高尿酸血症是一种代谢紊乱疾病,由血液中嘌呤类物质代谢增加或体内尿酸排泄受阻引起,是仅次于高血糖、高血压和高脂血症的第四大慢性疾病,预防控制不当可引发痛风[1]。临床研究数据显示,我国居民高尿酸血症患病率为13.3%,患病人数约为1.77亿,其中18～35岁的年轻患者占比近60%[2]。肝脏、肠道、肾脏中的黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO, EC1.17.3.2)是嘌呤代谢的关键酶,以黄嘌呤为中间体,催化次黄嘌呤羟基化生成尿酸[3]。因此,XO抑制剂,如别嘌呤醇和非布司他,是抑制尿酸形成、临床治疗高尿酸血症和痛风的常用药物,但这些药物经常伴有肝肾功能损伤、胃肠道黏膜受损、皮肤过敏等不良反应[4]。近年来,食源性蛋白来源XO抑制肽因安全性高、易吸收、生产成本低等优点而备受关注[5]。目前,国内外研究主要聚焦于酶解乳清蛋白和鱼类蛋白制备XO抑制肽及体外活性评价,而对其作用机制研究较少。蓝圆鲹蛋白和鲨鱼鳍软骨蛋白经中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解,可筛选出具有XO抑制活性(IC50值为0.7～5.0 mmol/L)的四肽(FPSV和FPFP)和五肽(WPDGR和YLDNY)[6-7]。已报道肽段的XO抑制活性远低于别嘌呤醇的XO抑制活性(IC50值为0.05 mmol/L)[8]。因此,食源性蛋白来源的高活性XO抑制肽及其作用机制亟待深入研究。

裙带菜(Undaria pinnatifida)是经济价值很高的大型褐藻,在辽宁、山东和福建等沿海地区大规模栽培[9]。裙带菜营养价值丰富,碳水化合物含量为9.14%,以多糖和粗纤维为主,蛋白质含量为3.03%,含有人体必需的8种氨基酸[10]。我国裙带菜的开发和利用以提取海藻酸钠和碘为主,利用率仅为30%,而大部分裙带菜蛋白作为加工副产物,未得到有效利用,造成资源浪费[9]。裙带菜蛋白经商品蛋白酶水解,肽段ELS、LLAP、YKYY、YNKL、MAGVDHI可有效抑制血管紧张素转化酶、二肽基肽酶-IV和α-淀粉酶活性(IC50值为2.6～64.2 mmol/L),水解物具有降血压、降血糖、抗氧化等多种生理活性[11-12]。裙带菜蛋白氨基酸组成中精氨酸、组氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸占总氨基酸的44%,其中组氨酸和苯丙氨酸含量高于联合国粮食及农业组织要求[10]。研究表明,含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸的肽段能够调节嘌呤分解代谢,抑制尿酸分泌,而苯丙氨酸通过氢键和Pi-Pi堆积作用与XO活性中心结合,抑制XO活性[13]。迄今,裙带菜蛋白及其水解物降尿酸活性的研究尚未见报道。

本研究拟利用商品蛋白酶和自行开发的微生物蛋白酶水解裙带菜蛋白,发掘具有高活性的XO抑制肽,探究其作用机制,以期为提高裙带菜产业附加值和裙带菜蛋白的利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

XO、木瓜蛋白酶,上海源叶生物科技有限公司;黄嘌呤、别嘌呤醇,北京百灵威科技有限公司;裙带菜蛋白,日本香料株式会社;邻苯二甲醛、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)蛋白标准混标(H2899)、HPLC肽标准品混合物(H2016),美国Sigma-Aldrich公司;二硫苏糖醇、硫酸铵、硼酸、硫酸钾、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)等化学试剂均为分析纯,上海麦克林生化科技股份有限公司;毕赤酵母表达的黑曲霉酸性蛋白酶(AnproA1)和米曲霉中性蛋白酶(NP1)[14],中国农业大学中国轻工业食品生物工程重点实验室。

1.2 仪器与设备

UPC-900 KTA型蛋白纯化系统,美国GE Healthcare公司;Z-326K型高速冷冻离心机,德国Hermle公司; 1206 Ⅱ型高效液相色谱仪、1260VWD型紫外检测器,美国Agilent公司;TSK-GEL G2000SWXL型凝胶柱(7.8 mm×300 mm,5 μm),日本TOSOH公司;Kjeltec 8100型凯氏定氮仪,丹麦FOSS公司;XMTD-6000型恒温水浴锅,北京长风仪器仪表公司;TU-1800PC型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;LGJ-10型冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 裙带菜蛋白水解物的酶法制备

配制质量分数为5%的裙带菜蛋白溶液,分别加入1 500 U/g木瓜蛋白酶、AnproA1或NP1,调节酶解反应体系至55℃和pH值为7.5、2.5或8.0,摇床振荡(200 r/min)水解6 h。为了提高水解效率,将木瓜蛋白酶与AnproA1或NP1复配、AnproA1与NP1复配水解裙带菜蛋白,调节至各个蛋白酶的最适温度和pH值,先后分别反应3 h。反应结束后,100 ℃水浴加热10 min灭酶,冷却后离心(10 000 r/min,10 min)取上清液,真空冷冻干燥后将样品于-20 ℃保存。

1.3.2 水解度和蛋白回收率计算

采用邻苯二甲醛法测定水解度(DH)[15]。将Na4B4O7·10H2O(1.905 g)、SDS(40 mg)和邻苯二甲醛(40 mg,另外溶于1 mL甲醇中)溶解于去离子水(30 mL),添加44 mg二硫苏糖醇制成邻苯二甲醛溶液(50 mL)。将裙带菜蛋白水解物溶液(0.1 mg/mL,50 μL)与邻苯二甲醛溶液(400 μL)振荡混匀,反应2 min后,在340 nm处测定吸光值。将丝氨酸溶液(99.91 mg/L,50 μL)和去离子水(50 μL)分别代替裙带菜蛋白水解物溶液,作为标准组和空白组。DH计算方法如式(1)。

(1)

式(1)中,h为水解蛋白相对于原料蛋白的被水解肽键的质量摩尔浓度,mmol/g;htot为原料蛋白肽键的质量摩尔浓度,mmol/g(裙带菜蛋白的htot为7.8 mmol/g)。

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,利用凯氏定氮法测定裙带菜蛋白水解物的蛋白质含量,并根据式(2)计算水解物的蛋白回收率。

蛋白回收率

(2)

式(2)中,m1为水解物的蛋白质质量,mg;m2为原料总蛋白质质量,mg。

1.3.3 XO抑制活性测定

根据Zhang等 [13]的方法稍加修改,测定裙带菜蛋白水解物的XO抑制率。将裙带菜蛋白水解物溶解于磷酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH值为7.5),配制蛋白质量浓度为1 mg/mL水解物溶液。50 μL水解物溶液与150 μL XO溶液(0.05 U/mL)混合,加入150 μL黄嘌呤溶液(0.48 mmol/L),在37 ℃下反应60 min,再加入150 μL盐酸(1 mol/L)终止反应,在290 nm下测定吸光值。以150 μL去离子水替代XO溶液作为空白对照,以50 μL去离子水替代裙带菜蛋白水解物溶液作为阴性对照,以200 μL去离子水替代XO和裙带菜蛋白水解物溶液作为空白阴性对照。XO抑制率计算方法见式(3)。

XO抑制率

(3)

式(3)中,A1为样品吸光值,A2为空白对照吸光值,A3为阴性对照吸光值,A4为空白阴性对照吸光值。

将水解物溶液稀释至不同浓度,测定XO抑制率。以XO抑制率为纵坐标,样品浓度的log值为横坐标,采用GraphPad Prism 8.0进行非线性拟合计算样品的半抑制浓度(IC50)。

1.3.4 分子质量分布测定

使用高效液相色谱法测定裙带菜蛋白水解物的分子质量分布。将质量浓度为1 mg/mL的裙带菜蛋白水解物溶液用0.22 μm滤膜过滤备用。色谱条件:液相色谱柱TSKgel G2000SWxl(7.8 mm×300 mm×5 μm),流动相是质量分数为45%的乙腈溶液(含质量分数为0.1%的三氟乙酸),流速为0.5 mL/min,上样量为25 μL,洗脱时间为40 min,检测波长为214 nm。以核糖核酸酶A、细胞色素C、转铁蛋白、脱辅基肌红蛋白、甘氨酸-酪氨酸、缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸、甲硫氨酸脑咖肽醋酸盐、亮氨酸脑咖肽和血管紧张素II作为标准品,绘制分子质量校正曲线。

1.3.5 裙带菜蛋白水解物的分离和肽段鉴定

裙带菜蛋白经木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解后,将水解物(UP-PA)溶液稀释至1 mg/mL,依次用截留量为10 ku和3 ku超滤膜包(Vivaflow 50)分离,收集分子质量>10 ku、3～10 ku、<3 ku水解物组分,冷冻干燥后测定XO抑制率。采用KTA快速蛋白纯化液相色谱系统联用Sephadex G-15(1 000 mm×12 mm)层析柱分离具有较高XO抑制率的超滤分离组分(<3 ku,5 mg/mL)。上样量为2 mL,洗脱液为磷酸缓冲液(10 mmol/L、pH值7.0),洗脱速度为0.8 mL/min,紫外检测波长为280 nm,收集洗脱液,冷冻干燥后测定XO抑制率。

利用纳米高效液相色谱—质谱联用仪结合Thermo Acclaim PepMap C18色谱柱(75 mm×2 mm×3 μm)鉴定UP-PA中具有较高XO抑制率的色谱分离组分的肽段组成。该组分(0.1 mg/mL)溶于甲酸水溶液(质量分数为0.1%),上样量为7 μL。洗脱液为乙腈溶液(含有0.1%甲酸),以1 mL/min的洗脱速度在65 min内进行线性梯度洗脱(质量分数为1%～35%),通过PEAKS Studio软件分析肽段序列。利用AutoDock Vina软件结合XO抑制肽特征氨基酸序列组成,优选XO抑制肽进行合成(国肽生物科技有限公司),并测定活性。

1.3.6 XO抑制肽的抑制模式和分子对接模拟

采用Lineweaver-Burk方法研究不同肽段和别嘌呤醇对XO的抑制作用类型[16]。不同质量浓度(0～0.5 mg/mL)的肽段分别与XO溶液(0.05 U/mL,150 μL)充分混合5 min(37 ℃)。加入黄嘌呤溶液(0.02～0.20 mmol/L,150 μL),在室温下反应5 min。使用盐酸(1 mol/L,100 μL)终止反应,在290 nm下测定吸光值。计算在不同肽段浓度和底物浓度下吸光值变化率,绘制Lineweaver-Burk双倒数图,判定肽段的抑制作用类型。

利用ChemDraw和Chem3D绘制肽段的二维和三维结构图,通过MM2模块设置三维结构的原子类型和电荷,并进行能量最小化处理。从PDB数据库(Protein Data Bank,https:∥www.rcsb.org/)下载XO(PDB ID: 1FIQ)的晶体结构。利用Pymol对蛋白质晶体进行预处理,加全氢,去除原有配体和水分子。使用AutoDock进行分子对接,控制GridBox大小为70×70×70,网格间距为0.375 Å,每次对接均选择结合能绝对值最大的对接结构,即最稳定结构。以别嘌呤醇与XO相互作用作为阳性对照。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS 20.0软件对实验数据进行分析,每个实验重复3次,数据以平均值±标准差表示。使用ANOVA单因素方差分析和LSD-Duncan检验对数据进行显著性分析,P<0.05表示数据具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶水解裙带菜蛋白制备XO抑制肽结果分析

不同蛋白酶水解裙带菜蛋白的水解度、蛋白回收率、XO抑制率和分子质量分布的结果如表1。裙带菜蛋白不具有XO抑制活性,不同蛋白酶水解裙带菜蛋白有效释放XO抑制活性序列,水解物的XO抑制率具有显著性差异(P<0.05)。由表1可见,裙带菜蛋白经木瓜蛋白酶或AnproA1水解后,分子质量小于3 ku的组分占88.6%～91.3%,XO抑制率为64.9%～67.0%,但蛋白回收率较低,为33.6%～34.4%。由于裙带菜蛋白的NP1水解物中分子质量大于3 ku的组分含量较高(19.8%),其XO抑制率较低(33.1%),但蛋白回收率较高(48.9%)。相比于木瓜蛋白酶和NP1,AnproA1水解裙带菜蛋白的水解度较高。为进一步提高裙带菜蛋白水解物的XO抑制率,利用木瓜蛋白酶、AnproA1和NP1复配水解裙带菜蛋白。蛋白酶复配水解可以显著提高水解物的XO抑制率(P<0.05),其中,木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解裙带菜蛋白的XO抑制率最高(92.1%),分子质量小于3 ku的组分占比最高(95.1%)。木瓜蛋白酶或AnproA1与NP1复配水解裙带菜蛋白,虽然有效释放了XO抑制肽,但分子质量小于3 ku的组分占比较低(82.8%)。因此,后续选用木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解裙带菜蛋白。

表1 不同蛋白酶水解裙带菜蛋白的水解度、蛋白回收率、XO抑制率和分子质量分布
Tab.1 Degree of hydrolysis, protein recovery rate, XO inhibitory activity and molecular weight distribution of Undaria pinnatifida proteins hydrolyzed by different proteases

水解物DH/%蛋白回收率/%XO抑制率/%分子质量分布/%<1ku1～3ku3～5ku5～10ku>10kuUP-P11.7±0.5f34.4±0.5e67.0±0.3d65.425.94.32.61.8UP-A27.9±0.3c33.6±0.3e64.9±0.6e45.742.96.13.02.3UP-N14.4±0.3e48.9±0.0b33.1±0.8f58.222.013.04.72.1UP-PA34.6±0.2b45.8±0.3c92.1±1.0a63.331.81.80.92.2UP-PN16.2±0.2d51.5±0.3a81.5±1.0c50.827.115.44.22.5UP-AN36.4±0.3a39.2±0.3d86.1±0.4b41.346.47.03.51.8

UP为裙带菜蛋白,UP-P为裙带菜蛋白的木瓜蛋白酶水解物,UP-A为裙带菜蛋白的AnproA1水解物,UP-N为裙带菜蛋白的NP1水解物,UP-PA为裙带菜蛋白的木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解物,UP-PN为裙带菜蛋白的木瓜蛋白酶和NP1复配水解物,UP-AN为裙带菜蛋白的AnproA1和NP1复配水解物。同列不同小写上标字母表示不同水解物数据间差异显著(P<0.05)。

木瓜蛋白酶、AnproA1和NP1都是非特异性内切酶,其中,木瓜蛋白酶作用于羧基端含有精氨酸、赖氨酸、甘氨酸等氨基酸残基的肽键[14,17]。He等[4]通过金枪鱼蛋白的碱性蛋白酶水解物饲喂高尿酸血症小鼠,实验发现,水解物中的精氨酸和赖氨酸可以减少黄嘌呤和嘧啶产生,阻碍尿酸结晶。甘氨酸可以与XO活性中心的谷氨酸和苏氨酸残基形成氢键,抑制XO活性。小分子质量蛋白组分(<1 ku)更易被吸收利用,穿过细胞膜进入循环系统,发挥XO抑制活性[13]。因此,裙带菜蛋白经木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解的XO抑制率高于其他蛋白酶水解物。目前,酶解食源性蛋白制备XO抑制肽的研究多采用商品蛋白酶水解鱼类蛋白,如中性蛋白酶复配复合蛋白酶水解马鲛鱼蛋白的XO抑制率为37.5%[18],木瓜蛋白酶水解鲣鱼蛋白的XO抑制率为65.5%[19],中性蛋白酶复配胰酶水解秋刀鱼蛋白的XO抑制率为39.2%[20]。与马鲛鱼蛋白、鲣鱼蛋白、秋刀鱼蛋白等鱼类蛋白相比,裙带菜蛋白含有丰富的碱性氨基酸和苯丙氨酸。采用木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解裙带菜蛋白,增加酶切位点多样性,提高水解效率,释放小分子肽段,特异性切割精氨酸、赖氨酸和甘氨酸,所得水解物的XO抑制率(92.1%)远高于其他鱼类蛋白水解物的XO抑制率(30.9%～65.5%)[4,7,14,17-19]。

2.2 裙带菜蛋白水解物的分离和肽段鉴定结果

裙带菜蛋白水解物经超滤和高效液相色谱分离后,不同组分的XO抑制率的实验结果见图1。由图1(a)可见,裙带菜蛋白经木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解后,水解物经超滤分离,在蛋白质量浓度为1 mg/mL时,分子质量小于3 ku组分的XO抑制率(80.6%)显著高于分子质量为3～10 ku和大于10 ku的组分(P<0.05)。由图1(b)和图1(c)可见,利用高效液相色谱进一步分离分子质量小于3 ku的组分,得到6个组分(F1、F2、F3、F4、F5、F6),各组分的XO抑制率具有显著差异(P<0.05)。在蛋白质量浓度为0.25 mg/mL时,F5组分的XO抑制率最高(72.1%),其次为F4(56.8%)、F6(35.1%)和F3(12.3%),而F1和F2的XO抑制率最低(3.3%)。因此,选取F5组分进行肽段鉴定。经质谱和AHTpin数据库分析,F5组分中存在398条肽段。将这些肽段与XO模拟对接,计算各条肽段与XO的亲和力,即Vina评分,评分越低,表明该条肽段与XO的亲和力越强[21]。从F5组分筛选XO抑制肽的结果见表2。由表2可知,筛选Vina评分最低且尚未报道的5条XO抑制肽,分别为YLGY(IC50=6.9 mmol/L)、VYW(IC50=4.3 mmol/L)、VVSW(IC50=8.8 mmol/L)、TVVW(IC50=2.5 mmol/L)、KVFAW(IC50=6.1 mmol/L)。利用BIOPEP-UWM进一步评价5条肽段的消化稳定性,其中,VYW、VVSW、TVVW经胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟消化后,仍保持完整序列,而YLGY和KVSAW经模拟消化后不具有XO抑制活性。

图(a)中测定XO抑制率的蛋白质量浓度为1 mg/mL,图(c)中测定XO抑制率的蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。不同小写字母表示水解物组分间XO抑制率差异显著(P<0.05)。
图1 裙带菜蛋白的木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解物的分离组分及其XO抑制率
Fig.1 Fractionations of Undaria pinnatifida protein hydrolysate by papain and AnproA1 and their XO inhibitory activities

表2 裙带菜蛋白XO抑制肽的分子质量、Vina评分、抑制活性和消化稳定性
Tab.2 Molecular weights, Vina scores, inhibitory activities and digestive stabilities of XO inhibitory peptides from Undaria pinnatifida proteins hydrolysate

肽段Mw/uVina评分/(kJ·mol-1)IC50/(mmol·L-1)模拟消化后的肽段序列YLGY514.243-6.06.9±0.1bYL、GYVYW466.222-5.74.3±0.0dVYWVVSW489.259-5.18.8±0.4aVVSWTVVW503.274-4.32.5±0.4eTVVWKVFAW649.359-4.16.1±0.1cKVF、AW

不同小写上标字母表示肽段之间的数据差异显著(P<0.05)。

XO抑制肽一般由2～20个氨基酸组成,肽段上的芳香族氨基酸残基,如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,可与XO的疏水活性中心发生Pi-Pi堆积作用和疏水相互作用,抑制XO活性[4]。裙带菜蛋白XO抑制肽YLGY、VYW、VVSW、TVVW和KVFAW的羧基端都为芳香族氨基酸残基,符合XO抑制序列特征。TVVW上的苏氨酸残基与XO活性中心的谷氨酸(Glu879)和苯丙氨酸(Phe1142)发生氢键和Pi-Sigma相互作用,且羧基端或氨基端末端的芳香族氨基酸残基与XO的结合力强于肽段中间位置的芳香族氨基酸残基[13]。因此,TVVW的XO抑制活性显著高于其他肽段。Hu等[7]研究了蓝圆鲹蛋白XO抑制肽的组成特点,酪氨酸与色氨酸组合可以有效提高肽段的XO抑制活性,而色氨酸的吲哚基与别嘌呤醇具有相似的结构特征,可以抑制XO催化活性,降低黄嘌呤和尿酸产生[3]。所以,VYW的XO抑制活性优于KVFAW、YLGY和VVSW。由于YLGY上的酪氨酸极性羟基基团促使肽段远离XO疏水活性中心,改变了肽段的空间构象,阻碍了肽段与XO活性位点结合[4],但甘氨酸残基可与XO活性中心的谷氨酸残基(Glu1261)形成氢键[13],YLGY的XO抑制活性低于TVVW、VYW和KVFAW,但高于VVSW。裙带菜蛋白XO抑制肽YLGY、VYW、VVSW、TVVW和KVFAW的活性(IC50值为2.5～8.8 mmol/L)明显高于其他鱼类蛋白XO抑制肽的活性,例如源于鲣鱼蛋白的WML(IC50=20 mmol/L)[19]和ACECD(IC50=13.4 mmol/L)[15]、源于金枪鱼蛋白的FH(IC50=25.7 mmol/L)[4]。同时,VYW、VVSW和TVVW经模拟消化后仍保持完整序列。

2.3 裙带菜蛋白XO抑制肽的作用机制分析

采用Lineweaver-Burk法分析别嘌呤醇、VVSW、VYW和TVVW对XO酶促反应中Km和Vmax的影响及其抑制类型,分析结果见表3。由表3可知,在无抑制剂时,XO的Km为0.071 mmol/L,Vmax为0.092 U/mL,这与 Ozturk等[22]以黄嘌呤为底物测定牛乳XO的结果相近(Km为0.079 mmol/L,Vmax为0.069 U/mL)。别嘌呤醇存在时,XO催化黄嘌呤生成尿酸反应的Vmax不变,而Km增大至0.438 mmol/L,具有竞争型抑制的特点。所以,别嘌呤醇和黄嘌呤之间竞争结合XO活性位点,这与Li等[3]报道的结果相近(Km为0.500 mmol/L,Vmax为0.100 U/mL)。VVSW使XO的Km和Vmax由0.071 mmol/L和 0.092 U/mL降低至0.023 mmol/L和0.027 U/mL,具有反竞争型抑制作用,说明VVSW不直接与XO活性中心结合,而与黄嘌呤-XO复合物结合,抑制XO活性[23]。在加入VYW时,Vmax明显减小,而Km不变,因此,VYW具有非竞争型抑制的特点,不与黄嘌呤发生竞争关系,但仍与XO的氨基酸残基结合,抑制催化反应[24]。在XO催化黄嘌呤生成尿酸反应中,TVVW可以促使Km增大至0.384 mmol/L,而Vmax保持不变,因此,TVVW表现出竞争型抑制作用。

表3 别嘌呤醇、VYW、VVSW和TVVW对XO酶促反应中Km和Vmax的影响及其抑制类型
Tab.3 Effect and inhibition types of allopurinol, VYW, VVSW, and TVVW on Km and Vmax of XO catalyzed reactions

抑制剂/抑制肽Km/mmol·L-1Vmax/U·mL-1抑制类型无0.0710.092无别嘌呤醇0.4380.092竞争型抑制VYW0.0710.048非竞争型抑制VVSW0.0230.027反竞争型抑制TVVW0.3840.092竞争型抑制

将别嘌呤醇、VVSW、VYW和TVVW与XO进行半柔性对接,在分子水平上,分析VVSW、VYW和TVVW与XO的相互作用机制,分析结果见图2。XO的关键活性中心是一个由氨基酸残基(Phe649、Glu802、His875、Arg880、Glu879、Thr1010、Val1011、Pro1012、Phe1013、Phe1142、Glu1261等)包围的钼结构域,其中Glu802、Arg880和Glu1261是激活该活性结构域的关键残基[25]。由图2(a)可知,别嘌呤醇与XO活性中心的Glu802、Arg880和Thr1010残基通过5个氢键结合,与Val1011残基发生Pi-Sigma相互作用。正如Li等[3]研究报道,别嘌呤醇与XO表现出很强的结合状态。由图2(b)和图2(c)可知,VVSW和VYW分别与Phe1142和Tyr1140残基发生Pi-Sigma相互作用,但VYW上的色氨酸和酪氨酸还与XO活性中心及以外的Phe1142、Val1011、Leu648、Ser876、Pro1012和His875残基通过Pi-Pi堆积作用、Pi-Alkyl作用和氢键结合。XO活性口袋接近蛋白表面,抑制序列部分留在活性口袋外侧,阻止黄嘌呤进入活性中心,抑制XO的催化反应[26]。因此,VYW的XO抑制活性(IC50值为4.3 mmol/L)优于VVSW的XO抑制活性(IC50值为8.8 mmol/L)。由图2(d)可知,TVVW上的色氨酸分别与XO活性中心的Glu802和Val1011残基发生Pi-阴离子和Pi-Alkyl相互作用,从而竞争型抑制XO的催化活性。本研究表明,VYW和TVVW上的色氨酸通过与XO活性中心及以外的位点发生Pi-Sigma、Pi-Pi堆积和Pi-Alkyl相互作用,抑制XO活性。

图2 别嘌呤醇、VVSW、VYW和TVVW与XO分子对接模拟
Fig.2 Molecular docking simulation of allopurinol, VVSW, VYW, and TVVW with XO

3 结 论

本研究利用木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解裙带菜蛋白制备XO抑制肽,研究结果表明,VYW和TVVW肽段(IC50值分别为4.3 mmol/L和2.5 mmol/L)具有较高的XO抑制活性,经胃肠模拟消化后仍保持完整序列。VYW和TVVW肽段上的色氨酸与XO活性中心及以外位点发生Pi-Pi堆积和Pi-Alkyl相互作用,其中,VYW使XO的Vmax降低至0.048 U/mL,而TVVW使XO的Km增加至0.384 mmol/L,分别表现出非竞争型和竞争型抑制作用。本研究表明,木瓜蛋白酶和AnproA1复配水解裙带菜蛋白可作为一种降尿酸的功能食品配料,提高裙带菜利用率。

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Enzymatic Preparation and Inhibitory Mechanism of Xanthine Oxidase Inhibitory Peptides from Undaria pinnatifida Proteins

CHANG Chang1, CHEN Zheyi1, ZHANG Hong1, YAN Qiaojuan2, JIANG Zhengqiang1,*

(1. College of Food Science and Nutritional Engineering/Key Laboratory of Food Bioengineering (China National Light Industry), China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract：Foodborne xanthine oxidase (XO) inhibitory peptides can decrease the production of uric acid via inhibiting the activity of XO, in order to relieve hyperuricemia. Current researches focused on screening XO inhibitory peptides, but their activities were still need to be improved, and the inhibitory mechanisms were not yet clear. Undaria pinnatifida proteins were hydrolyzed by different proteases, and XO inhibitory peptides were screened by chromatographic fractionation and peptide segment identification, of which inhibitory mechanisms were investigated. The combination of papain and Aspergillus niger acid protease (AnproA1) was the best formulation to hydrolyze Undaria pinnatifida proteins with high XO inhibitory activity (92.1%). The hydrolysate was then purified to identify five novel XO inhibitory peptides, including YLGY, VYW, VVSW, TVVW and KVFAW, in which VYW (IC50=4.3 mmol/L) and TVVW (IC50=2.5 mmol/L) showed high XO inhibitory activities. The tryptophan residues on VYW and TVVW formed Pi-Pi stacking and Pi-Alkyl interactions with the active center of XO and other sites, showing non-competitive and competitive inhibitor effect, respectively. XO inhibitory peptides from Undaria pinnatifida protein were prepared by the combination of papain and AnproA1, which would be theoretically and practically important to develop anti-hyperuricemic food ingredients.

Keywords：Undaria pinnatifida protein; Aspergillus niger acid protease; xanthine oxidase inhibitory peptides; inhibitory type; molecular docking

中图分类号：TS252.9

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202400368

文章编号：2095-6002(2025)01-0055-08

引用格式：常畅,陈哲漪,张泓,等. 裙带菜蛋白黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶法制备及作用机制[J]. 食品科学技术学报,2025,43(1):55-62.

CHANG Chang, CHEN Zheyi, ZHANG Hong, et al. Enzymatic preparation and inhibitory mechanism of xanthine oxidase inhibitory peptides from Undaria pinnatifida proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(1):55-62.

收稿日期：2024-06-03

基金项目：国家重点研发计划项目(2022YFD2101403)。

Foundation：National Key Research and Development Program of China (2022YFD2101403).

第一作者：常 畅,女,副教授,博士,主要从事食源性蛋白质的可控生物转化研究。

*通信作者：江正强,男,教授,博士,主要从事食品生物技术研究。

(责任编辑：叶红波)