蛋白质非酶糖基化包括一系列复杂的非酶促反应[1],主要分为3个阶段[2]:初级阶段,蛋白质游离氨基与还原糖羰基之间经羰胺缩合形成席夫碱(Schiff base),并可以进一步重排形成稳定的果糖胺,即Amadori产物;中级阶段,Amadori 产物经一系列反应生成活性α-二羰基化合物,如甲基乙二醛和3-脱氧葡萄糖酮醛;高级阶段,羰基化合物与游离氨基等反应,进一步生成稳定且不可逆的晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)。AGEs除了在机体代谢过程中自发生成外,还广泛存在于富含蛋白质、糖类和脂肪的食品中[3]。经机体摄入后,约有10%的食源性AGEs进入血液循环,其中1/3通过肾脏排出,其余2/3蓄积在肾脏中,进而诱发多种疾病[4-5]。因此,有效抑制蛋白非酶糖基化过程中AGEs的生成具有一定的意义。

AGEs抑制剂主要分为合成类化合物和天然化合物。氨基胍、吡哆胺等合成类物质可有效抑制AGEs的形成,但长期摄入可能引起不良反应,如胃肠道紊乱、罕见血管炎和流感样症状等[6-7]。因此,低毒无副作用的天然化合物类AGEs抑制剂受到广泛关注。已有研究表明,番石榴叶、杨梅和樱桃提取物可有效抑制AGEs的形成,其作用机制包括清除自由基、捕获二羰基化合物、保护蛋白质二级结构、阻断蛋白交联等[8-10]。因此,天然产物是AGEs抑制剂的重要来源。

红曲是我国的传统发酵制品,由红曲霉(Monascus sp.)在大米上发酵而成,属于药食兼用资源 [11-12]。红曲具有良好的着色力,并具有降血压、降血脂、抗氧化、抗炎等功效[13]。红曲色素作为一种天然色素已广泛应用于肉制品中,同时具有抑菌作用,在一定程度上可延长食品货架期[14]。前期工作发现,红曲发酵物(Monascus fermented products,MFP)具有抗蛋白非酶糖基化作用,但目前有关红曲发酵物抗蛋白非酶糖基化作用机制鲜见报道。在前期工作基础上,本研究通过构建体外模拟体系,分析糖基化阶段性产物生成情况,以及糖基化蛋白结构与性质变化,深入探究红曲发酵物抗蛋白糖基化作用。由微生物发酵获取红曲发酵物具有周期短、不受时间和季节限制、易于大规模生产等优势。本研究旨在为低成本、天然安全的AGEs抑制剂的开发提供更加丰富的物质基础,也希望为挖掘新型AGEs抑制剂开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验菌种:红曲霉M7(Monascus purpureus M7),天津科技大学食品科学与工程学院发酵食品与微生物资源开发研究室保藏。牛血清白蛋白(BSA)(纯度≥98%),Sigma-Aldrich上海贸易有限公司;果糖(fructose,Fru),上海麦克林生化科技有限公司;溴酚蓝(bromophenol blue,BPB),天津市江天试剂有限公司;青霉素-链霉素,新赛美生物科技有限公司;氨基胍(aminoguanidine,AG)、硫磺素T(thioflavins-T,ThT)、Tris、吐温20,天津市津北精细化工有限公司;吉拉尔特试剂-T(Girard-T),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化硝基四氮唑蓝(nitro tetrazolium blue chloride,NBT),天津希恩思生化科技有限公司;2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH),上海罗恩试剂有限公司;N-苯基-1-萘胺-8-磺酸(1-anilinonaphthalene-8-sulfonate,ANS),上海毕得医药科技有限公司;5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid,DTNB),北京百灵威科技有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

TDL-5-A型离心机,上海安亭科学仪器厂;Alpha-2LDplus型真空冷冻干燥机,德国Christ公司;WD-9405B型水平摇床,北京市六一仪器厂;EVOS型倒置荧光显微镜,赛默飞世尔科技有限公司;UV-2550PC型紫外可见分光光度计、RF5301PC型荧光分光光度计,日本岛津仪器有限公司;Infinite M200 PRO型酶标仪,瑞士Tecan公司;FLX800TBI型荧光酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;New MOS-450型圆二色谱仪,法国Biologic公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红曲发酵物制备

参考Chen等[15]的方法制备红曲发酵物,将活化的菌种M7接入种子液培养基中,置于摇床培养(26 ℃、180 r/min、5 d),然后将种子液接种到液态发酵培养基中(种子液与液态发酵培养基的体积比为1∶5),继续在摇床中培养(26 ℃、180 r/min、5 d)。将发酵后得到的菌丝体烘干、打粉、过筛(80目),得到菌丝体粉。称取10 g菌丝体粉,加入体积分数为70%的乙醇溶液(100 mL)。超声30 min,离心(4 000 r/min、20 min),得到上清液,重复以上步骤数次,直至提取液无色。合并上清液,将得到的上清液置于50 ℃烘箱中烘干,即得到MFP。

1.3.2 牛血清白蛋白-果糖模拟体系的建立

参考Ni等[16]的方法,构建牛血清白蛋白-果糖(BSA-Fru)模拟体系。分别称取BSA、果糖溶于磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L,pH值为7.4)中,使BSA的终质量浓度为10 mg/mL,果糖终浓度为0.5 mol/L,然后加入青霉素-链霉素使其终体积分数为1%。各实验组中分别加入MFP使其终质量浓度为0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/mL,以添加与MFP相同质量浓度的氨基胍(AG)作为阳性对照组,不添加MFP或AG的实验组为空白对照组,各组置于50 ℃避光孵育24 h,作为糖基化BSA。孵育结束后各样品置于-20 ℃保存备用,以未孵育的BSA作为未糖基化BSA。

1.3.3 MFP对蛋白质非酶糖基化阶段性产物的抑制作用

1.3.3.1 MFP对果糖胺生成的抑制作用

参考Sun等[17]的方法,利用NBT还原法测定早期糖基化产物果糖胺含量。分别取1.3.2中糖基化BSA样品(40 μL),与800 μL NBT显色液(0.30 mmol/L,溶于0.10 mol/L碳酸钠缓冲液中)和160 μL超纯水混匀,25 ℃孵育15 min,用紫外分光光度计测定530 nm处的吸光度,并根据式(1)计算果糖胺的生成抑制率。

抑制率

(1)

式(1)中,A0为空白对照组的吸光度,A为实验组或阳性对照组的吸光度。

1.3.3.2 MFP对α-二羰基化合物生成的抑制作用

参考Huang等[18]的方法,利用Girard-T法测定糖基化体系中α-二羰基化合物的含量。分别取1.3.2中糖基化BSA样品(40 μL),与Girard-T试剂(50 μL,500 mmol/L,溶解于超纯水中)混合,再加入80 μL 超纯水和850 μL 甲酸钠溶液(0.50 mol/L,pH值为2.9)反应1 h,用紫外分光光度计测定290 nm处的吸光值,根据式(1)计算α-二羰基化合物生成抑制率。

1.3.3.3 MFP对AGEs生成的抑制作用

参考Wu等[19]的方法,将1.3.2中糖基化BSA样品置于酶标板中,设定激发和发射波长分别为360 nm和460 nm,测定各样品的荧光强度,依据式(2)计算AGEs生成抑制率。

抑制率

(2)

式(2)中,F0为空白对照组的荧光强度,F为实验组或阳性对照组的荧光强度。

1.3.4 MFP对糖基化蛋白中羰基和游离巯基含量的影响

1.3.4.1 羰基含量的测定

蛋白质羰基含量采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法测定[20],结果以单位质量(g)蛋白中含羰基的物质的量(μmol)表示,μmol/g。取1.3.2中糖基化BSA样品或未糖基化BSA样品(100 μL),加入 1 mL DNPH溶液(10 mmol/L,溶于2 mol/L HCl)中,室温避光反应1 h(每10 min涡旋1次),加入体积分数为20%的三氯乙酸共同孵育10 min,离心(10 000 r/min,10 min)。沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液(二者体积比为1∶1)洗涤,离心(10 000 r/min,10 min),弃上清液,重复3次。沉淀用1 mL盐酸胍(6 mol/L)溶解,涡旋振荡后于37 ℃水浴15 min,用紫外可见分光光度计测定370 nm处的吸光值。用2 mol/L HCl替代DNPH作为空白对照,羰基质量摩尔浓度依据式(3)计算。

b(羰基)

(3)

式(3)中,b(羰基)为羰基质量摩尔浓度,μmol/g;A370为样品在370 nm波长处的吸光度;n为稀释倍数;d为光路径长度,cm;ε为摩尔吸光系数,L/(mol·cm);ρ为蛋白质质量浓度,mg/mL。

1.3.4.2 游离巯基含量的测定

采用DTNB法测定游离巯基含量,结果以单位质量(g)蛋白中含巯基的物质的量(μmol)表示,μmol/g。取1.3.2中糖基化BSA样品或未糖基化BSA样品(250 μL)和DTNB溶液(4 mg/mL,50 μL)混合,加入1.2 mL磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH值为7.4)反应15 min,用紫外可见分光光度计测定412 nm处的吸光值。巯基质量摩尔浓度依据式(4)计算。

b(巯基)

(4)

式(4)中,b(巯基)为巯基质量摩尔浓度,μmol/g;A412为样品在412 nm处的吸光度;D为样品稀释倍数;ρ为蛋白质质量浓度,mg/mL。

1.3.5 蛋白氧化产物含量的测定

取1.3.2中糖基化BSA样品,用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH值为7.4)稀释至0.20 mg/mL,用荧光分光光度计分别测定二酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的荧光强度,激发波长/发射波长分别为330/415 nm和325/434 nm,激发及发射狭缝宽度均为10 nm,电压为700 V。

1.3.6 蛋白质二级结构含量的测定

采用圆二色光谱分析糖基化BSA二级结构含量变化[21]。用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH值为7.4)将糖基化BSA样品稀释至0.20 mg/mL。取稀释后的样品置于1 mm内径的石英比色皿中,圆二色光谱波长扫描范围为190～260 nm,并使用CDNN软件分析CD光谱数据,获得α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构含量。

1.3.7 糖基化蛋白交联结构分析

用硫磺素T(ThT)法测定糖基化蛋白淀粉样β-交联结构水平[22]。取1.3.2中的糖基化BSA样品或未糖基化BSA样品(200 μL)(用磷酸盐缓冲溶液稀释至1 mg/mL)与硫磺素T(0.05 mmol/L,5 mL)避光反应1 h,激发波长435 nm,发射波长485 nm,激发和发射狭缝宽度均为5 nm,电压为700 V。此外,借助荧光倒置显微镜观察ThT染色后的样品。

1.3.8 糖基化蛋白表面疏水性的测定

1.3.8.1 溴酚蓝法测定

取200 μL溴酚蓝(1 mg/mL,溶于超纯水中)加入1.3.2的糖基化BSA样品或未糖基化BSA样品中(1 mL),充分混合10 min,离心(6 000 r/min,15 min),上清液用超纯水稀释10倍,用紫外分光光度计测定595 nm处的吸光值。对照组用超纯水代替样品溶液。以溴酚蓝结合量表征蛋白质溶液表面疏水性,并按式(5)计算。

溴酚蓝结合量

(5)

式(5)中,溴酚蓝结合量,μg;A0为空白对照组的吸光度,A为实验组或阳性对照组的吸光度;200为样品中加入的溴酚蓝质量,μg。

1.3.8.2 N-苯基-1-萘胺-8-磺酸法测定

参考Neelofar等[23]的方法并稍加修改。取1.3.2中制备的糖基化BSA样品或未糖基化BSA样品,用磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L,pH值为7.4)稀释至1 mg/mL,取4 mL稀释后的样品溶液与ANS(8 mmol/L,40 μL)反应1 h,激发波长为380 nm,扫描波长为400～600 nm。激发和发射狭缝宽度均为5 nm,电压为400 V。

1.4 数据处理

所有数据均以3次重复测定结果的平均值±标准偏差表示。采用 Excel 2010 软件进行数据处理,用 Origin 2021 软件对数据进行分析和绘图,并用 IBM SPSS Statistics 2022软件进行显著性分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 MFP处理对蛋白质非酶糖基化阶段性产物形成的影响

2.1.1 MFP对果糖胺形成的影响

果糖胺是非酶糖基化反应早期形成的一种典型Amadori产物,其产生与糖尿病并发症的发展有关,是诊断高血糖和糖尿病并发症的标志物[23]。本研究通过测定果糖胺含量,考察了MFP对蛋白糖基化反应早期产物的抑制能力,实验结果见图1。

由图1可知, 在一定质量浓度范围内(0.05～0.55 mg/mL),随着MFP质量浓度的增大,果糖胺生成抑制率也逐渐增大(由4.40%增加至21.50%)。相同质量浓度的AG对果糖胺的抑制作用要强于MFP,其抑制率由18.40%增加至34.80%。类似地,Zhang等[22]研究了杨梅多酚提取物对果糖胺的抑制作用,发现果糖胺抑制率最高为36.70%,低于阳性对照组AG(46.10%)。这可能是由于AG分子结构中的氨基会与蛋白质游离氨基竞争性地结合还原糖,使得游离氨基对还原糖羰基的可及性降低,进而减少果糖胺的形成[24],而MFP分子结构中没有游离氨基,所以对果糖胺的生成抑制率低于AG,这意味着MFP借助其他途径发挥了AGEs抑制作用。

2.1.2 MFP处理对α-二羰基化合物形成的影响

α-二羰基化合物主要产生于非酶糖基化反应中期,具有较高反应活性,可直接作用于蛋白质的游离氨基并诱导蛋白质交联,是体内AGEs生成的主要途径。因此,降低二羰基化合物的含量可以有效抑制AGEs的产生。考察了MFP对BSA-Fru模拟体系中α-二羰基化合物的抑制作用,实验结果见图2。

由图2可知,随着MFP质量浓度从0.05 mg/mL增大至0.55 mg/mL,α-二羰基化合物的生成抑制率也由12.80%提高至47.90%。相同浓度下AG对α-二羰基化合物的抑制率由26.10%增大至58.40%,说明MFP对α-二羰基化合物有一定的抑制作用,但抑制效果不及AG。类似地,Lin等[25]研究了大蒜素对α-二羰基化合物的抑制作用,发现α-二羰基化合物抑制率最高为36.03%,低于阳性对照AG(42.06%)。 AG结构中存在的氨基可通过亲核加成反应捕获Amadori产物,抑制其进一步重排[26],从而减少α-二羰基化合物前体物质含量,最终抑制该化合物的生成。Miroliael等[27]报道了柠檬风油精提取物可有效抑制糖基化反应,其中对α-二羰基化合物生成抑制的作用机制可能与自由基清除能力和抗氧化活性有关。红曲色素具有较强的抗氧化活性[28],据此推断,MFP对α-二羰基化合物生成抑制作用与其抗氧化能力有关。

2.1.3 MFP处理对AGEs形成的影响

AGEs主要是由羰基化合物与游离氨基在非酶糖基化反应末期形成的产物。研究表明,AGEs的积累与糖尿病及其并发症的发生与发展密切相关。通过对糖基化末期产物AGEs的测定,考察MFP对糖基化模拟体系中AGEs的抑制效果,实验结果见图3。

由图3可知,随着MFP质量浓度的增大,AGEs生成抑制率逐渐增大,并呈浓度依赖关系。当MFP质量浓度为0.55 mg/mL时,AGEs的生成抑制率为87.80%,与同质量浓度下AG的抑制率(84.80%)无显著性差异。在相同质量浓度下,MFP对非酶糖基化反应末期产物AGEs的形成抑制能力明显强于早期(果糖胺)和中期(α-二羰基化合物),这与Zhou等[29]研究结果类似,表明MFP主要在糖基化反应的最后阶段通过阻碍蛋白质的交联抑制AGEs的形成 [30]。本研究结果表明,MFP可能是一个潜在的末期糖基化抑制剂,更适合在蛋白质非酶糖基化末期阶段发挥作用。

2.2 MFP处理对蛋白羰基和游离巯基含量的影响

2.2.1 MFP处理对蛋白羰基含量的影响

在糖基化反应过程中,蛋白质羰基的形成是蛋白质结构变化表现之一,其含量可反映蛋白质糖基化过程中MFP对氨基酸残基的保护作用[31]。考察了MFP对糖基化蛋白羰基含量的影响,实验结果见图4。

由图4可知,未糖基化BSA羰基质量摩尔浓度较低(2.50 μmol/g),而糖基化BSA羰基质量摩尔浓度显著增加(35.90 μmol/g),表明在糖基化过程中大量羰基形成。随着MFP质量浓度从0.05 mg/mL增大至0.55 mg/mL,糖基化BSA的羰基质量摩尔浓度从32.50 μmol/g减少至28.10 μmol/g,经MFP处理的糖基化BSA羰基质量摩尔浓度(28.10 μmol/g)显著低于(P<0.05)糖基化BSA(35.90 μmol/g),表明MFP能有效保护蛋白质免受自由基攻击,从而减少羰基的形成。但与同质量浓度的阳性对照AG相比,MFP对羰基形成的抑制作用较弱。类似地,Jaseem等[32]研究发现,维生素B9能有效保护蛋白质免受自由基的攻击,能显著降低糖基化过程中羰基的形成,但抑制效果不如AG。

2.2.2 MFP处理对蛋白游离巯基含量的影响

在蛋白糖基化过程中,半胱氨酸残基的巯基易氧化形成二硫键,这可能导致蛋白质聚集和生物活性的改变[22]。采用 DNPH法测定糖基化蛋白质巯基含量的变化,考察了MFP对糖基化蛋白巯基含量的影响,实验结果见图5。

由图5可知,与未糖基化BSA相比,糖基化BSA游离巯基含量显著降低(P<0.05),由3.70 μmol/g减少至2.30 μmol/g。随着MFP质量浓度的增加(由0.05 mg/mL到0.55 mg/mL),游离巯基含量由2.60 μmol/g增大至3.50 μmol/g(P<0.05)。在高质量浓度条件下,MFP组游离巯基含量显著高于同质量浓度AG组(P<0.05),表明MFP能有效抑制巯基氧化且作用强于AG。据报道,稗子酚类物质能有效抑制蛋白糖化过程中巯基氧化,其机制可能与酚类物质的抗氧化活性有关[6],由此推测,MFP抑制巯基氧化机制可能与MFP中的红曲色素抗氧化活性有关。

2.3 MFP对糖基化蛋白氧化产物含量的影响

蛋白质糖基化过程伴随着氧化反应的发生,因而蛋白氧化产物也是蛋白糖基化反应的重要标志物[33],如二酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸,可以借助荧光检测法分别测定其含量,进而计算其生成抑制率,实验结果见图6。由图6可知,随着MFP质量浓度的增加,二酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的生成抑制率不断增大,最大抑制率分别为66.84%和59.37%。当AG质量浓度为0.55 mg/mL时,二酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的生成抑制率分别为88.50%和85.70%,表明MFP对蛋白氧化的保护能力弱于AG,这与Ding等[34]研究齐墩果酸抑制蛋白氧化产物结果相似。

2.4 MFP对BSA糖基化过程中二级结构含量的影响

圆二色光谱法是蛋白质二级结构含量测定的常用方法,可用于分析糖基化过程对BSA二级结构含量的变化。考察了MFP的添加对糖基化BSA二级结构含量的影响,实验结果见图7。由图7可知,未糖基化BSA在波长为208 nm和222 nm附近出现2个负峰,这是蛋白质α-螺旋结构的特征峰,糖基化BSA的圆二色光谱图中负吸收峰强度减小,并伴随着峰位置偏移,说明糖基化后蛋白质二级结构发生了改变。用MFP和AG处理后,糖基化样品蛋白的圆二色光谱信号强度略有恢复。蛋白二级结构含量变化见表1。由表1可知,未糖基化BSA中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量分别为67.60%、4.90%、11.60%和13.80%。糖基化BSA中α-螺旋结构含量降至47.80%,β-折叠结构含量增加至9.90%,β-转角和无规则卷曲结构含量分别增加至14.40%和22.90%。加入MFP和AG后,糖基化BSA的α-螺旋结构含量分别为56.40%和58.30%,表明MFP对糖基化BSA二级结构的保护作用略强于AG。因此,圆二色光谱分析结果进一步证明了MFP可通过保护蛋白质二级结构,即稳定蛋白质天然构象,发挥蛋白糖基化抑制作用。一些研究证实了天然化合物对糖基化蛋白结构的保护作用,如Najjar等[35]研究了姜黄素对糖基化过氧化氢酶二级结构含量的影响,发现在姜黄素存在的条件下,糖基化过氧化氢酶二级结构中的α-螺旋含量显著增加。

2.5 MFP处理对糖基化蛋白交联结构的影响

硫磺素T是一种阳离子苯并噻唑荧光染料,在与淀粉样蛋白纤维结合后,其荧光强度会显著增强,可用于表征糖基化蛋白质的交联和聚集程度[36]。考察了MFP对糖基化蛋白淀粉样β-交联结构形成的抑制效果,实验结果见图8。

由图8可知,随着MFP质量浓度从0.05 mg/mL增加至0.55 mg/mL,糖基化BSA中淀粉样β-交联结构的生成抑制率由1.86%增大至32.39%,表明MFP对糖基化蛋白淀粉样β-交联结构有一定的抑制作用,且随着MFP浓度的增大,抑制效果显著增加(P<0.05)。当MFP质量浓度大于 0.05 mg/mL 时,其抑制率高于AG组。

用荧光显微镜观察ThT染色的蛋白淀粉样β-交联结构,实验结果见图9。由图9(a)可知,未糖基化的BSA图像中没有绿点,因为天然BSA中不存在淀粉样结构。在糖基化BSA[图9(b)]图像中,出现了大而亮的绿色斑块,表明糖基化样品中的蛋白质交联形成淀粉样β-交联结构。添加AG后,绿色斑块和聚集物变小[图9(c)],在MFP存在的情况下绿色斑块含量极少[图9(d)],说明MFP对蛋白质β-交联结构生成的抑制作用强于AG。这与以硫磺素T为荧光探针检测蛋白交联结构的结果一致,表明MFP对糖基化诱导的蛋白淀粉样β-交联结构具有较强的抑制作用。

2.6 MFP处理对糖基化蛋白质表面疏水性的影响

2.6.1 溴酚蓝法

糖基化作用可诱导蛋白质结构的改变,影响疏水性氨基酸暴露情况,进而改变蛋白表面疏水性。蛋白质表面疏水性可通过溴酚蓝结合量表征,溴酚蓝结合量越大,表明蛋白质表面疏水性越高[37]。考察了MFP对糖基化BSA表面疏水性的影响,实验结果见图10。由图10可知,未糖基化BSA与糖基化BSA结合溴酚蓝的量分别为68.40 μg和 47.90 μg, 表明糖基化后BSA的表面疏水性显著降低(P<0.05),这与Xu等[38]的报道一致。当加入阳性对照AG后,溴酚蓝结合量增加,蛋白质表面疏水性升高,表明AG发挥抗糖基化作用,阻碍蛋白结构变化;添加MFP后,溴酚蓝结合量没有增加却继续降低,这一现象也被其他文献报道,如Wu等[39]研究了没食子儿茶素没食子酸盐(GCG)对蛋白质糖基化的影响,发现随着糖基化体系中GCG浓度的增加,溴酚蓝结合量降低,这样的结果似乎与抑制蛋白非酶糖基化作用相矛盾。事实上,我们前期研究表明,脂溶性红曲色素可与BSA疏水区域结合[40],基于此,推测MFP中的红曲色素可能与溴酚蓝竞争性结合蛋白疏水区,因此随着MFP添加量的增加,即使蛋白表面疏水性增加,溴酚蓝结合量仍然减少。

2.6.2 N-苯基-1-萘胺-8-磺酸法

为进一步揭示糖基化蛋白表面疏水性的变化,利用N-苯基-1-萘胺-8-磺酸(ANS)法测定蛋白表面疏水性。ANS是一种典型的疏水性荧光探针,自身荧光强度较弱,但当其与蛋白质的疏水区域结合时,其荧光强度显著增加,可用于检测蛋白质分子疏水区域暴露情况。利用ANS法分析BSA糖基化前后表面疏水性变化情况,实验结果见图11。由图11可知,与ANS作用后,未糖基化BSA的荧光强度最大,糖基化BSA的荧光强度明显减弱,表明糖基化BSA的表面疏水性降低。随着MFP质量浓度的增大,糖基化BSA的荧光强度逐渐降低,预示糖基化BSA表面疏水性降低,这与Sarmah等[41]研究白杨素和木犀草素对糖基化人血清白蛋白表面疏水性影响的结果一致,即随着白杨素和木犀草素浓度的增加,糖基化人血清白蛋白表面疏水性继续降低。同时这与2.6.1中溴酚蓝结合量变化一致。随着AG质量浓度的增大,糖基化BSA的荧光强度逐渐增大,表明AG能够抑制蛋白糖基化程度,阻止其表面疏水性的降低,该结论也与2.6.1中溴酚蓝法测表面疏水性结果一致。

3 结 论

以红曲发酵物(MFP)为研究对象,通过构建BSA-Fru糖基化模拟体系,考察了MFP对蛋白非酶糖基化的抑制作用。研究结果表明,MFP显著抑制了糖基化阶段性产物的生成,在质量浓度为0.55 mg/mL时,MFP对果糖胺、α-二羰基化合物以及AGEs生成抑制率分别为21.50%、47.90%和87.80%;同时MFP因具有抗氧化活性,能有效保护蛋白免受自由基攻击,抑制蛋白巯基氧化,减少蛋白氧化产物的生成,降低糖基化蛋白氧化损伤的程度。此外,MFP可稳定蛋白天然构象,提高糖基化蛋白二级结构中α-螺旋结构含量,同时对糖基化蛋白中淀粉样β-交联结构的形成具有一定的抑制作用。本研究旨在为红曲发酵物抑制蛋白非酶糖基化机制研究提供参考,同时也为红曲高值化开发和利用,以及新型AGEs抑制剂的挖掘开辟新途径。

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Inhibitory Effect of Monascus Fermented Products on Non-Enzymatic Glycation of Proteins

DONG Changyan1, LI Chao2, YANG Benxu3, WU Shufen1,*, WANG Changlu1

(1.College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science &Technology, Tianjin 300457, China; 2.Tianjin Food Group Co. Ltd., Tianjin 300074, China; 3. Tianjin Lida Food Technology Co. Ltd., Tianjin 300393, China)

Abstract：The advanced glycation end products (AGEs) are formed during the non-enzymatic glycation of proteins. Studies have shown that the accumulation of AGEs is closely related to the occurrence and development of diabetes as well as its complications. To investigate the effects of Monascus fermented products (MFP) on protein glycosylation products and their structures, an in vitro simulation system of bovine serum albumin-fructose was constructed. The results demonstrated that MFP exerted an inhibitory effect on the generation of early, intermediate, and end-stage products of protein glycosylation, particularly on the end-stage products, namely AGEs, with the highest inhibition rate (87.80%). As the mass concentration of MFP increased from 0.05 mg/mL to 0.55 mg/mL, the carbonyl content of glycosylated proteins decreased from 32.50 μmol/g to 28.10 μmol/g, while the content of free sulfhydryl increased from 2.60 μmol/g to 3.50 μmol/g. Meanwhile, the detected maximum inhibition rates of protein oxidation products, namely dityrosine and kynurenine, were 66.84% and 59.37%, respectively. These findings suggested that MFP could exert AGEs inhibition by protecting sulfhydryl groups and inhibiting protein oxidation. The contents of α-helical structures in glycosylated proteins were found to be reduced in comparison to those observed in native proteins. However, the addition of MFP resulted in an increase in the contents of α-helical structures. This indicated that MFP might inhibit the generation of AGEs through stabilizing the natural conformation of the protein. The content of amyloid β-crosslinked structures in glycosylated proteins was relatively high, and its content was significantly reduced by the addition of MFP, and with the increase of MFP addition amount, the inhibition rate of amyloid β-crosslinked structure formation gradually increased, demonstrating that MFP could effectively inhibit protein cross-linking and thus block the formation of AGEs. This study provided data support and theoretical basis for the development and utilization of AGEs inhibitors derived from Monascus.

Keywords：protein; non-enzymatic glycosylation; advanced glycation end products; Monascus; inhibition effect

中图分类号：TS201.2; TS202.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300694

文章编号：2095-6002(2025)01-0074-11

引用格式：董昌燕,李超,杨本旭,等. 红曲发酵物抑制蛋白质非酶糖基化作用研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(1):74-84.

DONG Changyan, LI Chao, YANG Benxu, et al. Inhibitory effect of Monascus fermented products on non-enzymatic glycation of proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(1):74-84.

收稿日期：2023-11-20

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(32201956)。

Foundation：Youth Fund of National Natural Science Foundation of China (32201956).

第一作者：董昌燕,女,硕士研究生,研究方向为食品功能因子。

*通信作者：武淑芬,女,副教授,博士,主要从事蛋白质科学与食品功能因子方面的研究。

(责任编辑：叶红波)