食源性致病菌引发的食品安全问题备受全球瞩目[1],志贺氏菌和沙门氏菌等食源性致病菌多次牵涉到食品召回和疾病暴发事件中,对食品行业构成严峻挑战[2-3]。因此,迫切需要寻找有效的方法来控制这些病原菌,以降低食品安全风险。

与化学杀菌和加热杀菌等传统杀菌技术相比,光动力灭活(photodynamic inactivation, PDI)凭借安全、高效、低耗能、低成本等优势,展现出巨大潜力[4]。PDI的作用机制是在有氧条件下,将光敏剂暴露在特定波长的光线下诱导产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),ROS对细菌的DNA、RNA、蛋白质和脂质等生物大分子具有高度活性,可对细胞基本结构造成损害,从而导致细菌死亡[4]。

光敏剂的选择对于PDI在食品工业的应用至关重要。姜黄素(curcumin)是一种天然植物色素和食品添加剂,因其低成本和安全性,被广泛用作PDI中的光敏剂[5]。在水产品及果蔬保鲜领域,姜黄素介导的PDI虽展现出一定效果,但存在杀菌效率低、耗时长的问题[5-7]。为解决这些问题,本研究拟以噬菌体为协同剂来提高姜黄素介导的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果。噬菌体是一种能特异性感染细菌的病毒,能在细菌细胞内繁殖并裂解细菌,有效地抑制细菌生长[8-9],且已在多项研究中被证实能减少或清除食品中的目标病原菌,同时保持食品原有风味与色泽[10-12]。张玲等[13]分离鉴定了沙门氏菌烈性噬菌体,并证明该噬菌体在牛奶和鸡肉片中对宿主菌均有一定的抑制效果。张辉等[14]分离了裂解性福氏志贺氏菌噬菌体SF-A2并鉴定了其生物学特性,发现该噬菌体对巴氏杀菌牛奶中的宿主菌具有良好的杀菌能力,为防控食品中福氏志贺氏菌的污染奠定了基础。基于此,本研究探讨噬菌体协同姜黄素介导的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果,并从细胞结构和DNA水平揭示其杀菌机理,旨在为新型非热杀菌技术在食品微生物安全领域的实际应用提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宿主菌志贺氏菌、沙门氏菌及其烈性志贺氏菌噬菌体ZBVPP2、沙门氏菌噬菌体SM-p2,西南大学食品科学学院503实验室筛选分离获得。

姜黄素(纯度98%),重庆高斯贸易有限公司;TSA培养基、LB肉汤培养基,青岛海博生物技术有限公司;琼脂粉、盐酸,重庆朝友生物科技有限公司;全式金DNA提取试剂盒,北京三药科技开发公司;氯化钠、无水乙醇(体积分数95%),重庆市钛兴化工试剂厂;MgSO4·7H2O,成都市科龙化工试剂厂;Tris,北京索莱宝生物技术有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF),重庆金喜鹊科技发展有限责任公司;所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LED蓝光灯(波长420～460 nm,功率10 W),深圳宸华节能照明有限公司;THZ-D型恒温摇床,江苏太仓市实验设备厂;SW-CJ-FD型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;Mill-Q型纯水系统,美国默克密理博公司;U410型超低温冰箱,北京普析通用仪器有限责任公司;5810R型冷冻高速离心机,艾本德生命科学公司;SQP型电子天平,德国赛多利斯有限公司;MX-F型微型涡旋混合仪、DHP-9272型恒温培养箱,上海泸西分析仪器有限公司;YX280A型高压灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;SYNERGY H1酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;Phenom Pro型扫描电子显微镜(SEM),荷兰Phenom World公司;18A10734型化学发光成像系统,佰思恒科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌培养和菌悬液的制备

从-80 ℃超低温冰箱取出志贺氏菌和沙门氏菌,分别划线于TSA琼脂平板并置于37 ℃培养箱孵育16 h。用接种环挑取单菌落于20 mL LB肉汤中,37 ℃、120 r/min摇床孵育16 h。将过夜孵育的菌液在4 ℃、10 000 r/min离心8 min,用SM缓冲液[2.32 g NaCl、0.8 g MgSO4·7H2O和20 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)混匀后用纯水定容至400 mL]洗涤菌液2～3次,使其浓度约为108 CFU/mL。

1.3.2 噬菌体增殖及效价检测

从-80 ℃超低温冰箱取出噬菌体ZBVPP2和SM-p2,分别加入1 mL SM缓冲液进行活化,然后依次加入4 mL过夜培养的宿主菌和20 mL LB肉汤,混匀后37 ℃、120 r/min孵育16 h。将过夜孵育的噬菌体增殖液在4 ℃、10 000 r/min离心8 min,用0.22 μm滤膜将上清液过滤到离心管中,测定噬菌体增殖情况。噬菌体效价采用空斑法测定,取10 μL过滤后的增殖液滴在含有宿主菌的双层板中,倒置于37 ℃培养箱中孵育16 h,第2天进行空斑计数测定其效价。用SM缓冲液洗涤噬菌体2～3次,使其效价约为109 PFU/mL。

1.3.3 姜黄素吸收光谱测定

利用酶标仪在300～700 nm对5、10、50、500 μmol/L的姜黄素溶液进行全波长扫描测定。

1.3.4 光敏剂和光源设置

准确称量0.184 2 g姜黄素粉末,用无水乙醇定容至50 mL,使其终浓度为10 mmol/L,用0.22 μm滤膜对该溶液进行过滤除菌,置于4 ℃避光保存,保存时间不宜超过10 d[15]。实验当天按比例稀释成所需浓度的工作液用于PDI实验。以波长为420～460 nm的LED蓝光灯为光源,照明装置的规格为50 cm×50 cm×50 cm,周围套一层黑色不透明材料,以防止外部光线进入,将96孔板中的样品置于距离光源10 cm的架子上。

1.3.5 噬菌体协同姜黄素介导的PDI处理条件的确定

取100 μL菌液(108 CFU/mL)于棕色离心管中,加入50 μL 10 mmol/L CaCl2后,再分别加入100 μL噬菌体(109 PFU/mL)和100 μL姜黄素溶液,涡旋混匀后在37 ℃孵育15 min[16],记为协同处理组。孵育完成后,取100 μL混合液加入96孔板,置于LED蓝光灯下进行PDI处理。改变姜黄素溶液浓度(5、15、25、50、100 μmol/L)和光照时间(5、10、15、20 min),以确定最佳PDI处理条件。对照组加入100 μL SM缓冲液,噬菌体组加入100 μL噬菌体(109 PFU/mL),姜黄素组加入100 μL优化介导浓度的姜黄素溶液,对照组和噬菌体组无光照。

蓝光照射结束后,立刻从96孔板中取出100 μL的样品,在棕色离心管中进行梯度稀释,取10 μL不同梯度的稀释液滴在TSA平板上,待其干燥后倒置于37 ℃的培养箱中孵育16 h。平板计数以菌落形成单位(CFU/mL)表示。

1.3.6 噬菌体协同姜黄素介导的PDI杀菌机理分析

1.3.6.1 ROS产生能力测定

DPBF是一种用于监测ROS生成的探针,通过检测DPBF在415 nm的吸光度下降情况来表征噬菌体协同姜黄素介导的PDI的ROS产生能力。参考Yue等[17]的方法,将DPBF溶于DMSO中,配制成5 mg/mL的DPBF溶液。将10 μL配制好的DPBF溶液加入2 mL的样品溶液中,用420 nm蓝光每隔2 min照射1次,通过酶标仪测定样品溶液在415 nm处不同时间点的吸收峰强度变化,空白对照为不加任何样品的超纯水。

1.3.6.2 细菌形态变化评估

将1 mL等体积的细菌悬浮液(108 CFU/mL)与协同处理组在24孔板中混合均匀,37 ℃孵育15 min,然后用420 nm蓝光照射20 min,对照组无光照。样品以10 000 r/min离心2 min后,收集细菌沉淀,根据徐先栋等[18]的滤纸包裹法进行SEM样品的制备,样品喷金后置于SEM分析对照组及协同处理组的志贺氏菌和沙门氏菌的形态变化。

1.3.6.3 细菌细胞DNA渗漏测定

根据Liang等[19]的方法测定细菌DNA的损失以评估细胞膜的完整性。分别取100 μL 1.3.5节中4组不同方法处理后的菌悬液,10 000 r/min离心5 min,用0.22 μm滤膜过滤以去除上清液中的细菌及其他杂质。使用酶标仪在260 nm处测定滤液的吸光度,以表征上清液中的DNA含量。

1.3.6.4 细菌细胞DNA的提取

琼脂糖凝胶电泳用于评估细菌细胞DNA的损伤。分别取1 mL 1.3.5节中4组不同方法处理后的菌悬液,使用DNA试剂盒提取细菌DNA。提取物用1%琼脂糖凝胶电泳分离,用溴化乙锭(EB)染色,最后使用化学发光成像系统拍照记录。

1.4 数据处理

利用MS Excel 2019对数据进行统计与整理,Origin 2021软件绘制误差图,SPSS 26.0软件对数据进行单因素ANOVA分析,用Duncan氏法进行多重差异显著性比较(P<0.05为显著差异)。所有实验均重复进行3次。

2 结果与分析

2.1 姜黄素吸收光谱分析及PDI装置设置

图1是姜黄素的吸收光谱。在波长300～700 nm,姜黄素的最大吸收峰在420 nm附近,与董冬丽等[20]研究的姜黄素吸收光谱相似。鉴于此,本研究使用与姜黄素的最大吸收波长相符的LED蓝光灯,以有效激发姜黄素产生PDI作用。图2为本研究自制的PDI装置,包括LED蓝光灯、96孔板和架子。

图1 姜黄素吸收光谱
Fig.1 Absorption spectrum of curcumin

图2 光动力灭活装置
Fig.2 Photodynamic inactivation apparatus

2.2 噬菌体对姜黄素介导的PDI杀菌效果的影响

图3显示了在一定光照时间和姜黄素介导浓度下,噬菌体对姜黄素介导的PDI杀菌效果的影响。与对照组相比,噬菌体组、姜黄素组和协同处理组的菌落总数均呈下降趋势。其中,协同处理组杀菌效果最显著(P<0.05),分别使志贺氏菌和沙门氏菌的菌落总数降低了2.77 lg (CFU/mL)和3.64 lg (CFU/mL),说明添加噬菌体显著增强了姜黄素介导的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的抑制作用,而单独使用噬菌体或姜黄素仅表现出微弱的抑菌活性。曾巧辉等[21]研究发现,姜黄素介导的PDI使即食鸡肉中沙门氏菌的菌落数减少了0.9 lg (CFU/g)。这也进一步证明了,本研究采用噬菌体协同姜黄素介导的PDI可作为有效控制志贺氏菌和沙门氏菌的手段。

不同小写字母表示各组对志贺氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05),不同大写字母表示各组对沙门氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05)。
图3 噬菌体协同姜黄素介导的PDI的杀菌效果
Fig.3 Antibacterial effect of curcumin-mediated PDI combined with phage

2.3 噬菌体协同姜黄素介导的PDI优化条件的确定

评估了不同光照时间对志贺氏菌和沙门氏菌的PDI杀菌效果的影响,结果见图4。与对照组相比,随着光照时间的延长,协同处理组对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果呈增强趋势。这与董冬丽等[20]的研究结果一致,即在光照1、5、10 min的条件下分别PDI处理霍利斯格里蒙特菌(rimontiahollisae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),杀菌效果逐渐增强。当光照时间为20 min时,PDI处理对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果最显著(P<0.05),菌落总数分别降低了0.98 lg (CFU/mL)和2.69 lg (CFU/mL)。因此,确定PDI处理志贺氏菌和沙门氏菌的优化光照时间为20 min。

不同小写字母表示各组对志贺氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05),不同大写字母表示各组对沙门氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05)。
图4 不同光照时间的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果
Fig.4 Antibacterial effect of PDI with different illumination time on Shigella sp. and Salmonella sp.

选择优化光照时间20 min,评估了不同浓度姜黄素介导的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌杀菌效果的影响,结果见图5。与对照组相比,PDI对沙门氏菌的杀菌作用随姜黄素浓度的增加而增强。当姜黄素浓度为100 μmol/L时,PDI处理对沙门氏菌的杀菌效果最显著(P<0.05),菌落总数降低了2.76 lg (CFU/mL);而对志贺氏菌的杀菌效果减弱。Yuan等[22]研究发现,姜黄素浓度增加会使姜黄素分子饱和,由于光学吸收,光穿透力趋于下降。由此可见,姜黄素浓度对PDI处理不同细菌的影响也不一样,姜黄素浓度过高可能会减弱PDI杀菌效果。当姜黄素浓度为50 μmol/L时,PDI处理对志贺氏菌的杀菌效果最好(P<0.05),菌落总数降低了1.65 lg (CFU/mL)。因此,确定PDI处理志贺氏菌和沙门氏菌的优化姜黄素介导浓度分别为50 μmol/L和100 μmol/L。

不同小写字母表示各组对志贺氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05),不同大写字母表示各组对沙门氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05)。
图5 不同姜黄素浓度的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的杀菌效果
Fig.5 Antibacterial effect of PDI with different curcumin concentrations on Shigella sp. and Salmonella sp.

2.4 噬菌体协同姜黄素介导的PDI杀菌机理研究

2.4.1 PDI对细菌ROS产生能力的影响

ROS产生能力是影响PDI杀菌效果的重要指标,而ROS产生能力的强弱可以通过DPBF降解程度高低表征[17]。不同处理组DPBF降解程度变化见图6。由图6(a)和图6(d)可知,不同时间间隔的420 nm蓝光照射下,对照组吸光度未见明显下降,说明DPBF的降解基本不受蓝光照射的影响。相比之下,协同处理组的吸光度呈下降趋势,DPBF表现出明显的降解现象[图6(b)、(c)、(e)、(f)],并随着照射时间的延长,降解程度增加,表明协同处理组在蓝光照射下具有产生ROS的能力。与Yan等[23]的研究对比可知,噬菌体的存在对姜黄素介导的PDI诱导胞外ROS的产生无明显影响。

图6 光照期间噬菌体协同姜黄素介导的PDI对DPBF降解的影响
Fig.6 Effect of curcumin-mediated PDI combined with phage on DPBF degradation during irradiation

2.4.2 PDI对细菌表面形态的影响

通过SEM观察细菌在PDI处理后的形态变化(图7)。未处理的对照组显示出平整光滑的细菌形态[图7(a)和图7(c)]。相比之下,协同处理组的细菌发生形变,出现凹槽和褶皱[图7(b)和图7(d)],部分细菌表现为形状异常和体积变小,表明细菌有受损迹象,可能与细胞内物质渗漏有关。王晓迪等[24]研究了姜黄素协同柠檬酸处理对志贺氏菌的影响,结果显示细胞膜被破坏,导致细菌呈现扁平破损状态。

图7 噬菌体协同姜黄素介导的PDI对细菌细胞形态的影响
Fig.7 Effect of curcumin-mediated PDI combined with phage on bacterial cell morphology

2.4.3 PDI对细菌细胞膜完整性的影响

PDI处理后,细菌的细胞膜被破坏,使菌体内的DNA等生物大分子发生渗漏[25-26]。DNA含量与260 nm处的吸光度成正比,通过对上清液中DNA含量进行测定,能够评估细胞膜的完整性。各处理组DNA渗漏情况见图8。由图8可知,与对照组相比,噬菌体组、姜黄素组和协同处理组的吸光度均有一定程度的上升,这说明PDI处理对膜完整性产生破坏,且渗漏情况与所用的PDI条件相关[15]。协同处理组吸光度上升得尤为显著(P<0.05),志贺氏菌和沙门氏菌的吸光度分别提高了0.117和0.103,表明噬菌体加剧了细菌DNA的渗漏,显著增强了姜黄素介导的PDI效果。

不同小写字母表示各组对志贺氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05),不同大写字母表示各组对沙门氏菌的杀菌效果差异显著(P<0.05)。
图8 噬菌体协同姜黄素介导的PDI对细菌DNA渗漏的影响
Fig.8 Effect of curcumin-mediated PDI combined with phage on bacterial DNA leakage

2.4.4 PDI对细菌DNA损伤的影响

志贺氏菌和沙门氏菌的DNA损伤情况见图9。由图9可知,从对照组中提取的基因组DNA电泳条带亮度强烈,清晰度较高,说明DNA无明显裂解。协同处理组的电泳条带亮度微弱,清晰度降低,表明其基因组DNA发生了显著降解,说明噬菌体促进了由姜黄素介导的PDI处理对细菌DNA的损伤。ROS可以与DNA、脂质、蛋白质等易氧化的底物相互作用产生氧化应激反应,从而抑制细菌生长[27]。董冬丽等[20]观察到姜黄素光动力处理霍利斯格里蒙特菌和溶藻弧菌后,其基因组DNA均被严重损伤。张鹏敏等[28]也观察到ROS诱导了基因组DNA的氧化损伤。

M为marker(5000 bp),泳道1、2、3、4分别为对照组、噬菌体组、姜黄素组和协同处理组。
图9 PDI处理后细菌DNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig.9 DNA agarose gel electrophoresis of PDI-treated bacteria

3 结 论

为了提高PDI杀菌效果,本研究探究了不同光照时间和姜黄素介导浓度的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌的影响,并在优化条件下采用实验室自制的PDI装置,探讨了噬菌体协同姜黄素介导的PDI的杀菌效果及机理。结果表明,噬菌体协同姜黄素介导的PDI对志贺氏菌和沙门氏菌具有良好的杀菌效果,噬菌体增加了细胞膜的通透性,导致细菌基因组DNA渗漏,并伴随DNA显著降解。噬菌体协同姜黄素介导的PDI具有双重抗菌性能,可作为增强光动力杀菌的有效途径,为PDI在食品微生物安全领域中的实际应用提供理论基础。

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Antibacterial Effect and Mechanism of Curcumin Mediated Photodynamic Inactivation Combined with Phage on Foodborne Pathogens

YANG Yuanping, SHI Hui*

(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract：Photodynamic inactivation (PDI) is a new environmentally friendly non-thermal sterilization technology that can effectively inactivate foodborne pathogens. To improve the PDI effect, curcumin was used as a photosensitizer and phage was used as the synergist to investigate the antibacterial effects of PDI with different illumination time and curcumin mediated concentration on Shigella sp. and Salmonella sp.. Plate colony count method was used to evaluate the antibacterial effect of curcumin mediated PDI combined with phage under optimal conditions, and the extracellular reactive oxygen species (ROS) production capacity and intracellular DNA leakage were measured by microplate reader. The morphological changes on the bacterial surface were observed by scanning electron microscopy, and the degree of genomic DNA damage was analyzed by agarose gel electrophoresis, further clarifying the antibacterial mechanism of curcumin mediated PDI combined with phage. The results showed that phage significantly improved the antibacterial effect. When the illumination time was 20 min and the mediated concentration of curcumin was 50 μmol/L and 100 μmol/L, curcumin mediated PDI combined with phage reduced viable bacterial counts of Shigella sp. and Salmonella sp. by 2.77 lg (CFU/mL) and 3.64 lg (CFU/mL), respectively. With the increase in PDI-induced extracellular ROS production, the bacterial growth was significantly inhibited due to the wrinkled bacterial surface morphology, cell membrane disruption leading to DNA leakage and significant DNA degradation. Curcumin mediated PDI combined with phage effectively improved the antibacterial effect on Shigella sp. and Salmonella sp. by inducing ROS production and disrupting cell structure. The research aimed to provide some references for the prevention and control of contamination of foodborne pathogens by PDI.

Keywords：curcumin; phage; photodynamic inactivation; Shigella sp.; Salmonella sp.; antibacterial mechanism

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300652

文章编号：2095-6002(2025)01-0036-08

引用格式：杨园平,石慧.噬菌体协同姜黄素介导的光动力灭活对食源性致病菌的杀菌效果及机理[J]. 食品科学技术学报,2025,43(1):36-43.

YANG Yuanping, SHI Hui. Antibacterial effect and mechanism of curcumin mediated photodynamic inactivation combined with phage on foodborne pathogens[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(1):36-43.

收稿日期：2023-10-23

基金项目：国家自然科学基金资助项目(32072322)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China (32072322).

第一作者：杨园平,女,硕士研究生,研究方向为食品微生物安全。

*通信作者：石 慧,女,教授,博士,主要从事食品微生物安全方面的研究。

(责任编辑：张逸群)