蛋白质凝胶化是一种蛋白质分子聚集过程,在此过程中吸引力和排斥力达到平衡,形成高度有序、可以容纳大量水的三维网络结构[1]。凝胶性是蛋白质重要的特性之一,赋予食品弹性、韧性等质地特性,影响食品的感官品质和商业价值[2]。蛋白质凝胶化的研究一直备受关注。

多酚因其强大的抗氧化活性和重要的药理作用已得到广泛应用[3]。酚类化合物中以茶多酚(tea polyphenol, TP)应用最为广泛,它是茶叶中的主要化学成分,由儿茶素类、黄酮、酚酸及其衍生物组成,可作为天然食品添加剂,具有抗氧化、抗炎等生物活性[4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚中儿茶素类主要单体成分之一,含有8个酚羟基,且抗氧化性更为突出;没食子酸(gallic acid, GA)为茶多酚中的主要酚酸类单体物质之一,含有4个酚羟基,也具有良好的抗氧化活性[5]。多酚与蛋白质之间具有高结合力,易与蛋白质分子中的活性部位相互作用,从而影响蛋白质的结构和凝胶特性[4, 6]。蛋清蛋白质经茶多酚改性后,蛋白质凝胶强度和持水性得以提高[7]。EGCG可提高大豆分离蛋白的凝胶性能,改善豆腐的质地和口感[8]。GA能够增强鱼糜凝胶的质构特性并保留其生物活性[9]。

平欧榛子(Corylus heterophylla×avellana)是由平榛(Corylus heterophylla Fisch. ex Trautv.)和欧榛(Corylus avellana Linn.)杂交而成,其脱脂榛仁粕中蛋白质质量分数占35%～41%,是开发新型植物蛋白质产品的良好来源[10-11]。Ilyasolu等[12]利用榛仁蛋白质的凝胶性,通过发酵榛仁浆生产出具有较高持水能力和较强抗氧化性的榛子酸奶。Gul等[13]通过葡萄糖内酯进行凝胶化可以提高脱脂榛仁饮料的理化性质,开发出一种新的具有理想结构特性的榛仁饮料产品。殷贺中等[14]研究了葡萄糖内酯对榛仁分离蛋白凝胶特性的影响,发现蛋白凝胶强度随葡萄糖内酯浓度的增加而增大。此外,多酚能够影响蛋白质消化率[15]。Jiang等[16]研究发现花青素与大豆分离蛋白(soybean protein isolate,SPI)结合使蛋白质消化率增加,且消化产物抗氧化性增加。Lin等[17]利用儿茶素与大豆球蛋白结合,增加了蛋白质的消化率。目前,多酚类物质对平欧榛仁分离蛋白(hazelnut protein isolate, HPI)凝胶特性影响方面研究较少,且未见有关平欧榛仁分离蛋白-多酚凝胶经消化后蛋白质消化吸收率及消化产物抗氧化性变化规律的报道。本研究探讨了TP、EGCG和GA对HPI结构性质、凝胶特性、凝胶结构性质、蛋白质消化率、消化产物抗氧化性的影响,以期为利用平欧榛仁蛋白质开发新型凝胶产品提供理论依据,进一步提高平欧榛仁粕的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平欧榛子由黑龙江省林科院提供。

茶多酚,质量分数为98%,上海金畔生物科技有限公司;表没食子儿茶素没食子酸酯,质量分数为98%,上海源叶生物科技有限公司;没食子酸,质量分数为98%,美国Sigma公司;溴化钾,光谱纯,天津光复科技发展有限公司;胃蛋白酶(3 000 U/g),北京索莱宝生物科技有限公司;胰蛋白酶(250 U/mg),北京索莱宝生物科技有限公司;石油醚、氢氧化钠、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane, Tris)、甘氨酸、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝G-250、甲醇、冰乙酸、氯化钠、尿素、考马斯亮蓝R-250、8-苯胺基-1-萘磺酸钠(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)、5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸(5,5-dimercapto-2,2-dinitrobenzoic acid, DTNB)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-LX-H185C型高速离心机,上海力辰仪器科技有限公司;CT3型质构仪,美国Brookfield公司;YTLG-10A型冷冻干燥机,上海叶拓科技有限公司;752型可见光分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;JSM-7500F型冷场发射扫描电镜,日本电子公司;AR2000ex型旋转流变仪,美国TA公司;FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪,天津港东科技发展股份有限公司;LS55型荧光光谱仪,美国Perkin Elmer公司;Nicolet iN10型傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HPI的提取

参照Aydemir等[18]的方法并稍作修改。将榛子去壳、剥皮后粉碎过40目筛,用索氏抽提法去除油脂得到脱脂榛仁粕。按m(脱脂榛仁粕)∶V(水)=1 g∶10 mL加水,得到脱脂榛仁粕浆液。用1 mol/L NaOH水溶液调节浆液pH值为9.0,在室温下磁力搅拌1 h,离心(4 000 r/min, 20 min)。将得到的上清液用1 mol/L盐酸调节其pH值为4.5,在室温下磁力搅拌1 h,离心(4 000 r/min, 20 min),留沉淀。将沉淀悬浮在蒸馏水中,调整溶液pH值至7.0,-20 ℃冷冻,冻干,得到HPI。

1.3.2 HPI-多酚复合物及凝胶的制备

经前期预实验,将HPI配制成质量分数为28%的蛋白质水溶液,均匀溶解后置于4 ℃冰箱过夜使其充分水合。将多酚(TP、EGCG、GA)配制成一定浓度的水溶液,加入HPI中,使3种多酚类物质在溶液中最终质量分数为0.04%,HPI最终质量分数为20%。调节pH值为7.0,隔绝空气绝氧搅拌2 h,使其充分反应,得到HPI-多酚复合溶液。将HPI-多酚复合溶液冷冻干燥后,得到HPI-多酚复合物,可用于结构性质测定。

将HPI-多酚复合溶液置于10 mL的小烧杯中,用封口膜密封后于95 ℃水浴加热20 min,立即冷却至室温并置于4 ℃冰箱冷藏过夜,得到HPI-多酚凝胶。将HPI-多酚凝胶进行冷冻干燥,得到HPI-多酚凝胶粉,用于凝胶结构性质测定。

1.3.3 HPI-多酚复合物结构性质的测定

1.3.3.1 蛋白质分子量测定

参照Xu等[19]方法用SDS-PAGE测定,并修改。取10 μL配制的10 mg/mL HPI-多酚复合物(或HPI)水溶液,与10 μL上样缓冲液混合,95 ℃变性 5 min。 上样量10 μL,分离胶和浓缩胶质量分数分别为15%和5%。电泳先于80 V恒定电压下进行,到分离胶时增大至120 V。考马斯亮蓝R-250进行染色,甲醇-醋酸水溶液进行脱色。

1.3.3.2 蛋白质二级结构的测定

参考Zheng等[20]的方法用傅里叶变换红外光谱测定复合物二级结构。将冻干后的HPI-多酚复合物(或HPI)与KBr按质量比为1∶100的比例混合,用红外压片机进行压片。样品在400～4 000 cm-1内进行扫描。光谱分辨率为4.0 cm-1,扫描32次。采用Peak Fit V4.12进行峰拟合对样品蛋白质二级结构含量进行定量分析。

1.3.3.3 蛋白质三级结构的测定

参照Wang等[21]方法用荧光光谱测定。配制0.1 mg/mL HPI-多酚复合物(或HPI)水溶液,采用荧光光谱仪测定其三级结构,激发波长为280 nm,发射波长为300～500 nm,扫描速度为1 500 nm/min。激发和发射的狭缝宽度分别为5 nm和2.5 nm。

1.3.4 HPI-多酚凝胶特性的测定

1.3.4.1 凝胶硬度测定

将1.3.2节中制备的凝胶放室温平衡30 min。参照Zhang等[22]的方法并修改。将凝胶切成2.5 cm×2.5 cm×2 cm的立方体,用CT3型质构仪Bloom模式测定凝胶硬度。参数设置:选用TA 10 (12.7 mm)探头,测前速度2.0 mm/s,测试速度0.5 mm/s,测后速度0.5 mm/s,测试距离4 mm,触发力0.4 N。

1.3.4.2 凝胶持水性测定

参照秦新生[23]的方法稍加修改。取0.5 g凝胶样品置于10 mL离心管中,离心(8 000 r/min, 20 min),用滤纸吸干离心管内的水分,记录离心前后离心管和凝胶样品的总质量。按式(1)计算凝胶持水性。

持水性

(1)

式(1)中,m1为凝胶样品中所含水分的总质量,g;m0为离心后溢出水分的凝胶质量,g。

1.3.4.3 凝胶微观结构测定

将冻干凝胶进行喷金处理,通过扫描电镜观察凝胶的微观结构,加速电压5 kV,放大倍率为2 000倍[24]。

1.3.4.4 凝胶流变学特性测定

将1.3.2节中样品溶液放置于旋转流变仪上,几何平行板直径40 mm、间隙1 mm。以3 ℃/min的加热速率使温度从25 ℃加热至95 ℃,95 ℃保温20 min,冷却到25 ℃。固定频率1 Hz,恒定应变1%,记录储能模量G′、损耗模量G″随温度变化的规律[25]。

1.3.5 HPI-多酚凝胶结构性质的测定

1.3.5.1 傅里叶变换红外光谱测定

参照刘鑫硕等[26]的方法并修改。取适量凝胶样品置于样品台,收集红外光谱。温度25 ℃,扫描范围400～4 000 cm-1,扫描次数64次,扫描速率4 cm-1。选择光谱中1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ带进行分析。

1.3.5.2 表面疏水性测定

参照Zhang等[27]方法,取0.1 g凝胶于15 mL 0.01 mol/L(pH=7.0)的磷酸盐缓冲液中离心(8 000 r/min, 15 min)。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将上清液稀释成0.150、0.075、0.038、0.019 mg/mL的样品溶液。取3 mL样品溶液加入30 μL 8 mmol/L ANS溶液,激发波长365 nm,发射波长484 nm,用荧光光谱仪测定其荧光强度。以样品溶液质量分数为横坐标,荧光强度为纵坐标,线性拟合得到一次函数,其斜率为表面疏水性(H0)。

1.3.5.3 游离巯基含量测定

参照Xue等[28]的方法并修改。取0.1 g凝胶溶于10 mL 0.1 mol/L (pH=8.0)PBS缓冲液中,12 000 r/min均质2 min,混合物离心(8 000 r/min, 20 min),采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量。

将0.2 mL上清液与2.8 mL Tris-Gly缓冲液(0.1 mol/L Tris、0.1 mol/L Gly、4 mmol/L EDTA,pH=8.0)混合后,加入20 μL Ellman’s试剂(4 mg/mL DTNB,溶剂为Tris-Gly缓冲液)。溶液在40 ℃反应40 min以充分显色,并在412 nm下测定吸光度。PBS缓冲液作为样品空白。游离巯基含量按式(2)计算。

(2)

式(2)中,A412为412 nm下的吸光度;ρ为样品上清液的质量浓度,mg/mL;D为稀释因子15.1。

1.3.5.4 分子间相互作用力测定

参照Xue等[29]方法测定凝胶分子间作用力。将0.6 g凝胶样品溶于5.4 mL S1溶液(0.6 mol/L NaCl),室温下平衡30 min。离心后收集上清液并标记为S1。沉淀物继续溶解于5.4 mL S2溶液(1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合水溶液)中,离心收集上清液并标记为S2。沉淀物继续依次溶解于S3溶液(8.0 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合水溶液)和S4溶液(8.0 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl和0.5 mol/L β-巯基乙醇的混合水溶液)中,离心取上清液,分别标记为S3、S4。S4上清液在0.6 mol/L NaCl溶液中透析24 h,去除β-巯基乙醇。用考马斯亮蓝法测定上清液(S1、S2、S3、S4)中的蛋白质含量,即表示蛋白质凝胶的主要作用力,分别为离子键(S1)、氢键(S2)、疏水相互作用(S3)和二硫键(S4)。

1.3.6 凝胶蛋白质消化率及消化产物抗氧化性测定

1.3.6.1 凝胶蛋白质消化率测定

参照Minekus等[30]方法并修改。按照表1配制模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)和模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF)。

参照钟坦君等[9]的方法并修改,进行模拟胃消化。称取5 g凝胶,加入5 mL蒸馏水,12 000 r/min均质2 min后与10 mL模拟胃消化液(9 mL SGF原液、0.3 mg CaCl2、0.15 g胃蛋白质酶)混合均匀,用1 mol/L HCl调整溶液pH值为2.0,37 ℃水浴震荡2 h,0.5 mol/L NaHCO3调整溶液pH值为7.0,结束反应。

向已配制的消化液中加入20 mL模拟肠消化液(19 mL SIF、16 mg胰蛋白质酶、164 mg胆盐、0.6 mg CaCl2),混合均匀后置于37 ℃水浴震荡2 h,调整溶液pH值为2.0,结束反应。9 000 r/min离心10 min,收集上清液。采用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量,剩余消化液用于消化产物抗氧化活性测定。

蛋白质消化率计算见式(3)。

蛋白质消化率

(3)

式(3)中,V为总消化液体积,mL;ρ蛋白质为消化液中的蛋白质质量浓度,mg/mL;m凝胶为凝胶质量,g;w为凝胶中蛋白质含量,%。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率测定

参照Sripokar等[31]的方法。用95%乙醇配制0.15 mmol/L DPPH乙醇溶液,置于暗处保存。取1.5 mL样品与1.5 mL DPPH混合,混匀避光放置30 min。517 nm下测定吸光度。用蒸馏水代替样品制备空白。DPPH自由基清除率按式(4)计算。

DPPH自由基清除率

(4)

式(4)中,A517样品为517 nm下样品吸光度;A517对照为517 nm下对照样品吸光度。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除率测定

配制ABTS+工作液:7.4 mmol/L ABTS+溶液与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液混合,室温暗处反应 12 h,使用时用蒸馏水稀释。在734 nm下测定吸光度,使其为0.70±0.02。0.5 mL样品与2.5 mL ABTS+工作液混合,室温避光反应10 min,734 nm下测定吸光度[9]。ABTS+自由基清除率按式(5)计算。

ABTS+自由基清除率

(5)

式(5)中,A734样品为734 nm下样品吸光度;A734对照为734 nm下对照样品吸光度。

1.4 数据处理

所有实验设3个重复,实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan显著性分析,P<0.05 表示差异显著。采用Origin 2018、PeakFit V4.12和Excel软件进行数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 HPI-多酚复合物结构性质分析

2.1.1 蛋白质分子量分析

SDS-PAGE电泳图谱见图1。图1显示了3种多酚类物质对HPI蛋白质分子量的影响。HPI分子质量主要分布在68、50、35、23、22、20、17 kDa,这与吕春茂等[32]研究结果相似。与TP、EGCG、GA结合后,蛋白质分子质量仍以35、23、22、20 kDa为主,证明分子质量小于35 kDa的蛋白质为主要蛋白质。分子质量为68、50、27、17 kDa条带明显减弱,表明3种多酚与HPI结合,导致条带减弱[28]。这是由于HPI与3种多酚类物质结合后,蛋白质侧链活性基团减少,减少了HPI与考马斯亮蓝的结合,从而使复合物条带谱图颜色变浅[29]。

2.1.2 蛋白质二级结构分析

HPI和HPI-多酚复合物FTIR光谱见图2。由于O—H和N—H分子间氢键的拉伸振动,在3 200～3 400 cm-1出现了一个吸收峰,且峰值位置发生了不同程度的偏移,表明HPI与3种多酚类物质存在氢键作用[33]。这是由于多酚类物质的加入导致更多的酚羟基进入体系中,促进HPI与3种多酚类物质形成氢键。2 960 cm-1处吸收峰为蛋白质CH3和CH2基团的C—H拉伸振动,峰位的变化可以用来研究HPI与3种多酚类物质之间是否存在疏水相互作用[34]。与HPI相比,3种复合物在2 960 cm-1发生红移,说明HPI与3种多酚类物质发生疏水相互作用[35]。HPI及HPI-多酚复合物二级结构含量见表2。由表2可知,HPI与3种多酚类物质反应后,α-螺旋含量降低,β-折叠和无规则卷曲含量增加,表明HPI与多酚类物质之间的相互作用改变蛋白质二级结构并导致HPI结构展开[36]。

2.1.3 蛋白质三级结构分析

荧光光谱是一种表征蛋白质三级结构的高灵敏度方法,通常用于研究蛋白质与多酚结合时的结构变化[37]。HPI和HPI-多酚复合物内源荧光光谱见图3。由图3可知,当激发波长为280 nm时,HPI最大发射波长(λmax)为344.5 nm。添加TP、EGCG和GA后,HPI荧光强度分别下降了31.86%、40.71%、16.12% (P<0.05),表明色氨酸可能参与了HPI与多酚的相互作用导致荧光强度降低,发生了荧光淬灭[38]。对HPI淬灭能力由大到小依次为EGCG、TP、GA。一般来说,折叠态的蛋白质荧光强度相对较高,λmax相对较短;而部分或完全展开状态的蛋白质荧光强度相对较小,λmax更长[39]。与HPI相比,HPI-TP、HPI-EGCG、HPI-GA复合物λmax分别发生红移(HPI-TP 3.5 nm、HPI-EGCG 4.0 nm、HPI-GA 1.5 nm),可能是由于3种多酚类物质的加入使蛋白质结构展开,色氨酸残基更多地暴露在极性环境中,表面疏水性下降[40]。这进一步说明3种多酚类物质通过疏水相互作用与HPI结合,掩盖了疏水基团表征[41]。

2.2 HPI-多酚凝胶特性分析

2.2.1 凝胶硬度分析

凝胶硬度是评价蛋白质凝胶的重要特性之一。对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶的硬度进行测定,结果见图4。由图4可知,3种多酚类物质均能显著提高热诱导HPI的凝胶硬度。HPI-TP、HPI-EGCG、HPI-GA与HPI相比凝胶硬度分别提高了47.77%、59.87%、10.76% (P<0.05)。由于TP、EGCG、GA中含有的酚羟基能够与蛋白质紧密结合,使蛋白质交联,聚集了大量的二硫键,促进了蛋白质凝胶结构的稳定性,提高了凝胶硬度[29]。因此3种多酚类物质可作为促进HPI胶凝的改良剂,且改良效果从强到弱依次为EGCG、TP、GA。这可能是由于EGCG和TP含有大量的酚羟基,可以与更多的HPI羰基结合,且EGCG分子量大于TP,结合能力更强。而GA分子量低,为HPI提供的结合位点少,导致相互作用或结合能力较弱[42]。

2.2.2 凝胶持水性分析

凝胶持水性是表征蛋白质凝胶体系中蛋白质与水相互作用的重要指标,与蛋白质的凝胶结构和水-蛋白质相互作用状态有关[8, 43]。对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶持水性进行测定,结果见图5。由图5可知,与HPI凝胶相比,HPI-TP、HPI-EGCG、HPI-GA凝胶持水性分别提高了37.20%、39.74%、28.17% (P<0.05),表明3种多酚类物质均能显著提高HPI凝胶持水性。这是由于TP、EGCG、GA与蛋白质交联后,通过氢键吸附大量的水分子,提高了蛋白质结合水的能力[29]。致密稳定的凝胶结构能够紧紧包裹水分子,从而增强凝胶持水性[43]。王晨笑等[44]通过热诱导形成SPI-EGCG凝胶,形成更牢固的凝胶网络,提高凝胶持水性。凝胶持水性效果从强到弱依次为EGCG、TP、GA,可能是由于EGCG和TP结构中的邻苯二酚基团是极好的电子供体,与HPI结合能力更强,氢键作用更强[45]。

2.2.3 凝胶微观结构分析

扫描电镜可以在微观水平上表征蛋白质凝胶的形状和大小[43]。HPI凝胶及HPI-多酚凝胶的外观和微观结构见图6。由图6可知,HPI凝胶微观结构不规则,孔隙较大。添加TP、EGCG、GA后,凝胶孔隙缩小,蛋白质聚集程度增加,表明3种多酚类物质可以有效改善热诱导平欧榛仁蛋白质凝胶的微观结构。这可能是由于蛋白质肽链上的氨基和羧基易与3种酚类化合物上的酚羟基交联,促进蛋白质聚集形成大分子聚集体,有利于热诱导过程中形成凝胶网络,促进二硫键形成[29,46]。Zhou等[47]研究表明,经多酚修饰蛋清蛋白质的凝胶结构更加规则和致密。蛋白质凝胶的微观结构会影响凝胶硬度,网状结构较密的凝胶则具有较强的刚性和较高的凝胶硬度,这与蛋白质凝胶硬度和持水性趋势一致。这可能是由于HPI-GA凝胶中孔隙较HPI-TP和HPI-EGCG多,密集度低于HPI-TP和HPI-EGCG,导致凝胶硬度和持水性的差异显著。

2.2.4 凝胶流变性分析

图7(a)至图7(d)分别表示HPI凝胶、HPI-TP凝胶、HPI-EGCG凝胶、HPI-GA凝胶的储能模量(G′)和损耗模量(G″)随温度和时间的变化关系。G′是凝胶在变形过程中由于弹性变形而储存在凝胶中的能量,它反映了体系的固体性质,与凝胶弹性有关[48]。G″描述了凝胶的黏性特征,黏性越大,持水性越好[49]。升至一定温度后,G′逐渐大于G″,表明蛋白质在凝胶化过程形成弹性蛋白质凝胶网络。随着温度进一步升高,G′和G″逐渐增加,这可能是由于蛋白质之间的交联逐渐增强[21]。

凝胶时间(tgel)被定义为G′急剧增加且大于1 Pa的点[50]。HPI的tgel为1 226 s,随后呈现G′ >G″的趋势,表明样品呈现典型的凝胶化行为。与对照组相比,添加TP、EGCG、GA后,凝胶时间分别缩短了和均大于和并且G′ >G″,说明多酚加速了HPI的凝胶化,提高了凝胶的黏弹性,这与凝胶硬度结果一致。这可能是由于在热诱导过程中多酚氧化形成的醌类物质与HPI相互作用导致G′和G″值较高,形成了分子质量较高的蛋白质交联[47]。Von Staszewski等[51]研究也证实多酚能加速β-乳球蛋白的凝胶化,缩短胶凝时间,提高凝胶的黏弹性。综合凝胶的储能模量和凝胶时间判断,HPI-EGCG储能模量高于HPI-TP和HPI-GA。这可能是因为EGCG分子量大于TP和GA,能提供更多的结合位点,与HPI结合能力更强[42]。

2.3 HPI-多酚凝胶结构性质分析

2.3.1 蛋白质二级结构分析

HPI和HPI-多酚凝胶FTIR光谱见图8。1 540.88 cm-1代表酰胺Ⅱ带中N—H弯曲和C—N拉伸振动;1 632.70 cm-1代表酰胺Ⅰ带中CO拉伸振动;2 924.81 cm-1代表亚甲基不对称振动[52]。由图8可知,添加TP、EGCG、GA后酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带均发生了不同程度位移,说明3种多酚类物质可能与蛋白质中的CO、N—H、C—N结合,改变了蛋白质的二级结构。HPI-多酚凝胶在3 200～3 400 cm-1有很强的吸收峰,代表蛋白质氢键和O—H伸缩振动,该峰的位移表明氢键的变化[53]。与HPI相比,TP和EGCG的加入使O—H吸收峰从3 270.55 cm-1分别向低波段轻微移动,表明氢键作用增强,能够吸纳更多的水分子,这与本研究中凝胶持水性增加结果一致。HPI-GA的波数(3 266.31 cm-1)高于HPI-TP (3 262.90 cm-1)和HPI-EGCG (3 262.57 cm-1) (P<0.05),推断GA形成的氢键比TP和EGCG少,导致蛋白质水合作用较TP和EGCG弱,HPI-GA凝胶比HPI-EGCG和HPI-TP凝胶持水性低[52]。

HPI凝胶及HPI-多酚凝胶二级结构含量见 表3。酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)是FTIR光谱中蛋白质二级结构信息最丰富的区域。由表3可知,TP、EGCG、GA使HPI凝胶α-螺旋含量分别增加了175.56%、188.00%、78.56%,这是因为多酚类物质中的酚羟基与蛋白质结合会增强氢键,促进α-螺旋含量增加,表明蛋白质凝胶结构将转变为更紧凑的构象[54]。与HPI凝胶相比,HPI-TP凝胶和HPI-EGCG凝胶中β-折叠含量增加、β-转角和无规则卷曲含量下降。其中β-折叠含量占比较高,是主要的二级结构。β-折叠含量越高,越有利于形成聚集体,表明TP和EGCG可使蛋白质凝胶具有相对稳定和有序的结构[29]。HPI-GA凝胶中β-折叠含量降低,使HPI聚集程度下降;β-转角含量增加可能与α-螺旋增加有关。β-转角增加会压缩凝胶结构,使凝胶硬度增大[28]。这与凝胶硬度的结果是一致的。无规则卷曲属于无序结构,与HPI凝胶相比差异不显著,但与HPI-TP凝胶、HPI-EGCG凝胶差异显著,表明HPI-TP凝胶和HPI-EGCG凝胶较HPI-GA凝胶网络结构相对稳定。FTIR结果表明,EGCG、TP与HPI相互作用会增加凝胶样品的聚集,使凝胶结构更加致密。GA则通过增加α-螺旋和β-转角含量压缩凝胶结构,从而提高凝胶硬度。

2.3.2 表面疏水性分析

表面疏水性通过影响蛋白质分子的交联和聚集,从而影响蛋白质的稳定性[55]。对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶表面疏水性进行测定,结果见图9。由图9可知,TP、EGCG作为连接蛋白质的交联剂,可使HPI-TP、HPI-EGCG聚集程度加深,暴露的疏水基团在蛋白质中重新聚集,导致表面疏水性降低。此外,TP、EGCG也可与蛋白质中的色氨酸残基相互作用,并抑制了ANS与蛋白质表面疏水位点的结合,从而降低了表面疏水性[29]。对于HPI-GA来说, GA与蛋白质相互作用,使蛋白质分子链向外延伸,经热诱导后分子内更多的疏水基团暴露,参与凝胶网络构建,有利于增强凝胶特性[56]。

2.3.3 游离巯基分析

巯基很容易受到酚类化合物的攻击,影响蛋白质的功能特性和食品的最终质地[4]。HPI与HPI-多酚凝胶游离巯基含量变化见图10。由图10可知,3种酚类化合物的添加使HPI游离巯基含量显著下降(P<0.05),这可能是由于多酚在中性pH值下,巯基易发生去质子化,形成硫醇阴离子(RS-),可与蛋白质中的羰基反应[57]。此外,在热诱导过程中,3种多酚类物质易被氧化为醌,而醌上的活性基团易将凝胶中的游离巯基氧化为二硫键,从而降低游离巯基含量[58]。这也可以表明凝胶中的二硫键含量高于HPI,这与本实验中凝胶分子间作用力结果一致。HPI-EGCG和HPI-TP凝胶游离巯基含量与HPI-GA差异显著,这可能是由于多酚中的酚羟基数量和分子量大小会影响其与蛋白质的结合性能和亲和力[4]。GA含有4个酚羟基,且分子质量低于TP和EGCG,因此其与HPI的结合能力低于TP和EGCG[5]。Xue等[43]认为当大量游离巯基被氧化成二硫键时,蛋白质表面的游离巯基含量较低,这与本实验结果一致。

2.3.4 凝胶分子间作用力分析

对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶分子间作用力进行测定,结果见图11。蛋白质凝胶的主要作用力包括离子键(S1)、氢键(S2)、疏水相互作用(S3)和二硫键(S4)。由图11可知,氢键和二硫键是维持HPI-TP、HPI-EGCG凝胶的主要作用力,其次是疏水相互作用和离子键。添加TP和EGCG后,凝胶中离子键含量无明显差异(P>0.05)、氢键和二硫键含量增加、疏水相互作用下降。所有凝胶中离子键含量最低,可能是由于热处理对离子键的破坏,离子键的比例相对较小[59]。氢键含量增加可能是由于酚类化合物含有酚羟基,亲水基团可通过氢键与蛋白质结合[60]。疏水相互作用减弱说明,多酚的加入会促进蛋白质凝胶的聚集和重排,改变HPI在热诱导过程中的聚集行为。二硫键含量增加可能是由于酚类化合物在热处理过程中易氧化成醌类物质,这些活性基团通过氧化蛋白质表面的巯基形成二硫键,促进蛋白质之间的连接,凝胶结构更稳定[29]。疏水相互作用和二硫键是维持HPI-GA凝胶的主要作用力。GA的加入使离子键含量降低,氢键、疏水相互作用和二硫键含量增加。离子键含量降低可能是酚类化合物破坏了蛋白质凝胶的离子键[61]。氢键含量增加但低于HPI-TP和HPI-EGCG,可能因为二级结构中α-螺旋含量低于TP和EGCG。疏水相互作用含量增加表明,GA加入会促进HPI结构适度展开,疏水基团暴露,表面疏水性增加,这与表面疏水性结果一致。二硫键含量增加可能是由于GA使蛋白质巯基暴露,并将其氧化成二硫键,促进蛋白质交联[9]。而二硫键含量增加低于TP和EGCG,可能是由于GA酚羟基数量低于TP和EGCG,使巯基转化为二硫键的能力较弱。但与未添加多酚的平欧榛仁蛋白质凝胶相比,GA能够改善其凝胶特性。

2.4 凝胶蛋白质消化率及消化产物抗氧化性分析

2.4.1 凝胶蛋白质消化率分析

蛋白质消化率是影响凝胶品质的重要指标。采用体外消化系统(胃蛋白酶和胰蛋白酶)研究HPI-多酚凝胶的蛋白质消化率。对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶蛋白质消化率进行测定,结果见图12。由图12 可知,与HPI凝胶相比,TP和EGCG的加入使凝胶蛋白质消化率显著降低(P<0.05),HPI-TP和HPI-EGCG凝胶蛋白质消化率差异不显著(P>0.05)。由于蛋白质凝胶的消化率取决于蛋白质凝胶结构,而致密的网络结构会降低消化率,这与本研究中的凝胶硬度和微观结构结果一致[62]。此外,Shen等[63]研究表明,EGCG在一定程度上也会降低胰蛋白质酶活性。添加GA后,凝胶蛋白质消化率显著提高(P<0.05),这表明适量浓度GA的添加有利于HPI凝胶的消化。这可能与蛋白质表面疏水性增强有关[64]。GA与HPI中的芳香族氨基酸反应,使蛋白质结构展开,疏水基团暴露,有利于蛋白质酶进入HPI内部进行酶解,这与钟坦君等[9]研究结果一致。

2.4.2 DPPH自由基清除率分析

抗氧化剂可以通过电子或氢供体机制与DPPH反应,导致颜色的显著变化。因此,DPPH自由基清除能力是评价抗氧化性最常用的指标之一[65]。对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶消化产物进行DPPH自由基清除率测定,结果见图13。由 图13 可知,未添加酚类化合物的HPI凝胶消化产物表现出一定的DPPH自由基清除率(67.82%),可能是由于平欧榛仁蛋白经蛋白酶作用后产生的小分子肽和氨基酸具有一定的抗氧化性。Aydemir等[18]研究也证实了HPI经体外消化后具有抗氧化性。与对照组相比,添加TP、EGCG、GA后,蛋白质凝胶体外消化产物的DPPH自由基清除率显著提高(P<0.05),表明HPI-多酚凝胶经热诱导和体外消化后仍保留了自身的生物活性。这可能是由于HPI和多酚在高温下发生了共价结合,形成了更稳定的反应产物,从而终止了自由基链反应,达到清除自由基的目的[66]。

2.4.3 ABTS+自由基清除率分析

对HPI凝胶及HPI-多酚凝胶消化产物进行ABTS+自由基清除率测定,结果见图14。由图14可知,所有蛋白质凝胶样品的抗氧化能力在经体外消化后均显著增加(P<0.05)。这与DPPH自由基清除率结果有所不同,可能是由于二者不同的反应机制所导致的实验结果差异。综合DPPH和ABTS+自由基清除率而言,HPI-GA凝胶自由基清除能力较HPI-TP凝胶和HPI-EGCG凝胶弱,说明向HPI中引入更多的羟基可以提高蛋白质凝胶的抗氧化活性[67]。尽管在热诱导过程中一些酚羟基可能被氧化并与蛋白质侧链基团发生反应,但添加酚类化合物的蛋白质凝胶比未添加酚类化合物的蛋白质凝胶表现出更好的抗氧化能力[68-69]。

3 结 论

3种多酚类物质通过氢键和疏水相互作用与HPI结合。TP、EGCG和GA能够显著改善HPI凝胶特性并增强其消化产物抗氧化性。经热诱导后,TP、EGCG促进了HPI凝胶中氢键和二硫键作用,形成致密的凝胶结构,提高了其凝胶硬度、持水性和储能模量,降低了凝胶蛋白质消化吸收率。GA促进了HPI凝胶中二硫键和疏水相互作用,形成了较为致密的凝胶结构,增强了其凝胶特性,提高了凝胶蛋白质消化吸收率。与TP和GA相比,EGCG对HPI凝胶特性的改善作用更强。希望本研究可为制备榛仁蛋白凝胶提供合理的多酚种类的选择,为平欧榛仁蛋白质的利用提供新的途径。在此研究的基础上,未来需要继续探究不同环境因素对HPI-多酚凝胶特性的影响,扩大复合凝胶在食品工业中的应用范围。

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Effect of Polyphenols on Gel Properties and in vitro Digestive Properties of Hazelnut (Corylus heterophylla×avellana) Protein Isolate

ZHANG Wen1, ZHAO Yuhong 1,2,*

(1.School of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2.Key Laboratory of Forest Food Resources Utilization of Heilongjiang Province, Harbin 150040, China)

Abstract：Binding of polyphenols to proteins could affect protein gel properties and thus the texture of food. Hazelnut protein isolate (HPI) was taken as raw material, three polyphenols (TP), including tea polyphenols, epigallocatechin gallate (EGCG) and gallic acid (GA), were combined with HPI. The effects of three polyphenols on the structural properties, gel characteristics, gel structural properties, protein digestibility and the antioxidant properties of digestion products were investigated. The results showed that all the three polyphenols could promote HPI structure unfolding and combine with HPI through hydrophobic interaction and hydrogen bond. With the addition of TP, EGCG and GA, the gel strength of HPI gels were increased by 47.77%, 59.87% and 10.76% (P<0.05), respectively, and the water holding capacity of HPI gels were increased by 37.20%, 39.74% and 28.17% (P<0.05), respectively. Compared with HPI gel, HPI-TP gel and HPI-GA gel, scanning electron microscopy showed that the microstructure of HPI-EGCG gel was denser, and gel rheological properties showed higher storage modulus of HPI-EGCG gel, and Fourier transform infrared spectroscopy showed that the HPI-EGCG gel had stronger hydrogen bonding, higher β-folding content, and better gel strength and water retention. The results of gel intermolecular force showed that hydrogen bond and disulfide bond were the main forces maintaining HPI-TP gel and HPI-EGCG gel. Hydrophobic interaction and disulfide bond were the main forces maintaining HPI-GA gel. Compared with HPI gel, HPI-TP gel and HPI-GA gel, HPI-EGCG gel had lower content of free sulfhydryl groups, higher content of disulfide bonds and more stable gel structures. After in vitro digestion, TP and EGCG decreased HPI gel protein digestibility, and GA increased HPI gel protein digestibility (P<0.05). Among the four gels, the digestion products of HPI-EGCG gel had stronger antioxidant properties (P<0.05). Polyphenols could effectively improve the gel properties of HPI and retain its antioxidant properties, with HPI-EGCG gels having the best gel properties and antioxidant properties of digestion products. It was hoped that the results of the study would provide a theoretical basis for the development and utilization of new hazelnut isolate protein gel products.

Keywords：Corylus heterophylla×avellana; hazelnut protein isolate; polyphenols; gel properties; digestive properties

中图分类号：TS202.1

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202300033

文章编号：2095-6002(2023)04-0038-16

引用格式：张雯,赵玉红. 多酚对平欧榛仁分离蛋白凝胶特性及体外消化特性的影响[J]. 食品科学技术学报,2023,41(4):38-53.

ZHANG Wen, ZHAO Yuhong. Effect of polyphenols on gel properties and in vitro digestive properties of hazelnut (Corylus heterophylla×avellana) protein isolate[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(4):38-53.

收稿日期：2023-01-16

基金项目：黑龙江省科技厅重点攻关项目(GC12B203)。

Foundation: Key Project of Science and Technology Department of Heilongjiang Province (GC12B203).

第一作者：张 雯,女,硕士研究生,研究方向为天然产物化学。

*通信作者：赵玉红,女,副教授,博士,主要从事天然产物化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)