多依(Docynia delavayi)是蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)栘属(Docynia)云南栘 [Docynia delavayi(Franch.)Schneid.]的果实,又称云南栘、云南多衣、酸多李皮、桃桋桋、酸苹果。多依果富含多酚类物质,具优越的抗氧化能力、抑菌及抗肿瘤活性等[1-2]。因富含多酚类物质、有机酸和膳食纤维,多依口感酸涩、果肉粗糙,不宜鲜食,适合榨汁[3]或酿酒[4]。工业上多依鲜果经榨汁、杀青及浓缩等工序制成浓缩果汁后,进行贮藏、运输及后加工,使用时常稀释成复原果汁或制成饮料、果糕食品等。浊汁型多依复原果汁在后加工过程中容易发生沉淀及非酶褐变等问题。多依果汁饮料虽可使用明胶脱涩、亚硫酸盐护色、羧甲基纤维素稳定[3],但存在活性成分被破坏及风味改变的缺点。因此,生产过程中如何恰当地使用处理技术,使多依复原果汁可以兼顾丰富的活性酚类组成、贮藏稳定性及受欢迎的外观等因素成为十分有意义的研究课题。

针对浊汁型果汁的沉淀与混浊问题,最常用的澄清化处理方法是先促沉淀后离心或过滤去除易沉淀物,促沉淀方法有:冷沉淀[5]、添加Ca2+沉淀剂[5]、添加多糖胶体(甲壳素[6-7]、果胶[8]等)。而加工果汁的非酶褐变的控制则针对关键组成(总酚类或黄酮类、糖类或维生素C等)[9]加以处理。多酚类引起的非酶褐变速率可利用贮藏条件、pH值及食品配方因子[10]等调控。若能利用特定多糖胶体以优化多依果汁[1-2]的外观品质、降低非酶褐变、保留果汁中的活性组成,更具应用价值,但目前鲜有相关研究报道。

本研究旨在探讨特定的多糖胶体对浊汁型多依复原果汁的混浊度、色泽与非酶褐变动力学参数的影响,阐明总酚含量对果汁重要质量指标的贡献关系,鉴定褐变关键酚组成的转变,确定较佳胶体处理条件和抑制非酶褐变的机理。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

多依浓缩果汁是鲜榨多依果汁经巴氏杀菌(75～80 ℃,10～15 s)、80 ℃下瞬时减压浓缩成3倍浓缩汁(获得的浓缩果汁的多酚氧化酶已被灭活),冷冻备用。

罗望子多糖(tamarind seed polysaccharide, TSP),云南猫哆哩集团食品有限责任公司;苹果高甲氧基果胶(apple high-methoxyl pectin,AHP)、壳聚糖(chitosan, CTS)、瓜尔胶(guar gum, GG)、维生素C、福林酚、无水碳酸钠、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH),均为分析纯,上海源叶生物科技有限公司;柑桔高甲氧基果胶(citrus high-methoxyl pectin, CHP)、柑桔低甲氧基果胶(citrus low-methoxyl pectin, CLP),美国CP Kelco公司;槲皮素-3-O-葡萄糖苷,色谱纯,上海同田生物科技有限公司;甲醇,色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司;绿原酸(色谱纯)、根皮苷(色谱纯)、无水乙醇(分析纯)、乙酸(分析纯),上海阿达玛斯试剂有限公司;2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS],分析纯,Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Avanti JXN-26型冷冻离心机,美国贝克曼库尔特有限公司;725型紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;pH计,瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司;ATOGO PAL-1(NFC)型数显糖度仪,日本ATOGO公司;CR-400型色差仪,日本Konica公司;Waters e2695型高效液相色谱、Acquity I-class型超高效液相色谱、VION型离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪,沃特世(上海)科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 果汁的胶体处理方法

多依浓缩果汁解冻后,混合均匀,加入0.5倍质量的去离子水预稀释,得半浓缩果汁(可溶性固形物含量为38%,为复原果汁可溶性固形物含量的2.0倍),将半浓缩汁分装于15 mL螺盖的玻璃试管中(每管5 mL),分别加入等体积的去离子水(空白组)、0.6%～1.0%(质量分数)AHP、0.6%～1.4%(质量分数)CHP、0.6%～1.4%(质量分数)CLP、0.6%～1.4%(质量分数)GG、0.2%～0.6%(质量分数)TSP、0.2%～0.6%(质量分数)CTS、10～30 mmol/L氯化钙水溶液,混合均匀,得混合样品:复原果汁中可溶性固形物含量为19%且胶体质量分数为0(空白组,B)、0.3%～0.5% AHP、0.3%～0.7% CHP、0.3%～0.7% CLP、0.3%～0.7% GG、0.1%～0.3% TSP、0.1%～0.3% CTS或5～15 mmol/L氯化钙水溶液。密封后于室温下静置,观察3 h和24 h时的外观。

选定有澄清效果的处理组,包括质量分数为0.4%的AHP、0.1%的TSP及0.2%的CTS,放大样品制备量,将半浓缩果汁分装于100 mL螺盖玻璃瓶中(每瓶20 mL半浓缩果汁),相同制备方法,制备空白组B和胶体处理样品。

此外,半浓缩果汁经冷沉淀处理(4 ℃ 24 h)后,离心(8 000 r/min 10 min)取上清液,相同制备方法,制备冷藏空白组(CP1,可溶性固形物含量19%)及CP1结合胶体处理组CP1+0.4% AHP、CP1+0.1% TSP及CP1+0.2% CTS。

每组实验均为3次平行制备,于室温下静置24 h后分析。

1.3.2 色度的测定

测定方法同参考文献[10]。参数L*值表示亮度,a*值表示红绿度,b*值表示黄蓝度。样品的色度值(E*)计算见式(1)。处理样品与空白组之间的色度差(ΔET-B)计算见式(2),其中下标T和B分别代表处理组和空白组,以平均值代入计算。

(1)

(2)

1.3.3 浊度与褐色值的测定

使用725型紫外可见分光光度计在660 nm下测定样品的吸光值(A660),即为浊度[11];在420 nm下测得的吸光值(A420),即为褐色值[9]。

1.3.4 果汁褐色值的测定

在浓度的影响方面,将多依复原果汁(可溶性固形物含量19%)加去离子水稀释3、5、10、20及25倍,使最终可溶性固形物含量分别达6.4%、3.8%、1.9%、0.96%、0.76%,测定样品(未热贮藏)的褐色值A420。

为了评估多依复原果汁较长期贮藏下非酶褐变的可能程度,采用55 ℃ 10 d(企业常用的热加速实验温度)[12]和95 ℃ 15 h两种热加速实验,基于温度每升高10 ℃反应速率提高约2倍的原理,两种实验可预估在室温(25 ℃)下贮藏较长期(约80 d)的非酶褐变程度。但95 ℃ 15 h较无酚组成沉淀现象(见于55 ℃ 10 d),且速率较快的因多酚引起的非酶褐变反应占优势,结果可突显关键酚组成的影响。

在55 ℃加速实验方面,首先探讨浓度的影响,将制备的可溶性固形物含量为0.76%～6.4%的样品分装于100 mL螺盖玻璃瓶中(每瓶20 mL),密封,置于55 ℃恒温培养箱中储藏10 d,每隔24 h取样测定A420。

在胶体的影响方面,将复原果汁预稀释2.5倍后,取50 mL稀释汁分别与50 mL去离子水、0.16%(质量分数)AHP、0.04%(质量分数)TSP、0.08%(质量分数)CTS水溶液混合,得到混合样品最终复原果汁可溶性固形物含量3.8%,胶体浓度为0(空白组)、0.08%(质量分数)AHP、0.02%(质量分数)TSP、0.04%(质量分数)CTS(胶体对复原果汁的浓度比率与方法1.3.1节胶体处理的样品相同),于室温下静置24 h,离心取上清液分装于100 mL螺盖玻璃瓶中,密封,进行55 ℃热储藏实验,每24 h取样测定A420值。

在冷藏及冷藏结合胶体的影响方面,将复原果汁以去离子水稀释2.5倍,装瓶密封,进行冷沉淀处理(4 ℃ 24 h)后,离心(8 000 r/min 10 min)取上清液(可溶性固形物含量7.6%),即样品CP1。在CP1样品中加入等体积的去离子水(空白组)或胶体溶液,相同制样方式,最终可溶性固形物含量为3.8%,进行55 ℃热贮藏实验,每24 h取上清液测定褐色值A420。

在95 ℃加速实验方面,挑选具有代表性的复原果汁(可溶性固形物含量3.8%)、空白组、CP1上清液和0.02%(质量分数)TSP处理组上清液,进行高温加速反应实验(95 ℃ 15 h),然后离心、取上清液测定褐色值A420。

1.3.5 pH值的测定

使用pH计测定多依复原果汁的pH值。

1.3.6 可溶性固形物含量的测定

根据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光计法,使用数显糖度仪测定多依复原果汁离心后的上清液的可溶性固形物含量(%)。

1.3.7 总酚含量的测定

参照文献[13]的福林酚方法测定总酚含量。取2 mL样品溶液或没食子酸标准液,加入 2 mL 0.1 mol/L的福林酚试剂,振荡摇匀,静置3 min 后加入0.15 mL 质量分数为10%的Na2CO3 溶液,每隔10 min振荡1次,避光反应1 h,以蒸馏水作为空白对照,测定720 nm下的吸光值(A720)。

制备5～25 μg/mL没食子酸标准水溶液,建立的没食子酸标准方程为y=0.033 1x-0.027 8(R2=0.999),其中y为A720,x为没食子酸质量浓度,μg/mL。

多依复原果汁样品经离心(8 000 r/min 10 min)后收集上清液,上清液稀释500倍后测定A720,采用标准方程计算总酚质量分数,再乘上500,即为复原果汁样品的总酚含量,单位mg/mL(以没食子酸当量计)。

1.3.8 绿原酸含量的测定

参考文献[14]的HPLC分析方法,并稍加修改。使用高效液相色谱仪,C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),进样量10 μL,柱温20 ℃。流动相A为体积分数为1.0%的乙酸水溶液,流动相B为甲醇,流速为0.4 mL/min,检测波长为280 nm。梯度洗脱条件为0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%～50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70%～5% B;40～50 min,5% B。用Empower软件进行图谱分析。

样品经离心(8 000 r/min 10 min)取上清液,取10 μL上清液,添加体积分数为50%的甲醇水溶液至4 mL进行稀释,经0.22 μm滤膜过滤后进行分析,鉴定出绿原酸出峰在21.0 min处。配制2.5～20.0 μg/mL绿原酸标准溶液(体积分数为50%的甲醇水溶液)进行分析,3次平行测定,绘制标准曲线,得回归方程为y=35 441x-25 625,R2=0.999,式中x为绿原酸质量浓度,μg/mL;y为峰面积。

1.3.9 维生素C含量的测定

参考文献[15]的方法,将1 mL多依复原果汁与4 mL质量分数为2%的偏磷酸混合机械振荡2 h后,混合物通过Whatman 1号滤纸过滤。高效液相色谱C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),流动相A为0.1 mol/L KH2PO4水溶液,B为甲醇,A∶B混合比例为97∶3,流速为1 mL/min,柱温保持在40 ℃,检测波长为280 nm。将标准品维生素C配制为2.5、5、10、15、20 μg/mL的标准溶液进行分析,绘制标准曲线,得回归方程为y=42 341x-42 734,R2=0.999,式中x为维生素C质量浓度,μg/mL;y为峰面积。

1.3.10 果汁中多酚类化合物的测定

采用UPLC-MS-MS方法鉴定多依复原果汁中多酚类化合物[10]。

果汁样品前处理。待测样品加等体积的甲醇混合均匀,离心(12 000 r/min 10 min)后取上清液进行分析。采用 BEH C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)色谱柱,柱温为45 ℃,进样量1 μL,流速0.4 mL/min;流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液,流动相B为体积分数为0.1%甲酸的乙腈,两者混合为100%。

洗脱程序:0～3 min,5%～20% B;3～10 min,20%～100% B;10～12 min,100% B;12～15 min,100%～95% B;15～19 min,95% B。电喷雾(ESI)离子源,负离子模式,电子能量一级为6 eV、二级为20～45 eV;离子源温度:115 ℃;质量扫描范围m/z 50～1 000。以Unifi软件进行图谱处理。

1.3.11 体外抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除率参照文献[16]的方法进行测定。将样品溶液可溶性固形物含量调整为0.2%,取2 mL样品溶液与2 mL 0.2 mmol/L DPPH混合。将混合物在室温下放置30 min,用分光光度计于517 nm处测定混合物的吸光度。DPPH自由基清除率计算见式(3)。

DPPH自由基清除率

(3)

式(3)中,A0是对照组(水代替样品)的吸光度,A1是样品的吸光度;A2是A1样品中用乙醇代替DPPH溶液的吸光度。

ABTS+自由基清除率参考文献[17]的方法进行测定。将样品溶液可溶性固形物含量调整为0.2%,取4 mL ABTS+工作液和0.2 mL样品溶液混匀,室温避光反应20 min,在734 nm处测定吸光值。ABTS+自由基清除率计算见式(4)。

ABTS+自由基清除率

(4)

式(4)中,A0是对照组(水代替样品)的吸光度;A1 是样品的吸光度;A2是A1样品中,用乙醇代替ABTS+溶液的吸光度。

1.3.12 褐变速率常数的计算

研究发现多依复原果汁的初始非酶褐变反应呈零级动力学,类似罗望子原花青素体系的非酶褐变行为[10],故拟合方程见式(5)。

At=A0+k0×t 。

(5)

式(5)中A0和At分别为第0天和第t天褐色值A420;k0为零阶动力学拟合的反应速率常数,d-1。

1.4 数据分析

实验均为3次平行,数据以平均值±标准偏差表示。采用Origin 2021软件进行绘图。使用SPSS Statistics软件对数据结果进行Duncan多重比较,判断显著性(P<0.05)水平。用SIMCA 14.1软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 胶体处理对复原果汁外观的影响

初步探讨食品胶体、Ca2+或4 ℃冷沉淀1 d(CP1)等单一处理对多依果复原果汁沉淀现象和色泽的影响,结果见图1。由图1(a)可知,在室温下静置3 h后,多依复原果汁本身(对照组B)即有显著量的褐色沉淀物在试管底部、汁液色泽呈微浊的琥珀金黄色;添加AHP的质量分数在0.3%时沉淀物大为减少,汁液呈微浊琥珀色;然在0.4%～0.5%时,会造成多量沉淀物与云絮悬浮物,汁液呈澄清淡金黄色。添加0.3%～0.7% CHP [图1(b)]、CLP [图1(c)]及GG [图1(d)]并静置3 h下皆有促进多酚悬浮、抑制沉淀的效果,汁液呈琥珀色微浊,静置24 h后亦然。 添加0.1%～0.3% TSP [图1(e)]会产生明显的沉淀物及云絮物,0.1% TSP组汁液呈澄清淡金黄色,而0.2%～0.3% TSP组汁液微浊; 然静置24 h后[图1(f)],0.2% TSP 组汁液澄清化呈淡金黄色,0.3%TSP组依然微浊。添加0.1%～0.3% CTS [图1(g)]也会导致大量沉淀与云絮物且汁液微浊;静置24 h后[图1(h)],部分云絮物沉降,0.2% CTS组汁液澄清化明显。添加5～15 mmol/L Ca2+ [图1(i)]初期会促使沉淀量大为减少,但静置24 h后[图1(j)]明显的沉淀量和汁液色泽类似B组,显示Ca2+有短暂稳定,但无长期稳定复原果汁中的效果。相较于B组,4 ℃冷沉淀24 h后的样品(CP1)沉淀量略增加、汁液呈澄清的琥珀金黄色[图1(k)],显示有汁液澄清稳定的效果。

在促进沉淀以提高上清汁液澄清度、赋予明亮的金黄色泽方面,0.4% AHP、0.1% TSP、0.2% CTS 及冷沉淀(CP1)处理具有改善效果,可供多依果汁澄清化处理的参考。AHP、TSP和CTS皆会与复原果汁组成作用产生云絮物质,云絮量与胶体的添加量正相关,显示该胶体与果汁组成发生交互作用。在促进复原果汁组成悬浮稳定方面,0.3% AHP、CHP、CLP与GG及5 mmol/L Ca2+可满足色泽短期稳定的要求。

针对具有澄清效果的处理组AHP(0.4% AHP)、TSP(0.1% TSP)、CTS(0.2% CTS)和CP1,进一步量化这些处理及其与CP1结合处理(CP1AHP、CP1TSP及CP1CTS)对复原果汁色度与浊度的影响,见表1。由表1可知,空白组B的 L*=28.5,a*=12.8,b*=46.8,E*=79.9,浊度A660=0.641,呈微浊的琥珀金黄色。相较于B组,单一胶体处理皆可显著(P<0.05)提高复原果汁的L*值、降低a*、b*和E*值,处理前后的色度ΔET-B介于24.5～35.5,CTS组最大,浊度大大降低至0.079～0.118,果汁色泽呈清亮的淡金黄色。冷藏组CP1变化较小,仅显著(P<0.05)提高L*和降低a*值一定程度、不显著(P>0.05)影响b*,ΔET-B仅7.6,A660为0.143,呈琥珀金黄色。相较于单一胶体处理,CP1结合胶体组有显著(P<0.05)差异的仅CP1CTS组L*(提高);CP1TSP组a*(降低)、E* (降低);CP1AHP组A660(降低)。与单一CP1相比,结合组皆具有显著(P<0.05)较高L*与ΔET-B,较低a*、b*、E*及A660。因此,对复原果汁色泽的澄清效果(降低浊度)由优至差依次为:CTS、TSP、AHP、CP1。CP1较能保留琥珀色泽和较多总酚质量浓度在上清液中。CP1结合胶体处理有更为优良的澄清效果。

2.2 胶体处理对复原果汁理化性质及抗氧化活性的影响

将多依复原果汁样品的pH值、可溶性固形物含量、重要的抗氧化组成以及抗氧化活性等做比较,见表2。复原果汁空白组(B组)的pH=2.87,含有可溶性固形物含量(糖为主)19.1%、总酚质量浓度6.99 mg/mL,维生素C质量浓度25.3 μg/mL、绿原酸质量浓度3.21 mg/mL(占总酚质量46%);抗氧化活性DPPH·和ABTS+自由基清除率分别为69.3%及72.4%。相较于B组,所有的处理组具有显著(P<0.05)较高的pH值(3.03～3.11,以CP1CTS组最高)、较低的总酚含量(4.17～6.46 mg/mL,尤其是CP1CTS和CTS),可溶性固形物(18.3%～19.2%)、维生素C(23.7～26.1 μg/mL)和绿原酸(3.12～3.56 mg/mL)等含量变化有限。所有处理组的DPPH·清除率为52.1%～77.6%,AHP和TSP单一处理和CP1AHP、CP1TSP组结合组皆显著较高(P<0.05),而CTS和CP1CTS组显著较低。所有处理组的ABTS+清除率为61.1%～74.2%,TSP组最低。综上,添加上述胶体的影响大于冷藏处理,会显著减少总酚含量(降低量胶体组达24%～40%,CP1仅7.6%);DPPH自由基清除力只随CP1和CTS处理显著降低但变化有限,随AHP和TSP处理提高。

2.3 胶体处理对复原果汁颜色指标与总酚含量的影响

将复原果汁上清液的色度或浊度(见表1)对总酚质量浓度(见表2)绘图并线性拟合,结果见图2。由图2(a)可知,所有处理组的A660与总酚含量呈正相关:y=0.026 4x-0.026 8(R2=0.961),空白组B远高于该线性趋势,表明所采用的处理方式去除了混浊的元素,澄清效果显著,混浊的元素可能为多依果汁中的聚酚类(原花青素、花青素)[1]、果胶、蛋白质及其酚类聚集物[8,18]。色度值[图2(b)～(d)]皆呈两组趋势:处理组I 为TSP、CTS、CP1TSP及CP1CTS;处理组II为AHP、CP1及CP1AHP。图2(b)显示L*与总酚质量浓度呈负相关,其线性相关系数(R2)在处理组I和处理组II分别为0.554和0.800。a* [图2(c)]及b* [图2(d)]皆与总酚质量浓度呈正相关,处理组I与处理组II的a*与总酚质量浓度的线性R2分别为0.983与0.867;b*的R2分别为0.910与0.638。B组皆落在处理组II组的趋势线上,显示B组与AHP和CP1、CP1AHP可能具有相似发色基团的酚组成。从斜率观之,总酚质量浓度对a*或b*的影响程度,处理组I是处理组II的4～5倍。

2.4 复原果汁的非酶褐变动力学分析

2.4.1 复原果汁浓度对非酶褐变速率的影响

影响多依复原果汁贮藏初期非酶褐变程度的化学因素可能为总酚或总糖含量,维生素C因含量很低而可忽略。故首先探讨多依复原果汁不同浓度下非酶褐变速率的变化。由于未稀释的复原果汁的原始褐色值A420(2.127±0.003)太高,超出褐色值-浓度的线性范围,故调整至线性浓度范围内(可溶性固形物含量0.76%～6.4%),观察复原果汁在55 ℃加速实验下非酶褐变程度与浓度的关系,结果见图3。随着复原果汁可溶性固形物含量提高[图3(a)],热处理0～2 d的A420增率也越大,而后A420呈缓增(可溶性固形物含量0.76%～1.9%时)或波动不增(3.8%～6.4%),后者褐色值不再增加与酚类沉淀导致上清液的总酚质量浓度降低(见表2)情形一致,说明总酚质量浓度为非酶褐变的主要因素之一。由图3(b)可知,热处理0、2、10 d的A420值(分别为A420,0、A420,2及A420,10)与浓度呈高度正相关,斜率分别为0.087(R2=1.000)、0.188(R2=0.993)及0.148(R2=0.997)。热处理0～2 d的A420随时间而线性增加,属于零级动力学关系(见式5),其斜率可定义为初期的非酶褐变速率常数(k0)[10]。由图3(c)可知,k0值是复原果汁中的总酚质量浓度或可溶性固形物含量的直线函数,斜率为0.134(R2=0.993)。k0值对复原果汁可溶性固形物含量(%)的直线函数的斜率为0.049 2(R2=0.993)[见图3(d)]。因此,0～2 d为多依复原果汁非酶褐变行为的关键期。

2.4.2 胶体处理、总酚含量对褐变速率的影响

在复原果汁可溶性固形物含量为3.8%(褐色值的线性浓度范围内),空白组、胶体处理组、冷藏及其结合胶体处理组在55 ℃热加速实验下非酶褐变动力学参数变化见图4。采用的胶体对复原果汁的浓度比例见表2,即可溶性固形物含量3.8%的复原果汁中分别加入质量分数为0.08% AHP、0.02% TSP、0.04% CTS。由图4(a)可知,相较于空白组B,胶体处理组(AHP、TSP或CTS)在贮藏前4 d皆展现较低的褐色值A420及起始(第0～2天)褐变的斜率,且第5～10天褐变趋于平缓。图4(b)说明冷沉淀处理后的样品起始褐变直线区增加到第4天(CP1)或第7天(结合处理),其后大部分样品的褐色值仍线性增加,唯CP1TSP组例外(趋于平缓)。将图4(a)～(b)的起始褐变速率常数k0与图4(c)中进行比较,B组k0值为0.150 d-1,冷沉淀后CP1 k0值降至0.108 d-1;胶体处理皆降低k0值,降低的效果AHP组(k0=0.088 d-1)大于TSP和CTS组(k0=0.129～0.132 d-1);CP1结合3种胶体组的k0值最低,达0.071～0.078 d-1。上述回归线的相关性非常高(R2=0.963～1.000,数据未显示)。图4(d)说明各处理前后的样品第0天的A420值(A420, 0)与其总酚质量浓度呈两组关系,同图2(b)～(d)的分组,处理组Ⅰ(TSP、CTS、CP1TSP和CP1CTS)的A420,0值与总酚质量浓度的线性斜率为1.33(R2=0.898);而处理组Ⅱ(CP1、AHP、CP1AHP和空白组B)的线性斜率为0.247(R2=0.964)。由图4(e)可知,处理组Ⅱk0是总酚质量浓度的线性函数:y=0.177x-0.106(R2=0.912),斜率与图3(c)的斜率(0.134)同阶级。图4(f)表明k0值与样品可溶性固形物含量(%,主要为糖)的相关性差(R2仅0.547)。因此,多依复原果汁的初始非酶褐变速率k0主要决定于总酚质量浓度,非可溶性固形物含量,即非酶褐变速率主要为多酚所致。

2.4.3 热加速实验温度对褐变速率的影响

复原果汁常采用冷藏作短期贮藏且TSP为半乳糖木糖聚葡萄糖,为兼具膳食纤维的多功能性胶体[19],对多依复原果汁的澄清效果类似常用的澄清剂CTS,故挑选空白组B、CP1和TSP组为代表性样品,进行两种热加速实验。结果见表3,比较这3组样品在55 ℃及95 ℃加速实验下非酶褐变的情形,空白组B的褐色值在室温(25 ℃)0 d时(A420, 0)为0.342,55 ℃ 1 d、55 ℃ 10 d及95 ℃ 15 h时分别为0.491、0.790及0.862,褐变比例分别为1.4、2.3及2.5。CP1的A420, 0为0.325,显著(P<0.05)低于B组,3种热贮藏条件下A420分别为0.402、0.985及0.837,褐变比例分别为1.2、3.0及2.6。TSP组的A420, 0为0.233,远低于B组,3种热贮藏条件下A420分别为0.340、0.770及0.799,褐变比例分别为1.5、3.3及3.4。95 ℃ 15 h下样品间A420由大到小依序为B、CP1、TSP,与25 ℃ 0 d和55 ℃ 1 d的一致,但55 ℃ 10 d 的结果不同,且CP1和TSP组的褐变比例偏高。

2.5 复原果汁中多酚类化合物的组成

2.5.1 UPLC-MS-MS鉴定出的多酚类化合物

根据表3结果,针对95 ℃ 15 h热处理前后的样品进行UPLC-MS-MS酚类组成分析,找出因为酚类化合物氧化引起的非酶褐变反应的关键酚组成。UPLC-MS-MS分析结果见图5,复原果汁空白组B的图谱[图5(a)]显示有21个较大且可鉴定的尖峰,主要尖峰编号为1、4、5、8、9、10、15及20。CP1 [图5(c)]和TSP处理组[图5(e)]的图谱主要尖峰类似空白组B的,但8～9、11～17、19～21尖峰相对高度降低。95 ℃ 15 h热处理后的上清液,B组[图5(b)]、CP1组 [图5(d)]及TSP组[图5(f)]皆呈现相似的尖峰变化:2、4～5、8～20尖峰减小或消失(12尖峰),产生6大尖峰。

将图5各尖峰的质谱碎片特征进行鉴定,参考文献[20-21],所得21个尖峰的质谱碎片特征与化合物见表4。可侦测到的多依复原果汁的化学组成可归纳为4类。1)柠檬酸及其异构物(峰1,峰3)。2)绿原酸类。绿原酸及其衍生物或脱氢二聚体(峰6～峰11,峰14)。3)黄酮类—槲皮素-O-葡萄糖苷(峰13)、山柰酚-O-葡萄糖苷与二木糖苷(峰16～峰18)、根皮素-O-葡萄糖苷(根皮苷)与木糖葡萄糖苷(峰15,峰19)以及白杨素(峰21)。4)异黄酮类—异黄酮-O-葡萄糖苷(大豆苷)与其乙酰衍生物(峰2,峰4,峰5,峰20)、豌豆香堇苷(峰12)等。相较于B组,TSP和CP1组的组成绿原酸及其衍生物、黄酮类(槲皮素糖苷、山柰酚糖苷、根皮素糖苷及白杨素等)以及异黄酮(大豆苷与豌豆香堇苷等)相对含量轻微降低。95 ℃ 15 h热处理后,B热处理组、CP1热处理组及TSP热处理组皆一致地产生羟基化绿原酸衍生物,而6″-O-乙酰大豆苷异构物、绿原酸及其衍生物或二聚体及上述黄酮类和异黄酮类等皆减少,豌豆香堇苷消失。

2.5.2 主要酚类化物的质谱离子碎片关系

表4中主要的酚类化合物的分子离子峰与碎片离子生成过程推断见图6,包括羟基化绿原酸衍生物、绿原酸、绿原酸脱氢二聚体、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、根皮素-木糖葡萄糖苷、根皮素-葡萄糖苷(根皮苷)及大豆苷等。由图6(a)可知,峰6的化合物6(分子离子峰m/z 371.10)鉴定为羟基化绿原酸衍生物,为绿原酸与水反应产物,结构有两种,其失去一分子水得到峰8的化合物8(分子离子峰m/z 353.09)鉴定为绿原酸,然后再失去一个咖啡酰基形成奎宁酸(特征碎片m/z 191.06)。图6(b)表明,峰10和峰11的化合物10、11(分子离子峰705.17)鉴定为绿原酸脱氢二聚体,是绿原酸氧化产物,失去一分子奎宁酸得到m/z 513.11的离子碎片。图6(c)表明,峰13的化合物13(分子离子峰m/z 463.09)鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖苷,失去一个己糖苷得到m/z 300.03的离子碎片。图6(d)表明,峰20的化合物20(分子离子峰m/z 415.10)鉴定为大豆苷,失去葡萄糖基得到m/z 253.05的离子碎片。图6(e)表明,峰15的化合物15(分子离子峰m/z 567.17)鉴定为根皮素-木糖葡萄糖苷,失去一个木糖-葡萄糖的双糖残基形成根皮素(特征碎片m/z 273.08),然后失去107 Da形成m/z 167.04的离子碎片。峰19的化合物19(分子离子峰m/z 435.13)鉴定为根皮苷(根皮素-葡萄糖苷),先失去葡萄糖基形成根皮素(特征碎片m/z 273.08),再失去107 Da形成m/z 167.04的分子离子碎片。

2.6 胶体处理的复原果汁品质参数的聚类分布

图7(a)为胶体处理的复原果汁样品的浊度A660(表1)、总酚质量浓度(total phenolic concentration, TPC)、DPPH自由基清除力(表2)、褐色值A420以及褐变速率常数k0 值(图4)的主成分分析图。主成分1(PC1)和主成分2 (PC2)的贡献率分别为59.3%和20.1%,该模型可预测79.4%的数据关系。图7(a)表明B组与总酚质量浓度(TPC)、A420及A660聚类紧密在PC1为0.85～1.0和PC2为0处。CP1和k0聚类在第四象限(PC1>0,PC2<0)。AHP和TSP及其CP1结合组聚类偏第二象限(PC1为-0.5～0.1,PC2=0.25)。CTS和CP1CTS在第三象限(PC1<0,PC2<0)。DPPH·清除力在PC1约为0.15和PC2约为1.0处,较为聚类。聚类程度越大者,相似性或相关性越高。图7(b)为有监督模式的OPLS-DA分析结果。OPLS-DA1(预测主成分)和OPLS-DA2(正交主成分)的贡献率分别为86.9%和12.2%,该模型可预测99.1%的数据关系。B组和k0聚类紧密在OPLS-DA1=0.1和OPLS-DA2=0.5处。AHP、TSP、CP1AHP和CP1TSP组聚类偏第四象限(OPLS-DA1=0.3～0.6,OPLS-DA2=-0.25～0.1),与DPPH较接近(OPLS-DA1=1,OPLS-DA2～0)。CP1在第二象限; CTS和CP1CTS在第三象限。TPC、A420及A660聚类紧密在OPLS-DA1=0.1～0.2和OPLS-DA2=0.75～1.0处。当拟合优度响应变量方差分数和预测能力(Q2)的值越接近1时,OPLS-DA模型的有效性越强,置换前和Q2=-2.31。图7(c)为对OPLS-DA模型进行置换检验(200次排列实验)分析的结果,纵坐标上的两个截距分别代表Y置换后模型的和Q2(-3.69),Q2<0没有过拟合,说明该OPLS-DA拟合具有有效性。图7(d)为所得OPLS-DA模型分析得出的多依复原果汁的变数的投影变量重要性(variable importance in the projection, VIP)值,DPPH的VIP值最高(1.6),其次为TPC、A660、A420和k0值(VIP=0.7～0.86)。因此,OPLS-DA模型的预测结果良好。DPPH自由基清除力是不同胶体处理组之间最重要的变因,其次为TPC。

3 结果与讨论

在胶体工艺处理的效果上,研究创新发现0.2% CTS、0.1% TSP和0.4% AHP处理与多依复原果汁色泽优化的效果由高到低依次为CTS、TSP、AHP。CTS处理的澄清效果好但会显著降低总酚含量和DPPH自由基清除力,为其缺点。TSP和AHP虽会减少总酚含量,但对多依复原果汁提供了多功能性,如良好的澄清性、非酶褐变抑制性(降低k0)及稳定DPPH自由基清除力,亦可提高增稠、悬浮性和作膳食纤维用[8,19]。在抑制起始非酶褐变(降低k0值)上,多依复原果汁可添加0.1% TSP结合冷藏处理,或添加0.4% AHP。TSP处理的综合效果最好,值得未来深入探讨其澄清机理。AHP的非酶褐变抑制性,此与添加0.3%果胶可稳定苹果汁的酚酸、减少酚酸降解[8]的现象一致。AHP兼具澄清剂和悬浮稳定的双向效果。当果胶较高分子质量、较高甲氧基酯化度或较高聚半乳糖醛酸含量,而酚酸较高聚合度 (如原花青素)或含醌酸(如绿原酸)时,果胶-多酚类的交互作用较大[22]。

多依果的多酚主组成类似野苹果,主要有绿原酸及黄酮类(如山柰酚糖苷、槲皮素糖苷及根皮苷);但多依果另含有异黄酮(大豆苷和豌豆香苷),野苹果另含有B-型原花青素、咖啡酸及儿茶素类[20]。南非多依果亦含有原花青素、花青素、花青素聚合物、黄酮类(儿茶素)、多种羟基酚化物等[1]。研究创新发现多依复原果汁的绿原酸及其衍生物、黄酮类(槲皮素糖苷、山柰酚糖苷、根皮素糖苷及白杨素等)以及异黄酮(大豆苷与豌豆香堇苷等)随TSP处理而轻微减少,受热处理明显减少并产生新的羟基化绿原酸衍生物。此热催化绿原酸的转变类似绿原酸水溶液以微波加热[21]的分子转变,涉及绿原酸水解成醌酸和咖啡酸,或者异构化成新绿原酸和隐绿原酸,进一步形成羟基化绿原酸衍生物,再进一步氧化形成羧基化绿原酸或醌内酯[21]。因此,绿原酸和羟基化绿原酸衍生物为褐色的关键组成。

4 结 论

特定胶体处理(0.4% AHP、0.1% TSP、0.2% CTS)可以明显优化多依复原果汁感官质量与贮藏稳定性,降低总酚质量浓度、色度值、浊度、褐色值及起始非酶褐变速率常数k0,赋予还原汁清亮的金黄色。综合考虑澄清性、非酶褐变抑制性(降低k0)、DPPH自由基清除力、膳食纤维等因素,整体上,以质量分数为0.1%的TSP为胶体处理得到的多依复原果汁相对最佳。多依复原果汁的特征多酚组成包括绿原酸类、黄酮类(槲皮素糖苷、山柰酚糖苷、根皮素糖苷以及白杨素)以及异黄酮类(大豆苷及豌豆香堇苷)。热处理会促使多酚类化合物明显减少或消失,产生大量的羟基化绿原酸衍生物,研究结果表明绿原酸和羟基化绿原酸衍生物为非酶褐变的关键组成物质。希望本研究可为解决多依复原果汁在短期贮藏过程中混浊及非酶褐变难题提供重要的参考。此外,多依果汁尚有热加工和长期贮藏稳定性的问题有待未来进一步深入研究。

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Effects of Gum Treatments on Quality and Clarification Mechanism of Restored Docynia delavayi Fruit Juice

ZHOU Ruonan1, AI Lianzhong1, WU Yan2, LAI Phoency1,*, SONG Zibo3, XIANG Yanling3

(1.School of Health Science and Engineering/Shanghai Engineering Research Center of Food Microbiology, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093,China;2.School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;3.Yunnan Mouthdoleak Group Food Co Ltd, Yuxi 653100, China)

Abstract：The purpose of this study was to establish polysaccharide gums treatments for clarification and color improvement of restored fruit juice of Docynia delavayi Schneid.. The gum treatments effects on the basic characters (colority, turbidity, browning value, pH value, soluble solid content, and vitamin C content), total phenolic content, chlorogenic acid content, polyphenolic composition, in vitro antioxidant activity, and non-enzymatic browning kinetic parameters of the restored fruit juice were elucidated by spectrophotometry, HPLC, and UPLC-MS-MS. The results indicated that the addition of mass fraction 0.4% apple high-methoxy pectin (AHP), 0.1% tamarind seed polysaccharide (TSP), or 0.2% chitosan (CTS) endowed Docyniadelavayi restored fruit juice of clear golden color. The clarifying effectiveness from high to low was in the order of CTS, TSP, AHP. Cold precipitation at 4 ℃ for 24 h combined with gum treatments resulted in an improved clarifying effect and reduced the initial non-enzymatic browning rate constant k0 of the juice from 0.150 d-1 to 0.071～0.078 d-1 at 55 ℃. The changes in colority, turbidity, browning value, and k0 were closely, linearly related to total phenolic content. Based on comprehensive considerations on clarity, inhibition against non-enzymatic browning (reducing k0), DPPH radical scavenging ability and dietary fiber, it was proposed that mass fraction 0.1% TSP treatment gave relatively the best restored fruit juice among treatments in general. The polyphenolic compositions of the restored fruit juice were mainly chlorogenic acid, flavonoids (including quercetin-O-glucoside, kaempferol-O-glucoside and dixylosides, phloridzin, and chrysin), and isoflavonoids (including daidzin, pisumionoside). The compositions of chlorogenic acid and its derivatives, flavonoids, and isoflavonoids contents were lightly reduced by TSP treatment. Thermal treatments resulted in a great loss or removal of polyphenolic compositions, accompanying with an increase in hydroxyl chlorogenic acid derivatives content. The results showed that chlorogenic acid and hydroxyl chlorogenic acid derivatives were the key compositions for non-enzymatic browning reaction. These results were expected to provide a theoretical and technical support for clarifying treatments of restored Docyniadelavayi fruit juice.

Keywords：Docynia delavayi; restored fruit juice; clarification; non-enzymatic browning; chlorogenic acid

中图分类号：TS275.5

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200737

文章编号：2095-6002(2023)04-0144-15

引用格式：周若男,艾连中,吴艳,等.胶体处理对多依复原果汁品质及澄清机制的影响[J]. 食品科学技术学报,2023,41(4):144-158.

ZHOU Ruonan, AI Lianzhong, WU Yan, et al. Effects of gum treatments on quality and clarification mechanism of restored Docynia delavayi fruit juice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(4):144-158.

收稿日期：2022-07-15

基金项目：上海市科技创新行动计划国内合作项目(21015800300)。

Foundation: Domestic Cooperation Project of Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan (21015800300).

第一作者：周若男,女,硕士研究生,研究方向为果汁加工与分析。

*通信作者：赖凤羲,女,教授,主要从事食品胶体功能特性方面的研究。

(责任编辑：李 宁)