人体免疫系统是对外来抗原和外部刺激的防御,其功能障碍会导致自身免疫缺陷和炎症性疾病,如心血管疾病[1]、肝脏疾病[2]、类风湿性关节炎[3]等。因此,维持机体正向免疫应答和抑制过度免疫应答的相对稳定至关重要。大量研究表明,食物来源的免疫调节肽可以刺激免疫系统以消除入侵者、修复身体损伤和提高免疫力[4-6],但关于免疫肽的双向免疫调节活性,即提高免疫应答和抑制过度免疫应答却鲜有报道。此外,与药物相比,食物来源的免疫调节肽具有无毒、更易吸收且免疫原性更低的优势[7]。因此,研究肽的双向免疫调节作用在预防和改善免疫抑制与炎症疾病中显示出广阔前景。

免疫调节肽可以刺激淋巴细胞分裂增殖[8-9]。活化的淋巴细胞是机体发挥免疫效应的重要因素,分裂增殖是其活化的表现,所以刺激淋巴细胞增殖成为判断肽是否具有免疫调节活性的重要指标[10]。RAW264.7巨噬细胞是研究食源肽发挥免疫调节作用中最常用的细胞模型[11-12]。研究人员已经从阿拉斯加狭鳕骨架[13]、文蛤[11]和鸡蛋[14]中获得免疫调节肽,并发现其主要是通过提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力、一氧化氮(nitric oxide,NO)产生量、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)表达量、胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成量和细胞因子分泌量来发挥免疫调节作用。此外,RAW264.7巨噬细胞可被细菌脂多糖(lipopolysauharide,LPS)激活,已成为从鲑鱼[15]、贝类[16]和藻类[17]等食物中筛选抗炎肽广泛使用的细胞模型。

海鲈鱼(Lateolabrax maculatus),因其产量高且富含蛋白和多不饱和脂肪酸,被认为是中国领先的水产养殖海鱼之一[18]。目前,已从海鲈鱼皮肤和鳃中分离得到天然抗菌肽Moronecidin[19]。以海鲈鱼鱼皮明胶、鱼肉等为原料,通过蛋白酶酶解制备的多肽也已证实具有多种生理活性,包括抗炎活性[19]、抗氧化活性[20]、促进伤口愈合作用[21]、抗菌作用[22]等。然而,关于海鲈鱼免疫调节肽(Lateolabrax maculatus immunomodulatory peptides,LIP)在免疫细胞中是否具有双向免疫调节活性鲜有报道。此外,在鲈鱼的加工过程中产生的鱼鳞、鱼骨等下脚料富含蛋白质资源,常被用作饲料原料或者丢弃,造成鱼类资源浪费。将鲈鱼以整鱼进行加工,制备出具有生物活性的物质是提高其利用价值的有效方法。

本研究拟以海鲈鱼整鱼(包括鱼肉、鱼骨、鱼鳞等)作为实验材料,通过以小鼠脾淋巴细胞刺激指数为指标制备LIP,以期实现海鲈鱼全值化利用并提高其加工利用率。通过评估LIP对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力、NO产生、细胞内ROS形成、iNOS及环氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)的mRNA表达水平和细胞因子分泌量的影响,阐明LIP的双向免疫调节活性。研究旨在为多肽的双向免疫调节作用的功能食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海鲈鱼,当地超市;清洁级雄性ICR小鼠,体质量(20±2)g,福州吴氏实验动物贸易有限公司;RAW264.7细胞系,商城北纳创联生物科技有限公司;LPS、中性红、胃蛋白酶(猪胃黏膜来源,800 U/mg)、中性蛋白酶(枯草杆菌来源,100 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、风味蛋白酶(20 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg),上海源叶生物科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT],上海麦克林生化科技有限公司;DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素和链霉素、磷酸缓冲液(phosphate buffer saline, PBS),上海赛默飞世尔科技有限公司;活性氧检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;NO测定试剂盒、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2) ELISA试剂盒,南京建成生物工程研究所;细胞因子ELISA试剂盒,武汉博士德公司;总RNA分离试剂盒、SYBR green彩色荧光定量预混试剂盒,北京天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AUY120型电子天平,日本岛津公司;FE20型pH计,梅特勒-托利多仪器公司;3111型CO2培养箱,美国Thermo Fisher Scientific公司;SpectraMax iD3型多功能酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;C6 PLUS型流式细胞仪,美国Becton Dickinson公司;TH2-82型水浴恒温摇床,金坛市鸿科仪器厂;Super Mini Dancer型调速型迷你离心机,生工生物工程(上海)股份有限公司;TD5B型低速离心机,长沙湘智离心机仪器有限公司;DW-86L626型-80 ℃超低温保存箱,青岛海尔股份有限公司;FD-1C-50型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;HNMTH-100型恒温混匀仪,上海汉诺仪器有限公司;CFX96型荧光定量PCR仪,伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鲈鱼样品预处理

新鲜海鲈鱼去除内脏后用清水冲洗干净并控干水分,整鱼剁碎后放入绞肉机搅碎,四层纱布沥干水分后,于-20 ℃冷藏备用。

1.3.2 LIP制备单因素实验

LIP单因素实验各个因素的水平梯度,蛋白酶种类:胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶;料液比:1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10(g/mL);加酶量质量比例:0.5%、1%、2%、4%、6%;酶解时间:1、2、4、8、12、24 h。反应结束后,于沸水中加热10 min灭酶,调节pH值至7.0,10 000 r/min离心20 min,取上清液测定其水解度和对小鼠脾淋巴细胞的刺激指数的影响。

1.3.3 响应面实验设计

采用Design-Expert V8.0.6.1软件设计响应面实验。根据单因素实验的结果,选择液料比(A)、加酶量(B)、酶解时间(C)3个因素,分别设置3个水平,见表1。经设计实验,以小鼠脾淋巴细胞刺激指数为响应值,优化得到脾淋巴细胞刺激指数最高的LIP制备条件。

1.3.4 小鼠脾淋巴细胞制备

小鼠脾淋巴细胞制备方法参考文献[10]。将清洁级雄性ICR小鼠经颈椎脱臼法处死,置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min,在无菌状态下取出脾脏,并用PBS冲洗2遍,以剔除粘连的脂肪及残留组织。将处理后的脾脏转移至6 mL的RPMI-1640培养基中,用1 mL注射器吸取RPMI-1640培养基冲洗脾脏至透明,收集冲洗液,以2 000 r/min转速离心3 min,弃上清,用1 mL的RPMI-1640完全培养基(包含体积分数为10%的FBS,体积分数为1%的青霉素-链霉素混合液)重悬制备单细胞悬液。

1.3.5 小鼠脾淋巴细胞增殖实验

制备小鼠脾淋巴细胞悬液,以6×106个/mL细胞密度加入96孔板中,每孔180 μL,空白组加入20 μL的PBS,样品组加入不同质量浓度的LIP溶液20 μL,于37 ℃、体积分数为5%的CO2恒温培养箱中培养48 h。培养结束后,每孔中加入质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL,再培养4 h。以2 500 r/min转速离心10 min,弃上清液,每孔加入200 μL的DMSO,室温振摇10 min,最后用酶标仪测定570 nm波长处吸光值。小鼠脾淋巴细胞刺激指数计算公式如式(1)。

刺激指数

(1)

式(1)中,A(空白)为空白组的吸光值,A(样品)为LIP处理组的吸光值。

1.3.6 LIP的水解度检测

采用甲醛滴定法[23]测定LIP的水解度。100 mL锥形瓶中加入2.5 mL酶解液和30 mL去离子水,混匀后调节混合液pH值至8.2,再加入10 mL pH值8.2、体积分数37%的甲醛溶液。最后用0.02 mol/L的标准NaOH溶液将混合液滴定至pH值为9.2。记录消耗的NaOH溶液体积。水解度计算公式如式(2)、(3)、(4)。

(2)

(3)

(4)

式(2)、(3)、(4)中,ΔV为样品与原液滴定所耗标准NaOH溶液体积之差,mL;c为NaOH标准溶液浓度,mol·L-1;m为原料质量,g;Vtot为酶解液的总体积,mL;V为用于滴定的酶解液体积,mL;b0为水解前单位质量蛋白含游离氨基毫摩尔数,mmol·g-1;b为水解后单位质量蛋白含游离氨基毫摩尔数,mmol·g-1;htot为原料蛋白中所含肽键总数,mmol·g-1;w为原料蛋白质量分数,%;110为氨基酸平均相对分子质量。

1.3.7 RAW264.7巨噬细胞培养与传代

RAW264.7细胞在含有体积分数为10%的FBS和1%的青霉素-链霉素的DMEM培养基中,于 37 ℃、体积分数为5%的CO2环境中培养。当细胞分布度达80%以上,小心倾倒培养液,用3 mL的PBS润洗2遍后,再用3 mL的PBS将细胞吹下,收集于1 mL离心管中,以2 000 r/min离心3 min,弃上清,1 mL培养基重悬细胞后转移至培养瓶中培养。

1.3.8 细胞毒性实验

免疫调节模型:将RAW264.7巨噬细胞(细胞密度为1×104个/mL)在96孔板中培养24 h,然后用不同质量浓度的LIP(12.5～400 μg/mL)处理24 h。

炎症模型:将RAW264.7巨噬细胞(细胞密度为1×104个/mL)在96孔板中培养24 h,然后用LPS(质量浓度为1 μg/mL)和不同质量浓度的LIP(12.5～400 μg/mL)共同处理24 h。

每孔加入20 μL的MTT溶液(质量浓度为5 mg/mL),37 ℃孵育4 h。小心去除上清液后,每孔加入200 μL的DMSO,使用酶标仪测量570 nm波长处吸光度。

1.3.9 中性红吞噬能力检测

RAW264.7巨噬细胞(5×104个/mL)在96孔板中于37 ℃、体积分数为5%的CO2环境下孵育24 h。细胞分为对照组和炎症组,对照组:用不同质量浓度(12.5～400 μg/mL)的LIP处理 24 h;炎症组:质量浓度为1 μg/mL的LPS和不同质量浓度的LIP共同处理24 h。小心弃去培养基,每孔加入100 μL质量浓度为1 mg/mL的中性红溶液,孵育30 min。用200 μL的PBS洗涤细胞2次,去除残留的中性红。再加入100 μL的细胞裂解缓冲液(冰醋酸和乙醇体积比1∶1)并在室温下缓慢振摇2 h,在540 nm波长处测量吸光度。

1.3.10 NO含量检测

按1.3.9节培养RAW264.7巨噬细胞。收集上清液,根据试剂盒说明书测定NO含量。

1.3.11 细胞内ROS检测

按1.3.9节培养RAW264.7巨噬细胞。收集细胞并用冷PBS洗涤3次。洗涤后的细胞在黑暗中于10 μM的DCFH-DA溶液中37 ℃孵育30 min。将细胞以2 000 r/min转速离心20 min,用冷PBS洗涤2次。将细胞重新悬浮在1 mL的PBS中,使用流式细胞仪分析胞内ROS荧光强度。

1.3.12 细胞因子含量检测

RAW264.7巨噬细胞(细胞密度为1.6×105个/mL)在6孔板中孵育24 h。细胞分为对照组和炎症组,对照组:用不同质量浓度(12.5～400 μg/mL)的LIP处理24 h;炎症组:质量浓度为1 μg/mL的LPS和不同质量浓度的LIP共同处理24 h。收集上清液,根据ELISA试剂盒说明书测定TNF-α和IFN-γ的水平。

1.3.13 炎症因子基因表达水平检测

按1.3.12节培养RAW264.7巨噬细胞。采用RNAprep Pure Cell试剂盒提取RAW264.7巨噬细胞的总RNA。根据TransScript® One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix试剂盒操作手册合成cDNA。cDNA合成条件为95 ℃、15 min和60 ℃、30 s,扩增40个循环。使用RealUniversal Color PreMix (SYBR Green)与MyGo实时PCR检测系统进行q-PCR,并使用β-肌动蛋白(β-actin)进行归一化。q-PCR扩增基因引物,见表2。

1.4 数据处理

所有实验处理均重复3次,结果表示为平均值±标准偏差。采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行方差分析(one-way ANOVA),Duncan法进行多重比较,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素对LIP免疫调节活性的影响

不同单因素对LIP免疫调节活性的影响,见图1。由图1(a)可知,以木瓜蛋白酶为工具酶得到的LIP对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效果最佳,这是由于木瓜蛋白酶的水解位点广[24],多位点作用于鲈鱼蛋白产生更多的小分子肽。由图1(b)可知,料液比对LIP免疫调节活性的影响。随着料液比的变化,LIP对小鼠脾细胞增殖的作用呈现先增加而后趋于平缓的趋势,当料液比为1∶6(g/mL)时刺激指数最大。酶解物水解度随料液比的增加呈缓慢上升趋势。蛋白酶是酶解制备鲈鱼免疫调节肽的关键,其用量直接影响酶解物中活性肽的含量。由图1(c)可知,质量比例为2%的加酶量对小鼠脾细胞刺激指数达到最大值。水解度随加酶量增加不断升高而后平缓,这是由于当加酶量增加到一定程度后,底物逐渐水解充分[25]。从图1(d)可知,酶解1 h时酶解液对小鼠脾淋巴细胞刺激指数为1.72,随酶解时间延长呈逐渐下降趋势。其他海洋免疫调节肽也观察到显著的淋巴细胞增殖[8,26],具有增强免疫功能的特性。以小鼠脾淋巴细胞刺激指数为主指标,筛选得到LIP的制备条件:木瓜蛋白酶为工具酶,料液比1∶6(g/mL)、加酶量2%、酶解时间1 h。

2.2 响应面实验结果

以小鼠脾淋巴细胞增殖率为Y值,料液比为A、加酶量为B、时间为C,通过响应面方差分析,对各因素拟合得到的方程如式(5)。

Y=257.23-18.75A+12.62B-0.96C+17.50AB+4.92AC+1.86BC-16.15A2-14.25B2-11.90C2 。

(5)

式(5)中,A为料液比,g/mL;B为加酶量,%;C为酶解时间,h。

模型回归方程方差分析结果,见表3。由表3可知,该回归方程的显著性检验结果为极显著(P<0.000 1),失拟项检验结果差异不显著(P=0.917 6)。模型与实际拟合良好(R2=0.989 4),能解释98.94%的响应值变化,可以用于LIP制备工艺的分析预测。回归方程的一次系数A、B、C绝对值分别为18.75、12.62、0.96,说明3个因素对响应值影响的主效关系由大到小依次为料液比、加酶量、酶解时间。

优化得出的制备条件:料液比1.0∶3.8(g/mL)、加酶量2.14%、酶解时间56 min,理论刺激指数为2.63。经验证实验测得较佳条件下刺激指数为2.57,与理论提取率无显著性差异、刺激指数接近,相对误差为2.28%。实验结果说明,通过响应面法优化得到的模型回归方程及优化条件可靠。

2.3 LIP对RAW264.7巨噬细胞免疫活性的影响

2.3.1 LIP对RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响

细胞活力是确定LIP对RAW264.7 巨噬细胞是否具有细胞毒性最直观的方法[27]。LIP对RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响,见图2。由图2可知,LIP(质量浓度为12.5～400 μg/mL)处理24 h后细胞的活力增加,且呈剂量依赖(P<0.05)。实验结果表明,质量浓度12.5～400 μg/mL的LIP对RAW264.7巨噬细胞无毒性。因此,选择质量浓度为12.5～400 μg/mL的LIP进行后续免疫调节活性研究。

2.3.2 LIP对RAW264.7巨噬细胞吞噬作用的影响

吞噬作用是RAW264.7巨噬细胞抵抗异物感染的第一步[28],也是检测巨噬细胞活化状态的重要指标[29]。因此,采用中性红检测吞噬能力,LIP对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的影响,见图3。由图3可知,LIP以剂量依赖的方式增强RAW264.7细胞对中性红的吞噬能力。当LIP质量浓度为400 μg/mL时,细胞吞噬能力最高(143%),但与LPS(1 μg/mL)单独作用的细胞相比仍具有显著差异(P<0.05)。实验结果表明,LIP可以适当地提高巨噬细胞的吞噬能力以发挥免疫调节作用。

2.3.3 LIP对RAW264.7巨噬细胞NO产生和iNOS mRNA表达的影响

NO等细胞毒性分子的释放是巨噬细胞抵抗病原体感染的第二步,其释放水平被广泛用于评估巨噬细胞的免疫调节活性[30]。因此,采用NO水平评估LIP的免疫调节活性。LIP对RAW264.7巨噬细胞NO产生和iNOS mRNA表达的影响,见图4。由图4(a)可知,经LIP处理后,RAW264.7巨噬细胞内的NO释放量显著提高(P<0.05),表明LIP能通过提高NO释放量抵御异物感染。 iNOS 作为NO释放的关键催化剂,因此,通过检测iNOS mRNA的表达量在分子水平上评估NO的产生。由图4(b)可知,在LIP刺激后iNOS mRNA表达呈剂量依赖性增加,与NO释放量的结果相互印证,进一步说明LIP对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用是通过增加iNOS mRNA的表达,进而催化NO的产生实现的。研究结果与太子参免疫调节肽[7]、龙须多糖[31]和白芷多糖[6]等相关报道的结果一致。

2.3.4 LIP对RAW264.7巨噬细胞胞内ROS生成量的影响

ROS是RAW264.7巨噬细胞在受到病原体侵袭时释放的有毒代谢物,主要通过细胞自身、外源环境或其他生物反应副产物产生,在免疫中发挥重要作用[32]。适当的ROS的产生有利于提升RAW264.7巨噬细胞的免疫调节活性[33]。为了确定不同浓度LIP对巨噬细胞ROS生成的影响,采用荧光探针DCFH-DA结合流式细胞术进行检测。LIP对RAW264.7巨噬细胞ROS产生的影响,见图5。由图5可知,随着LIP质量浓度的增加,细胞内ROS产生水平显著增加(P<0.05),并呈剂量依赖性。

2.3.5 LIP对RAW264.7巨噬细胞炎性因子分泌的影响

当巨噬细胞受到刺激和激活时,会分泌各种细胞因子在各种免疫反应中发挥重要作用,如炎症的起始、发展和消退[28,34]。巨噬细胞可通过各种受体与多糖或糖蛋白结合[35],分泌细胞因子,如TNF-α以杀死肿瘤细胞。IFN-γ是激活免疫细胞的关键信号分子,在宿主抗病毒和抗肿瘤免疫防御中发挥核心作用[36]。为探讨LIP是否能刺激RAW264.7巨噬细胞的细胞因子分泌,选取2种典型的细胞因子(TNF-α和IFN-γ)进行研究,结果见图6。由图6(a)可知,LIP的加入以剂量依赖性方式显著增强了TNF-α的分泌(P<0.05)。TNF-α具有多种生物学功能,可以参与免疫调节。巨噬细胞活化时产生TNF-α,同时TNF-α引发iNOS转录,从而使细胞产生大量NO[37]。由图6(b)可知,RAW264.7巨噬细胞经过质量浓度为400 μg/mL的LIP处理后,IFN-γ的分泌量相较于对照组仍显著增加(P<0.05)。LIP可能通过激活巨噬细胞受体,启动一系列细胞内信号级联反应,包括MAPK和NF-κB通路,进而启动相关细胞因子转录激活和产生,刺激细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌[38]。LIP可通过刺激TNF-α和IFN-γ的分泌来增强RAW264.7巨噬细胞的免疫调节活性。

2.4 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的影响

2.4.1 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活力的影响

实验结果已经证实,LIP在12.5～400 μg/mL的质量浓度内,对 RAW264.7巨噬细胞没有细胞毒性作用。但研究结果表明,LIP刺激效果与LPS仍有显著性差异(P<0.05)。因此,采用MTT法检测LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞是否具有抗炎作用,结果见图7。由图7可知,LPS的刺激极大地促进了RAW264.7巨噬细胞的增殖(P<0.05)。经LIP处理后,可有效地抑制LPS诱导的过度细胞增殖。研究结果表明,LIP可以减轻LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症。

2.4.2 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的影响

为了进一步确定LIP的抗炎作用,使用中性红测量LIP处理的RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力,结果见图8。由图8可知,单独用LPS刺激显著提高了RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。经LIP处理后,吞噬作用的异常增加得到有效抑制(P<0.05)。与LPS诱导组相比,高质量浓度(400 μg/mL)的LIP能够显著抑制吞噬作用并使其恢复到对照水平(P<0.05)。研究结果表明,LIP能够抑制由LPS引起的巨噬细胞吞噬作用异常,发挥炎症抑制作用。

2.4.3 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO产生和iNOS mRNA表达的影响

iNOS通过产生NO参与炎症反应,NO是一种第二信使分子,参与调节多种生理过程,在正常生理条件下具有抗炎作用[39-40]。在炎症过程中,细胞内过量的NO会与超氧自由基反应生成过氧亚硝酸盐,过氧亚硝酸盐又会进一步产生羟基自由基,对细胞造成氧化损伤[41]。因此,对于炎症引起的各种疾病的治疗,抑制NO的过度分泌是至关重要的。为探究LIP发挥炎症抑制作用的可能途径,研究测定了NO释放量及iNOS mRNA表达量,见图9。由图9可知,LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中NO释放量和iNOS mRNA表达在加入LIP后显著降低(P<0.05),并呈现剂量依赖性。研究结果表明,LIP可以通过下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞 iNOS mRNA的过度表达保护宿主免受NO过度分泌的毒害作用。

2.4.4 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞PGE2分泌和COX-2 mRNA表达的影响

PGE2是花生四烯酸的代谢物,由COX-2诱导和转化,在全身稳态和炎症反应中起着至关重要的作用[42]。COX-2是催化前列腺素生物合成的关键酶,是高度可诱导的炎症刺激物[43]。因此,研究LIP对细胞中PGE2分泌和COX-2 mRNA表达的影响至关重要。LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中PGE2分泌和COX-2 mRNA相对表达的影响,见图10。由图10可知,LIP有效降低了RAW264.7巨噬细胞的PEG2分泌和COX-2 mRNA表达(P<0.05),并且呈现剂量依赖性。研究结果表明,LIP可通过降低COX-2 mRNA的表达量进而减少PGE2的诱导转化,最终降低PGE2分泌。

2.4.5 LIP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性因子分泌的影响

炎症过程的发生离不开细胞因子的参与。TNF-α作为一种多功能促炎细胞因子,在细胞凋亡、炎症中发挥重要作用[38]。与TNF-α类似,炎症过程的发生会增加IFN-γ的分泌,同时IFN-γ会反作用于巨噬细胞,使其进一步活化并分泌更多的炎症因子[44]。因此,选择TNF-α和IFN-γ作为典型的细胞因子来研究LIP对细胞因子分泌的影响,见图11。由图11(a)可知,质量浓度400 μg/mL的LIP显著改善LPS诱导的TNF-α的过度表达(P<0.05)。由图11(b)可知,与阳性对照相比,LIP以剂量依赖的方式抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IFN-γ的产生。研究结果表明,LIP可以通过减少炎症因子的分泌来发挥抗炎活性。

3 结 论

本研究通过单因素和响应面优化,得到最佳LIP制备条件:料液比1.0∶3.8(g/mL)、木瓜蛋白酶加酶量2.14%、酶解时间56 min,所得LIP对小鼠脾淋巴细胞刺激指数为2.57。此外,LIP具有双向免疫调节活性。在RAW264.7细胞模型中,LIP可有效刺激细胞增殖,增强吞噬能力,提高NO和ROS的产生,促进细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的分泌。而在巨噬细胞炎症模型中,LIP可剂量依赖地抑制LPS诱导的细胞过度增殖,显著下调异常增加的吞噬能力,减少TNF-α和IFN-γ的过度分泌。研究结果表明,LIP通过降低iNOS和COX-2 mRNA表达量,抑制NO释放和PGE2的产生,缓解LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症。本研究旨在为LIP应用于双向免疫调节功能食品的开发提供理论依据。

参考文献：

[1] LIBBY P, RIDKER P M, HANSSON G K, et al. Inflammation in atherosclerosis: from pathophysiology to practice[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2009, 54(23): 2129-2138.

[2] 潘佳静, 梁焱惠, 张敏, 等. 皮蛋模拟胃肠道消化物对HepG2细胞的影响[J]. 食品科学技术学报, 2022, 40(2): 82-90.

PAN J J,LIANG Y H,ZHANG M, et al. Effect of preserved eggs simulated gastrointestinal digests on HepG2 cells[J]. Journal of Food Science and Technology, 2022, 40(2): 82-90．

[3] GARCIA H, MARIANA H, GONZALEZ A,et al. Specific therapy to regulate inflammation in rheumatoid arthritis: molecular aspects[J]. Immunotherapy, 2014, 6(5): 623-636.

[4] LIU F, ZHANG X, LING P, et al. Immunomodulatory effects of xanthan gum in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 169: 65-74.

[5] SANTIAGO-LOPEZ L, HERNANDEZ-MENDOZA A, VALLEJO-CORDOBA B, et al. Food-derived immunomodulatory peptides[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2016, 96(11): 3631-3641.

[6] WANG J, WANG H, ZHANG H, et al. Immunomodulation of ADPs-1a and ADPs-3a on RAW264.7 cells through NF-kappaB/MAPK signaling pathway[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 132: 1024-1030.

[7] YANG Q, HUANG M, CAI X, et al. Investigation on activation in RAW264.7 macrophage cells and protection in cyclophosphamide-treated mice of Pseudostellaria heterophylla protein hydrolysate[J]. Food and Chemical Toxicology, 2019, 134: 110816.

[8] DU X, LIAN F, LI Y, et al. Peptides from Colochirus robustus enhance immune function via activating CD3 zeta- and ZAP-70-mediated signaling in C57BL/6 mice[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(10): 2110.

[9] YANG Q, CAI X, HUANG M, et al. Isolation, identification, and immunomodulatory effect of a peptide from Pseudostellaria heterophylla protein hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(44): 12259-12270.

[10] YANG Q, CAI X, HUANG M, et al. Immunomodulatory effects of Pseudostellaria heterophylla peptide on spleen lymphocytes via a Ca(2+)/CaN/NFATc1/IFN-gamma pathway[J]. Food &Function, 2019, 10(6): 3466-3476.

[11] 叶蕾, 阎洁, 张文, 等. 文蛤寡肽对RAW264.7细胞的免疫调节作用[J]. 水产学报, 2019, 43(2): 410-418.

YE L, YAN J, ZHANG W, et al. Immunomodulatory effects of Meretrix meretrix oligopeptides on RAW264.7 cells[J]. Journal of Fisheries of China, 2019, 43(2): 410-418.

[12] HARTLEY J W, EVANS L H, GREEN K Y, et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line[J]. Retrovirology, 2008, 5(1): 1-6.

[13] HOU H, FAN Y, LI B, et al. Preparation of immunomodulatory hydrolysates from Alaska pollock frame[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(15): 3029-3038.

[14] LOZANO-OJALVO D, MOLINA E, LOPEZ-FANDINO R. Hydrolysates of egg white proteins modulate T- and B-cell responses in mitogen-stimulated murine cells[J]. Food &Function, 2016, 7(2): 1048-1056.

[15] AHN C B, CHO Y S, JE J Y. Purification and anti-inflammatory action of tripeptide from salmon pectoral fin byproduct protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2015, 168: 151-156.

[16] LEE S J, KIM E K, KIM Y S, et al. Purification and characterization of a nitric oxide inhibitory peptide from Ruditapes philippinarum[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(5): 1660-1666.

[17] SENEVIRATHNE M, AHN C B, JE J Y. Enzymatic extracts from edible red algae, Porphyra tenera, and their antioxidant, anti-acetylcholinesterase, and anti-inflammatory activities[J]. Food Science and Biotechnology, 2010, 19(6): 1551-1557.

[18] TIAN Y, WEN H, QI X, et al. Identification of mapk gene family in Lateolabrax maculatus and their expression profiles in response to hypoxia and salinity challenges[J]. Gene, 2019, 684: 20-29.

[19] SAE-LEAW T, KARNJANAPRATUM S, O’CALLA-GHAN Y C, et al. Purification and identification of antioxidant peptides from gelatin hydrolysate of seabass skin[J]. Journal of Food Biochemistry, 2017, 41(3): e12350.

[20] SENPHAN T, BENJAKUL S. Antioxidative activities of hydrolysates from seabass skin prepared using protease from hepatopancreas of pacific white shrimp[J]. Journal of Functional Foods, 2014, 6: 147-156.

[21] CHEN J, JAYACHANDRAN M, XU B, et al. Sea bass (Lateolabrax maculatus) accelerates wound healing: a transition from inflammation to proliferation[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2019, 236: 263-276.

[22] SHIN S C, AHN I H, AHN D H, et al. Characterization of two antimicrobial peptides from antarctic fishes (Notothenia coriiceps and Parachaenichthys charcoti)[J]. PLoS One, 2017, 12(1): e0170821.

[23] LIN J, CAI X, TANG M, et al. Preparation and evaluation of the chelating nanocomposite fabricated with marine algae Schizochytrium sp. protein hydrolysate and calcium[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(44): 9704-9714.

[24] 颉宇, 胡锦灵, 赵宏飞,等. 基于生物信息学定向制备柠条籽蛋白抗氧化肽的工艺优化[J]. 食品科学, 2020, 41(20): 278-284.

JIE Y, HU J L, ZHAO H F, et al. Optimization of bioinformatics-based directional preparation of antioxidant peptide from caragana seed protein[J]. Food Science, 2020, 41(20): 278-284.

[25] 尹剑, 武瑞赟, 阿热爱·巴合提, 等. 酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力[J]. 肉类研究, 2020, 34(2): 33-39.

YIN J, WU R Y, AREAI B, et al. Optimization of the conditions for the enzymatic preparation of antioxidant peptides from sturgeon skin[J]. Meat Research, 2020, 34(2): 33-39.

[26] 侯虎. 鳕鱼免疫活性肽的可控制备及其免疫活性研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2011.

HOU H. The controllable preparation of pollock immunomodulating peptide and its immunity activity[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2011.

[27] HAN L, YU J, CHEN Y, et al. Immunomodulatory activity of docosahexenoic acid on RAW264.7 cells activa-tion through GPR120-mediated signaling pathway[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(4): 926-934.

[28] MERAM C, WU J. Anti-inflammatory effects of egg yolk livetins (alpha, beta, and gamma-livetin) fraction and its enzymatic hydrolysates in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophages [J]. Food Research International, 2017, 100(1): 449-459.

[29] KASIMU R, CHEN C, XIE X, et al. Water-soluble polysaccharide from Erythronium sibiricum Bulb: structural characterisation and immunomodulating activity[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 105(1): 452-462.

[30] LI N, YANG F, SU J, et al. Structure characterization of an arabinogalactan from Cynanchum atratum and its immune stimulatory activity on RAW264.7 cells[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 194: 163-171.

[31] REN Y, ZHENG G, YOU L, et al. Structural characterization and macrophage immunomodulatory activity of a polysaccharide isolated from Gracilaria lemaneiformis[J]. Journal of Functional Foods, 2017, 33: 286-296.

[32] QIN L, CHEN S, XIE L, et al. Mechanisms of RAW264.7 macrophages immunomodulation mediated by polysaccharide from mung bean skin based on RNA-seq analysis[J]. Food Research International, 2022, 154: 111017.

[33] YANG Y, ZHAO X, LI J, et al. A beta-glucan from Durvillaea antarctica has immunomodulatory effects on RAW264.7 macrophages via toll-like receptor 4[J]. Carbohydrate Polymers, 2018, 191: 255-265.

[34] BAHRAMZADEH S, TABARSA M, YOU S, et al. An arabinogalactan isolated from Boswellia carterii: purification, structural elucidation and macrophage stimulation via NF-κB and MAPK pathways[J]. Journal of Functional Foods, 2019, 52: 450-458.

[35] 罗青, 禄璐, 闫亚美, 等. 枸杞粉及其多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫及肠道菌群的调节作用[J]. 食品科学, 2022, 43(11): 137-148.

LUO Q, LU L, YAN Y M, et al. Immunomodulatory effects of spray dried powder of goji (Lycium barbarum L.) and goji polysaccharides on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide and their regulation on gut microbiota[J]. Food Science, 2022, 43(11): 137-148.

[36] 陈洁铭, 郑涛涛, 郭丽琼, 等. 蛹虫草固体发酵物对小鼠免疫和肠道菌群的调节作用[J]. 中国食品学报, 2022, 22(7): 76-87.

CHEN J M, ZHENG T T, GUO L Q, et al. The immune and intestinal regulation effect of the solid-state fermentation of Cordyceps militaris in mice[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2022, 22(7): 76-87.

[37] 蔡琨, 杨娟, 杨翠萍,等. 仙茅提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7的诱导活化作用[J]. 中药药理与临床, 2017, 33(5): 87-91.

CAI K, YANG J, YANG C P, et al. Curculigo orchioides extract-induced activation of RAW264.7 cell[J]. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2017, 33(5): 87-91.

[38] WANG H, MA C, SUN-WATERHOUSE D, et al. Immunoregulatory polysaccharides from Apocynum venetum L. flowers stimulate phagocytosis and cytokine expression via activating the NF-κB/MAPK signaling pathways in RAW264.7 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(4): 806-814.

[39] XU R, MA L, CHEN T, et al. Sophorolipid suppresses LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells through the NF-kappaB signaling pathway[J]. Molecules, 2022, 27(15): 5037.

[40] YE Y, WANG Y, YANG Y, et al. Aloperine suppresses LPS-induced macrophage activation through inhibiting the TLR4/NF-kappaB pathway[J]. Inflammation Research, 2020, 69(4): 375-383.

[41] HUAI Q, KIM H Y, LIU Y, et al. Crystal structure of calcineurin-cyclophilin-cyclosporin shows common but distinct recognition of immunophilin-drug complexes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(19): 12037-12042.

[42] LU C, XIE T, GUO X, et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist exendin-4 mitigates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages[J]. International Immunopharmacology, 2019, 77: 105969.

[43] GIOANNINI T L, WEISS J P. Regulation of interactions of gram-negative bacterial endotoxins with mammalian cells[J]. Immunologic Research, 2007, 39(1): 249-260.

[44] CHALAMAIAH M, YU W, WU J. Immunomodulatory and anticancer protein hydrolysates (peptides) from food proteins: a review[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 205-222.

Preparation of Lateolabrax maculatus Immune Peptides and Its Bidirectional Immunomodulatory Activity on RAW264.7 Cells

LIN Sheng, CHEN Xuan, YANG Fujia, HUANG Muchen, YANG Qian, CAI Xixi*, WANG Shaoyun*

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China)

Abstract：To study the immune and anti-inflammatory activities of Lateolabrax maculatus immunomodulatory peptides (LIP), the preparation conditions of LIP were optimized by single factor experiments and response surface methodology with the stimulation index of mouse spleen lymphocytes as an indicator. RAW264.7 macrophage model was used to study the immunomodulatory effect of LIP, and anti-inflammatory activity of LIP was explored by constructing a lipopolysaccharide-induced RAW264.7 macrophage inflammatory model. The results showed that the optimal preparation conditions for LIP were as following: solid-liquid ratio 1.0∶3.8 (g/mL), enzyme adding amount 2.14%, papain hydrolysis time 56 min. Under this condition, the stimulation index of mouse spleen lymphocytes reached 2.57. The results of macrophage immunoactivity show that LIP exerted immunomodulatory activity. 400 μg/mL LIP exerted immunomodulatory effects by promoting the proliferation and phagocytosis capacity, nitric oxide and reactive oxygen species production, nitric oxide synthase (iNOS) mRNA expression, and proinflammatory cytokines secretion. Moreover, 400 g/mL LIP also showed effectively anti-inflammatory capacity by downregulating prostaglandin E2 and proinflammatory cytokines, and reducing excessive secretion of NO via inhibiting overexpression of iNOS and cyclooxygenase-2 mRNA. These results suggested that LIP exerted bidirectional immunomodulatory activity,including “increasing immune response” and “inhibiting excessive immune response”, which provided a theoretical basis for bidirectional immunomodulatory functional foods research.

Keywords：Lateolabrax maculatus immunomodulatory peptides; immune peptides; response surface methodology; bidirectional immunomodulatory; RAW264.7 macrophages

中图分类号：TS252.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200788

文章编号：2095-6002(2023)04-0094-13

引用格式：林晟, 陈选, 杨傅佳, 等. 海鲈鱼免疫肽的制备及对RAW264.7细胞双向免疫调节作用研究[J]. 食品科学技术学报,2023,41(4):94-106.

LIN Sheng, CHEN Xuan, YANG Fujia, et al. Preparation of Lateolabrax maculatus immune peptides and its bidirectional immunomodulatory activity on RAW264.7 cells[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(4):94-106.

收稿日期：2022-08-11

基金项目：中央引导地方科技发展专项项目(2020L3004); 国家自然科学基金联合基金重点项目(U1905202)。

Foundation: Central Government Guided Local Science and Technology Development Projects (2020L3004); Joint Fund of National Natural Science Foundation of China (NSFC) (U1905202).

第一作者：林 晟,男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。

*通信作者：蔡茜茜,女,副研究员,博士,主要从事食品生物技术方面的研究;汪少芸,女,教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

(责任编辑：郝一铭)