涵. 大豆抗氧化肽的制备及其应用[D]. 重庆: 重庆大学, 2022.YANG H. Preparation and application of soybean antioxidant peptide[D]. Chongqing: Chongqing University, 2022.

[10] 高梅娟. 酶法水解蛋白制备风味增强肽的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2009.GAO M J. Study on preparation of flavor-enhancing peptides by enzymatic hydrolysis of protein[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2009.

[11] XIA X Z, FU Y, MA L, et al. Protein hydrolysates from Pleurotus geesteranus modified by Bacillus amyloli-quefaciens γ-glutamyl transpeptidase exhibit a remarkable taste-enhancing effect[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2022, 70(38): 12143-12155.

[12] LI Q, LIU J, DE GOBBA C, et al. Production of taste enhancers from protein hydrolysates of porcine hemoglobin and meat using Bacillus amyloliquefaciens γ-glutamyltranspeptidase[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(42): 11782-11789.

[13] 王海丽, 关鑫, 唐源, 等. 热反应牛骨香精酶解工艺的优化及关键气味化合物的鉴定[J]. 食品科学技术学报: 1-17.WANG H L, GUAN X, TANG Y, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis process of thermal reaction bovine bone flavoring and identification of key odor compounds[J]. Journal of Food Science and Technology: 1-17.

[14] JI N, SUN C X, ZHAO Y X, et al. Purification and identification of antioxidant peptides from peanut protein isolate hydrolysates using UHR-Q-TOF mass spectro-meter[J]. Food Chemistry, 2014, 161: 148-154.

[15] TU J C, GUO J, DONG H, et al. Novel umami-, salty-, and kokumi-enhancing γ-glutamyl tripeptides synthesized with the bitter dipeptides from defatted peanut meal protein hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2023, 71(20): 7812-7819.

[16] ZHANG H, KOVACS-NOLAN J, KODERA T, et al. γ-Glutamyl cysteine and γ-glutamyl valine inhibit TNF-α signaling in intestinal epithelial cells and reduce inflammation in a mouse model of colitisvia allosteric activation of the calcium-sensing receptor[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 2015, 1852(5): 792-804.

[17] GUHA S, PAUL C, ALVAREZ S, et al. Dietary γ-glutamyl valine ameliorates TNF-α-induced vascular inflammationvia endothelial calcium-sensing receptors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(34): 9139-9149.

[18] ZHENG L, REN J Y, SU G W, et al. Comparison of in vitro digestion characteristics and antioxidant activity of hot- and cold-pressed peanut meals[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4): 4246-4252.

[19] 何婷. 大豆粕酶解物对酱油风味品质的影响及呈味肽的分离鉴定[D]. 广州: 华南理工大学, 2019.HE T. Effect of soybean meal enzymatic hydrolysates on flavor quality of soy sauce and isolation and identification of flavoring peptides[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2019.

[20] 付余, 张宇昊. 浓厚味 γ-谷氨酰肽研究进展, 机遇与挑战[J]. 中国食品学报, 2022, 22(4).FU Y, ZHANG Y H. Research progress, opportunities and challenges in the research of kokumi γ-glutamyl peptides [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2022, 22(4).

[21] 范海茹. 豆粕鲜味肽的制备与呈味机制探索[D]. 北京: 中国农业科学院, 2020.FAN H R. Preparation of umami peptide from soybean meal and its flavor mechanism[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2020.

[22] 林俊杰. N-乙酰氨基酸和N-乙酰二肽的酶法合成、应用以及增鲜机制研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2022.LIN J J. Enzymatic synthesis, application and freshness enhancement mechanism of N- acetylamino acid and N- acetyldipeptide[D]. Guangzhou: South China Univer-sity of Technology, 2022.

[23] PÉREZ S, FINAMOR I, RIUS-PÉREZ S, et al. γ-Glutamyl cysteine suppresses TNF-α up-regulation via protein phosphatases in acute pancreatitis[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2016, 96: S62.

[24] 相欢, 路美明, 陈胜军, 等. 基于虚拟筛选、分子对接和细胞模型筛选乌鳢源抗炎肽[J]. 食品科学, 2024, 45(24): 100-107.XIANG H, LU M M, CHEN S J, et al. Discovery of anti-inflammatory peptides from Channa argus using virtual screening, molecular docking, and cell model[J]. Food Science, 2024, 45(24): 100-107.

[25] 段舒舒, 郑明静, 洪涛, 等. 红毛藻多糖抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞的机制[J]. 食品科学, 2024, 45(17): 9-16.DUAN S S, ZHENG M J, HONG T, et al. Inhibitory mechanism of Escherichia coli adhesion to Caco-2 mono-layers by polysaccharides from Bangia fusco-purpurea[J]. Food Science, 2024, 45(17): 9-16.

[26] XING L J, ZHANG H, MAJUMDER K, et al. γ-Glutamylvaline prevents low-grade chronic inflammation via activation of a calcium-sensing receptor pathway in 3T3-L1 mouse adipocytes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(30): 8361-8369.

[27] IKPA N, FORMAN R, GARCHOW K, et al.In vitro studies on degradation of gamma-L-glutamyl-L-cysteine and gamma-L-glutamyl-D-cysteine in blood: implications for treatment of stroke[J]. American Journal of Therapeutics, 2015, 22(4): e97-e106.

[28] 徐康, 王远兴. 半固态酶解法制备豆粕肽工艺的优化[J]. 中国食品学报, 2023, 23(7): 278-288.XU K, WANG Y X. Optimization of preparation of soybean meal peptides by semi-solid enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(7): 278-288.

[29] ARAI S, YAMASHITA M, KATO H, et al. Applying proteolytic enzymes on soybean[J]. Agricultural and Bio-logical Chemistry, 1970, 34(5): 729-738.

[30] RHYU M R, KIM E Y. Umami taste characteristics of water extract of Doenjang, a Korean soybean paste: low-molecular acidic peptides may be a possible clue to the taste[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3): 1210-1215.

[31] 蔡转章. 豆粕源抗氧化肽对急性酒精性肝损伤的预防作用及机制研究[D]. 长春: 吉林大学, 2021.CAI Z Z. Preventive effect and mechanism of antioxidant peptides from soybean meal on acute alcoholic liver injury[D]. Changchun: Jilin University, 2021.

[32] SUZUKI H, NAKAFUJI Y, TAMURA T. New method to produce kokumi seasoning from protein hydrolysates using bacterial enzymes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(48): 10514-10519.

[33] YANG J, SUN-WATERHOUSE D, ZHOU W S, et al. Glutaminase-catalyzed γ-glutamylation to produce CCK secretion-stimulatory γ-[Glu]n-Trp peptides superior to tryptophan[J]. Journal of Functional Foods, 2019, 60: 103418.

[34] 杨娟. γ-谷氨酰肽的酶法合成及其应用[D]. 广州: 华南理工大学, 2018.YANG J. Enzymatic synthesis and application of γ-glutamyl peptide[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2018.

γ-Glutamylation of Soybean Meal Enzyme Hydrolysate and Taste and Anti-Inflammatory Activity of Its Products

LIU Pingru1, LIN Qianyi1, HUANG Jianhua1, DONG Hao1,2, ZENG Xiaofang1,2, BAI Weidong1,2, YANG Juan1,2,*

(1.College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2.Academy of Contemporary Agricultural Engineering Innovations/Guangdong Provincial Key Laboratory of Lingnan Specialty Food Science and Technology/Key Laboratory of Green Processing and Intelligent Manufacturing of Lingnan Specialty Food, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Abstract：γ-Glutamyl peptide was found to be a kokumi peptide with various functional properties. Soybean meal was used as the raw material to investigate the effects of flavour protease and γ-glutamylation on the taste characteristics and anti-inflammatory functional activities under conditions of synergistic enzyme digestion. The enzyme digest was obtained under the conditions of flavour protease digestion for 9 h, enzyme digestion temperature of 55 ℃, enzyme dosage of 0.75%, and pH 7.0, and then γ-glutamylation modification was carried out by the enzyme dosage of 2.00%, pH 10.0, enzyme digestion temperature of 35 ℃, and enzyme digestion time of 3 h. The resulting product was the crude soybean glutamyl peptides, which showed significant improvement in taste, especially in terms of saltiness, umami, and kokumi. It was demonstrated that after modification by γ-glutamylation, soybean meal had potential anti-inflammatory activity in addition to improving taste characteristics.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression levels of IL-8 and TNF-α in the experimental group. The results showed that the expression levels of inflammatory factors TNF-α and IL-8 were down-regulated by about 22% and 15%, respectively, after pre-treatmented with 10 mg/mL of soybean glutamyl peptide crude products, which were close to those in the normal group, and had significant difference with those in the positive control group (P<0.05). Combined with the results of substance changes, it could be speculated that the enzymatic reaction degraded the large-molecule proteins (greater than 10 kDa) in soybean meal into small-molecule peptides, and the molecular weights mainly less than 1 kDa. After γ-glutamylation reaction, some of the amino acids were converted into γ-glutamyl peptides, and the total free amino acid content of soybean meal was reduced from (150.24±0.04)mg/g to (128.49±0.04)mg/g, and the yield of γ-glutamate dipeptide was predicted to be about 32.24 mg/g. This study provided a theoretical basis for the functional processing and product optimisation of soybean meal-derived condiments.

Keywords：soybean protein; soybean meal; γ-glutamylation; glutamyl peptide; anti-inflammation activity

中图分类号：TS202.1; TS214.2

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300554

文章编号：2095-6002(2025)01-0147-09

引用格式：刘萍茹,林倩怡,黄建华,等.大豆粕酶解物的γ-谷氨酰基化及其产物的滋味和抗炎活性[J]. 食品科学技术学报,2025,43(1):147-155.

LIU Pingru, LIN Qianyi, HUANG Jianhua, et al. γ-Glutamylation of soybean meal enzyme hydrolysate and taste and anti-inflammatory activity of its products[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(1):147-155.

收稿日期：2023-09-06

基金项目：广东省自然科学基金面上项目(2023A1515010934)。

Foundation：Natural Science Foundation of Guangdong Province(2023A1515010934).

第一作者：刘萍茹,女,硕士研究生,研究方向为蛋白质功效组分的开发与利用。

*通信作者：杨 娟,女,副教授,博士,主要从事食品风味化学和食品生物技术方面的研究。

(责任编辑：李 宁)