酱香型白酒因酱香浓郁,酒体醇厚,饮后香味持久而广受欢迎[1]。酱香型白酒中的数百种风味化合物主要属于酯类物质,其次是醇类物质、酸类物质[2]。乙酸苯乙酯具有玫瑰花香、蜂蜜香、苹果香等风味特征,对酱香型白酒醇厚的口感具有重要贡献[3]。何东梅等[4]对酱香型轮次基酒中的酯类物质进行分析,发现乙酸苯乙酯虽然含量不高,但是对轮次基酒整体风味的贡献较大,是机械化酱香型轮次基酒的“骨架酯”之一。Xu等[5]对白酒中报道的510种酯类物质进行了总结,发现乙酸苯乙酯对酱香型白酒的风味贡献排到了前10。目前的研究表明,主要的产乙酸苯乙酯的微生物为酵母菌。王晓丹等[6]从酱香白酒酒醅中分离鉴定得到1株产乙酸苯乙酯能力较强的酵母菌Pichia kudriavzevii(P. kudriavzevii),乙酸苯乙酯产量高达12.04%。王莉等[7]从茅台酱香型白酒酒醅中筛选出1株高乳酸耐受性酵母菌P. kudriavzevii,在乳酸含量为40 g/L时产乙酸苯乙酯的能力较强。

微生物是酱香型白酒发酵的核心,复杂的微生物群落之间互相影响、相互制约[8]。白酒风味物质产生的过程本质上也是源自微生物的代谢活动。固态发酵中,酒醅中的微生物可以通过代谢产生多种酶,进而利用淀粉、还原糖等多种大分子生成重要的风味物质,如酒醅中的一些细菌和霉菌通过其胞外酶(淀粉酶、糖化酶和纤维素酶等)对糖化过程起作用[9-10];芽孢杆菌可以分泌多种水解酶,且大曲中接种芽孢杆菌之后,水解酶和风味前体的生产得到改善[11];高温放线菌可以代谢产生各种耐热酶,如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[12];念珠菌、曲霉、根霉和乳酸杆菌参与了酯酶的产生[13]。此外,微生物群落与理化因素(淀粉、水分、酸度、还原糖等)也存在复杂的相互作用[14]。目前,已有学者通过微生物的强化作用,使白酒的品质得到改善。Wang等[15]将异常威克汉姆酵母应用于模拟固态发酵酱香型白酒中,导致微生物群落结构发生了变化,增加了乙酸乙酯和己酸乙酯含量,降低了高级醇的含量;张学林等[16]从清香型白酒大曲中筛选到1株产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母,将其用于酿造白酒后,促进了白酒中β-苯乙醇、苯乙酸乙酯、异丁醇等香气成分的生成,改善了原酒的品质。因此,研究发酵体系中酒醅微生物群落结构、理化指标以及风味物质之间的关系,对揭示影响白酒品质的关键因素有重要作用。

本研究旨在从北方地区酱香型白酒酿造过程的酒醅样品中筛选鉴定出高产乙酸苯乙酯的微生物,并采用模拟固态发酵的方法,探究高产乙酸苯乙酯菌株在酱香型白酒生产中的应用,旨在拓展微生物菌种多样性,并为菌株在提高酱香型白酒和其他发酵食品中乙酸苯乙酯含量和风味研究提供理论依据。此外,本研究拟对发酵酒醅的理化指标、风味物质及微生物群落结构进行分析,并通过相关性分析研究高产乙酸苯乙酯菌株在白酒生产中的潜在作用,希望为研究酱香型白酒风格地域性差异的内在机制提供一定参考,同时为后续的菌株改造、乙酸苯乙酯的合成途径和调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱酒醅,北京华都酿酒食品有限公司;胰蛋白胨、葡萄糖(分析纯)、酵母浸粉、琼脂粉,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;耐高温α-淀粉酶(分析纯),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;糖化酶,上海源叶生物科技有限公司;DNA试剂盒,北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为国产生物或分析纯试剂。YPD培养基(g/L):酵母浸粉10,蛋白胨20,葡萄糖20(固体培养基添加20 g/L的琼脂粉),115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

YQX-SG46-280S型高压蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;DPHS-3C型pH计,上海精密科学仪器有限公司;TENSUC型恒温摇床,上海天呈实验仪器制造有限公司;TU-19型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;CKX41-F32FL型倒置荧光显微镜,日本Olympus公司;DYY-6C型电泳仪,北京市六一仪器厂;T professional型PCR仪,德国Biometra公司;TSQTM 8000 evo型三重四极杆气质联用仪(GC-MS),美国 Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母菌的筛选和分离

将5 g混匀的酒醅装入三角瓶中,加入45 mL无菌生理盐水,常温震荡30 min,吸取上清液稀释为10-5、10-6的梯度菌悬液。取200 μL稀释菌液涂布于YPD固体培养基表面,30 ℃培养48 h,挑取具有酵母菌菌落特征的单菌落,转接到新的YPD固体培养基上,再次划线培养直至完全纯化,转入斜面培养基中低温保存[17-18]。

1.3.2 高产乙酸苯乙酯酵母菌的筛选

将分离出的酵母菌接种于高粱培养基[18]中,在30 ℃、180 r/min下培养48 h。取适量发酵液,在4 ℃、1 000 r/min离心10 min,吸取5 mL发酵液于进样瓶,加入2 g NaCl,5 μL 4-辛醇(0.5 g/L,内标),加盖密封备用。80 ℃水浴30 min平衡样品,将萃取头插入顶空瓶中吸附30 min,将萃取头移入气相色谱的高温汽化室中解析5 min,进行GC-MS分析。

1.3.2.1 气相色谱条件

DB-WAX型毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);进样模式:不分流进样。升温程序:40 ℃保持3 min,以2 ℃/min的速率升至100 ℃,保持5 min;再以2 ℃/min升至150 ℃,稳定3 min;最后以10 ℃/min升至280 ℃,稳定6 min。进样口温度250 ℃,传输线温度280 ℃,载气He(体积分数大于99.999%),载气流速1 mL/min。

1.3.2.2 质谱条件

离子源为EI源,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃,进样口温度250 ℃,质量扫描范围m/z 35～400 u。

1.3.2.3 定性定量方法

挥发性化合物的鉴定通过与NIST 11谱库中的标准质谱进行对比。采用内标法,根据挥发性物质的峰面积与4-辛醇的峰面积及含量进行计算,得出各挥发性物质的含量。

1.3.3 产乙酸苯乙酯酵母菌的鉴定

对菌株进行革兰氏染色,光学显微镜下观察其形态及染色特征,同时观察电镜下菌株的形态,并对筛选得到的产乙酸苯乙酯酵母菌进行分子生物学鉴定,其中分子生物学鉴定的引物为NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′),具体方法参照Fan等[19]的方法。

1.3.4 高产乙酸苯乙酯酵母菌模拟固态发酵

1)原料准备。称取800 g高粱,粉碎至整粒与碎粒质量比为8∶2。2)润粮。加水浸泡,润粮水温控制在90 ℃左右,润粮总用水量约为原料质量的50%～56%,润粮时间24 h。3)高粱蒸煮。平铺200 g稻壳,再将粉碎后的高粱铺好,蒸1.5 h,约有70%的原料蒸熟,即可出甑,出甑后再泼上占原料质量12%的85 ℃的热水。4)摊晾和拌曲。将蒸好的高粱铺在地上,当温度冷却到32 ℃左右加入占原料质量10%的大曲粉。5)高温堆积。将大曲粉混合均匀,冷却至30 ℃,堆积约72 h。6)加菌。将活化好的酵母离心,收集菌体沉淀,加入生理盐水重悬制备酵母菌悬液,以1×106 CFU/mL混入样品中[15],以生理盐水作为空白对照。7)发酵。入坛发酵,将发酵罐置于设定温度为30 ℃的恒温培养箱中发酵30 d,设置对照组(A组,未添加高产乙酸苯乙酯酵母菌)及实验组(B组,添加高产乙酸苯乙酯酵母菌)。8)取样。在0、6、12、18、24、30 d 取样,分别记为A0～A30组和B0～B30组,分析样品理化指标、挥发性风味物质及微生物多样性的变化。

1.3.5 酒醅理化特性分析

酒醅理化指标的测定方法参照T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》[20],测定发酵酒醅的水分含量、酸度、淀粉含量以及还原糖含量。

1.3.6 酒醅挥发性成分分析

称取5 g酒醅样品,加20 mL无菌生理盐水,充分振荡后在冰浴中进行超声处理,然后4 ℃、1 000 r/min离心 5 min。在顶空瓶中加入8 mL上清液、3 g NaCl及6 μL 4-辛醇(0.5 g/L,内标),进行GC-MS分析。

1.3.7 微生物群落结构分析

按照Zhang等[21]的方法,使用强力土壤DNA提取试剂盒从处理过的样品中提取酒醅基因组DNA,然后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳,检查DNA质量。利用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因V3～V4高变区,对细菌群落进行分析。引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCG-ATGC-3′)用于扩增18S rRNA区域,分析真菌群落。将纯化的扩增产物等分子质量汇集在Illumina MiSeq PE300平台/NovaSeq PE250平台上,并按照标准方案进行配对端测序。用QIIME对原始序列进行处理。对无法组装的序列进行修剪,使用UCHIME去除嵌合序列。选择序列比对工具对获得的序列按97%的相似度进行聚类和OTU划分,对α多样性指数进行统计,利用共现网络预测和可视化样品中微生物群落分布。

1.4 数据处理

所有测定平行进行3次,结果表示为平均值±标准偏差。统计分析均采用SPSS 26.0,P<0.05表示数据之间有显著差异,P<0.01表示数据之间有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 高产乙酸苯乙酯酵母菌的筛选结果

通过经典的平板稀释涂布法从北京某酱香型酒厂的酒醅中筛选出9株生长状态良好的酵母菌,命名为X-1、X-2、X-3、X-4、X-5、X-6、X-7、X-8、X-9,并测定了9株酵母菌发酵液中的风味物质乙酸苯乙酯质量浓度,见图1。酵母菌X-8和X-9的乙酸苯乙酯质量浓度分别可达到1.13 mg/L和1.04 mg/L。因此,将乙酸苯乙酯产量更高的酵母X-8确定为本研究的目标菌株。

2.2 酵母菌X-8的鉴定结果

2.2.1 酵母菌X-8形态鉴定结果

酵母菌X-8在鉴别培养基30 ℃恒温培养48 h后的菌落形态以及扫描电子显微镜结果见图2。单菌落为圆形,呈乳白色,表面凸起,质地黏稠,边缘不规整,表面不光滑,显微镜下的细胞形态,呈棒状或椭圆状,一端芽殖,呈现酵母菌的典型形态特征。

2.2.2 酵母菌X-8分子生物学鉴定结果

将菌株测序所得序列与NCBI数据库进行比对,选择模式物种进行建树分析,见图3。由图3可以看出,酵母菌X-8与 KP132505.1 Pichia kudriavzevii strain CNRMA8.175亲缘关系最近。结合形态学观察及分子生物学鉴定,最终确定X-8为P. kudriavzevii,将其命名为P. kudriavzevii X-8。

2.3 P. kudriavzevii X-8强化发酵对酒醅理化指标的影响

对发酵过程中酒醅理化指标的动态变化进行分析,结果见图4。发酵过程中,A、B组酒醅的酸度整体呈上升趋势,但二者没有明显差异。发酵6 d时酸度大幅上升,可能此时产酸菌大量繁殖,产生大量的酸类物质;发酵12～30 d,2组酒醅的酸度平稳增长。2组酒醅的还原糖质量分数整体呈波动下降的趋势,在发酵过程中二者差异较小。发酵0～12 d,2组酒醅的还原糖质量分数大幅下降,可能是由于酵母菌大量繁殖,利用酒醅中的还原糖;发酵18～30 d,2组酒醅样品的还原糖质量分数先上升后下降,可能是淀粉被分解,生成了还原糖,还原糖继续被消耗,形成了动态变化。A、B组酒醅的淀粉质量分数整体呈下降趋势。发酵0～18 d,2组酒醅的淀粉质量分数大幅下降,可能是由于酒醅中利用淀粉的微生物大量繁殖;发酵24～30 d,2组酒醅的淀粉质量分数下降较为缓慢,可能是发酵过程中酸度逐渐升高,抑制了部分微生物的活动。2组酒醅的水质量分数整体呈上升趋势,发酵30 d时,A、B组酒醅的水质量分数存在显著性差异,可能是因为B组酒醅中微生物生长繁殖代谢较快。

2.4 P. kudriavzevii X-8强化发酵对酒醅挥发性化合物的影响

A、B组酒醅中检测到的挥发性化合物含量见表1。酯类是白酒中含量最多的挥发性化合物,且其气味阈值低,具有协同作用,是白酒香气的主要贡献者,含量的微小变化就会对白酒风味产生显著影响[22]。在整个发酵过程中,A、B组酒醅的总酯含量呈现出先增加后减少的总体趋势且A、B组的酯类变化存在一定的差异。乙酸苯乙酯是一种重要的香味成分,发酵30 d,B组酒醅中乙酸苯乙酯的质量比(0.214 μg/g)高于A组(0.121 μg/g)。乙酸乙酯具有梨香和香蕉香,是白酒中最常见的风味成分之一[23],本研究中B组的乙酸乙酯含量高于A组。己酸乙酯会产生类似菠萝的气味,并且有一种甜美、清新和收敛的味道,被认为是高质量浓郁白酒的特征[24],B组中的己酸乙酯的含量约为A组的2倍。在B组中还检测到具有水果香气的乙酸异戊酯和庚酸乙酯。

白酒中98%～99%的成分都是水和乙醇,乙醇含量决定了白酒的产量。在发酵过程中,B组的乙醇含量高于A组。导致乙醇产量增加的一些机制包括改变生物量合成、酿酒酵母生物量或活力的增强和/或发酵过程中微生物群结构和相互作用的改变引起的代谢的替代调节[25]。高级醇虽然是酵母菌发酵过程的主要代谢副产物,但在塑造酒的风味、增强酒的丰满度和厚重感方面起着重要作用,它们不仅本身呈现出香气和味道,而且是白酒中甜味剂和增味剂的主要来源[26-27]。在发酵过程中,B组的异戊醇含量高于A组,此外,A组中正己醇和苯甲醇的含量高于B组。这可能是由于加入P. kudriavzevii X-8后,代谢途径的改变促进了高级醇转化为其他风味物质。

酸类物质主要影响白酒的口感和后味,起到呈香、助香、减少刺激和缓冲平衡的作用,在发酵过程中由细菌代谢产生。研究发现,高沸点的酸是酱香型白酒的主要风味物质[28]。乙酸是酱香型白酒中含量最高的挥发性有机酸,它是合成乙酸乙酯的前体物质,可以通过酯化作用转化为乙酸乙酯[29]。在发酵过程中,B组酒醅中乙酸、己酸和α-(1-羟乙基)-苯丙酸的含量都略高于A组。

近年来,吡嗪类物质被认为是关键酱香风味物质,2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪被认为是主要的调味物质[30],在A、B组酒醅中检测到了3种吡嗪类物质。酚类化合物是天然的抗氧化剂,由于其可能对人类健康产生有益影响,在白酒生产中引起了相当大的关注[31],而且它们可以赋予酱香型白酒独特的风味和口感,在2组酒醅中均检测到了愈创木酚(芳香、烘烤香)、4-乙基愈创木酚(丁香花香)、对乙烯基愈创木酚(强烈香辛料味、丁香花香和发酵香味)和4-乙基苯酚(木酚味),且它们在B组酒醅中的含量均高于A组。

2.5 P. kudriavzevii X-8强化发酵对酒醅微生物群落结构的影响

2组酒醅平均回收了2 732 671个有效16S rRNA细菌序列和3 287 916个有效18S rRNA真菌序列,在97%的同源性水平上分别聚为343、235个OTUs(表2)。由表2可知,细菌和真菌序列的覆盖率几乎为100%,说明测序深度达到要求。B组酒醅的细菌群落丰度高于A组;在发酵前期,B组酒醅的细菌多样性较高,而在发酵后期,A组的细菌多样性较高。在发酵过程中,在固态发酵中加入P. kudriavzevii X-8后,真菌群落的多样性增加。这些结果表明,通过接种P. kudriavzevii提高了固态发酵过程中的微生物丰度。

A、B组酒醅样品微生物群落的主成分分析见图5。发酵0 d,A、B组中微生物群落组成相似;发酵6～18 d,B组样品微生物群落组成与A组存在一定差异;发酵24～30 d,B组细菌群落组成与A组无明显差异,而2组样品的真菌微生物群落存在一定差异,可能是B组在发酵过程中P. kudriavzevii X-8大量繁殖,影响了其他微生物的生长。

A、B组发酵过程中细菌群落结构随时间的变化如图6。2组样品的优势细菌门均为Firmicutes,其次为Proteobacteria。研究发现,Proteobacteria和Firmicutes也是酱香白酒和浓香白酒的优势菌[32-33]。在属水平上,A、B组酒醅中分别检测出125个和154个细菌属,共有的优势细菌属(在某时间段相对丰度达10%以上)为Lactobacillus、Pediococcus、Cronobacter、Klebsiella,而B组特有的优势细菌属为Weissella。发酵0～18 d,B组中Lactobacillus丰度小于A组,Pediococcus的丰度高于A组,可能是P. kudriavzevii X-8的加入对细菌的群落结构产生影响,尤其是对Lactobacillus和Pediococcus有较大影响。在发酵后期优势细菌微生物不断富集,细菌群落结构趋于稳定。

A、B组发酵过程中真菌群落结构随时间变化如图7。门水平上,真菌群落组成无明显差异,优势真菌门均为Ascomycota。属水平上,A、B组酒醅中分别检测出88个和113个真菌属。2组酒醅的主要优势真菌属相似,但优势属所占比例不同,A组的优势真菌属为Saccharomycopsis、Saccharomyces、Thermomyces、Byssochlamys,而B组的优势真菌属为Saccharomycopsis、Pichia、Saccharomyces、Thermomyces和Byssochlamys。与其他研究结果相似,生物增强后,微生物群落结构发生了变化[34]。在发酵6～30 d,2组样品的真菌群落组成差异较大,B组酒醅样品中Saccharomycopsis和Saccharomyces的相对丰度小于A组,而B组中Pichia在发酵6d时相对丰度达到43.86%,推测Pichia与Saccharomycopsis和Saccharomyces之间可能存在生长相互抑制关系。

2.6 理化和微生物因素对酒醅微生物群落结构的影响

不同发酵时间酒醅的微生物群落结构受物理化学因素和微生物因素的显著影响,酒醅细菌属和真菌属与理化指标的冗余分析(redundancy analysis, RDA)见图8。在理化因素方面,A组中酒醅的水质量分数及酸度与细菌属Bacillus、Lacotobacillus和真菌属Hyphopichia、Torulaspora等呈极显著的正相关关系,酒醅的淀粉及还原糖质量分数与细菌属Pediococcus、Klebsiella和真菌属Thermomyces、Aspergillus、Thermoascus呈极显著的正相关关系。据报道,Thermomyces和Thermoascus这2种嗜热真菌都能产生大量用于碳水化合物降解的嗜热酶[35],而乳酸菌属可以产生供酵母菌酯化的乳酸,并影响微生物群落结构。与A组相比,B组理化指标与细菌群落的相关性减弱。B组中酒醅的水质量分数及酸度与真菌群落的正相关性增强,而淀粉及还原糖质量分数与真菌群落的正相关性减弱。

为考察微生物因素对微生物群落结构的影响,对A、B组相对丰度排名前20的细菌属与真菌属进行了网络分析,如图9。在细菌属水平上,A组中的核心节点为Bacillus,连接了17个细菌属;Lactobacillus作为相对丰度占比最大的细菌属,连接了16个细菌属,与8个属呈负相关,这主要是因为Lactobacillus产生的乳酸盐和细菌素(如乳链菌素和儿茶素)可以抑制某些微生物的生长和代谢[36]。B组中的核心节点为Klebsiella,连接了17个细菌属,Bacillus没有很大的变化,但是Lactobacillus与其他细菌的相互作用降低。真菌属水平上,A组的核心节点为Aspergillus,连接了10个真菌属;B组的核心节点为Wickerhamomyces、Thermomyces和Pichia,都连接了9个真菌属,其中Pichia与Kazachstania呈正相关,与8个真菌属呈负相关,说明P. kudriavzevii X-8的加入对其他真菌属影响较大,可能抑制了其他细菌或真菌的活性。与对照样本A组相比,B组的微生物关联性有所变化,即Pichia的加入改变了微生物区系的网络结构和相互关系,这可能就是造成白酒风味成分发生变化的原因。

2.7 微生物核心群落与挥发性化合物相关性分析

本研究发现,同一发酵时间不同发酵组的挥发性化合物种类和含量均存在差异,原因可能是由于P. kudriavzevii X-8的加入引起微生物区系的变化,从而导致微生物群落代谢和不同风味物质之间的化学反应。对A、B组相对丰度排名前20的细菌属和真菌属与文献中报道的对酱香型白酒具有重要影响的挥发性化合物进行了相关性分析,见图10。从图10 可以看出,A组中Bacillus和Virgibacillus与一些酯,如正己酸乙酯和辛酸乙酯等的产生呈正相关,是因为芽孢杆菌能分泌许多酶,产生多种风味物质,并具有良好的环境耐受性[37]。Kroppenstedtia与正己酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸苯乙酯等酯类物质含量呈正相关。B组中Weissella与癸酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯含量呈正相关。先前也有研究表明,Weissella与乳酸乙酯等乙酯类物质含量呈正相关[38]。研究发现Oceanobacillus是北京地区酱香型白酒发酵中独有的优势细菌属,该菌属在白酒酿造中的作用及对白酒风味的贡献尚不清晰,本研究中Oceanobacillus与苯乙酸乙酯、4-乙基苯酚和乙酸苯乙酯等含量呈正相关关系。B组中加入P. kudriavzevii X-8后,乙酸苯乙酯、乙酸乙酯等风味物质含量与细菌属的相关性减弱。

B组中Pichia与苯乙醇、乙酸苯乙酯、愈创木酚、对乙烯基愈创木酚含量的正相关性增强。Aspergillus与苯乙醇、壬酸乙酯含量呈负相关。Thermomyces与正己酸乙酯、辛酸乙酯和壬酸乙酯等含量呈负相关。Saccharomycopsis与对乙烯基愈创木酚含量呈负相关。Wickerhamomyces、Leiothecium、Torulaspora、Saccharomyces除了与2,3,5,6-四甲基吡嗪含量呈负相关外,与其他绝大多数风味化合物含量都呈正相关关系。Mucor与乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等含量呈正相关,Hyphopichia、Saccharomyces、Diutina与其相似。先前的研究表明,Pichia在所有类型的白酒发酵过程中都被认为能产生大量的乙醇、有机酸和酯[39]。B组中加入P. kudriavzevii X-8后,乙酸苯乙酯含量与Pichia正相关性增强,油酸乙酯、棕榈酸乙酯、4-乙基愈创木酚、乙醇含量与真菌属的正相关性增强;乙酸乙酯、壬酸乙酯、4-乙基苯酚含量与真菌属的正相关性减弱;异戊醇、苯乙醇、己酸含量与真菌属微生物的正、负相关性减弱,对乙烯基愈创木酚含量与Pichia正相关性增强。

3 结 论

本研究通过经典的微生物筛选方法,从北方地区的酱香型白酒样品中鉴定出1株高产乙酸苯乙酯的酵母菌P. kudriavzevii X-8,并将其应用于模拟固态发酵实验,分析发酵过程中酒醅的风味物质、微生物多样性和理化指标的变化,并分析其相关性。加入P. kudriavzevii X-8对酒醅的理化指标影响不大,引起了微生物群落结构的变化,增加了乙酸苯乙酯及其他重要风味物质的含量,最终提升了白酒品质。

乙酸苯乙酯是酱香型白酒的重要风味物质,在酱香型白酒酿造过程中筛选出高产乙酸苯乙酯的微生物,并应用于酱香型白酒的发酵过程,对提高酱香型白酒的风味和质量具有重要意义,同时也可为功能菌种在酱香型白酒发酵中的实际应用提供一定的理论参考。

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Effect of Biofortification with Pichia kudriavzevii on Community Structure and Volatile Flavour Fractions of Fermented Grains of Sauce-Aroma Baijiu

NI Bingqian1,2,3, XIA Hanshuo2,4, MIN Weihong5, ZHU Hua6, WANG Kun6, LI Weiwei1,2,3, LI Xiuting1,2,3,*, ZHANG Chengnan1,2,3

(1.School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3.Key Laboratory of Liquor-Making Microbe and Enzyme Molecular Engineering, China General Chamber of Commerce, Beijing 100048, China; 4.School of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 5.School of Food and Health, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Hangzhou 311300, China;6.Beijing Huadu Liquor-Making &Food Co. Ltd., Beijing 102212, China)

Abstract：Phenethyl acetate has flavour characteristic of rose, honey and apple, etc., and is an important flavour substance of sauce-aroma Baijiu. The screening and fermentation application of high-yielding phenethyl acetate yeast is important for improving the flavour and quality of sauce-aroma Baijiu. In this study, a strain of Pichiakudriavzevii X-8 with relatively high yield of phenethyl acetate was screened from the fermented grains samples of the brewing process of sauce-aroma Baijiu and applied to simulated fermentation experiments. The results showed that 66 and 72 volatile compounds were present in group A (without strain P.kudriavzevii X-8) and group B (with strain P.kudriavzevii X-8), respectively. The types and contents of esters, alcohols, acids and other flavor substances in group B were higher than those in group A. After 30 d of fermentation, the content of phenethyl acetate in group B (0.214 μg/g) was approximately twice that of group A (0.121 μg/g). The dominant genera in group B were Weissella and Pichia, and there were also differences in the abundance of Lactobacillus and Pediococcus, Saccharomycopsis and Saccharomyces in the two groups. The addition of Pichiakudriavzevii X-8 had little effect on the physicochemical properties of the fermented grains, but enhanced the correlation of water content, acidity and flavour substances with fungal microorganisms, and increased the content of phenylethyl acetate and other important flavour substances. The results of the study were aimed to provide theoretical references for the quality improvement of sauce-aroma Baijiu and the practical application of functional strains in sauce-aroma Baijiu.

Keywords：sauce-aroma Baijiu; biofortification; phenylethyl acetate; volatile flavour compounds; microbial community; correlation analysis

中图分类号：TS262.3

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300115

文章编号：2095-6002(2024)02-0093-16

引用格式：倪冰倩, 夏韩硕, 闵伟红, 等. Pichia kudriavzevii生物强化对酱香型白酒酒醅微生物群落结构及挥发性风味组分的影响[J]. 食品科学技术学报,2024,42(2):93-108. NI Bingqian, XIA Hanshuo, MIN Weihong, et al. Effect of biofortification with Pichia kudriavzevii on community structure and volatile flavour fractions of fermented grains of sauce-aroma Baijiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(2):93-108.

收稿日期：2023-02-25

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31830069); 国家重点研发计划项目(2022YFD2101401)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China(31830069); National Key Research and Development Program of China(2022YFD2101401).

第一作者：倪冰倩,女,硕士研究生,研究方向为微生物与酶工程。

*通信作者：李秀婷,女,教授,博士,主要从事微生物与酶工程方面的研究。

(责任编辑：张逸群)