大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)具有较高的营养价值和较好的功能特性,被广泛用于食品体系中[1-2]。多酚具有较高的生物活性,但较差的溶解性限制了其应用范围,目前已有大量研究证实,多酚能与SPI发生相互作用形成共价或非共价复合物,进而影响蛋白质的结构,同时提高多酚的溶解性和蛋白质的乳化性等功能性质[3-6]。蛋白质功能特性改变的本质是其结构的变化,而蛋白质与多酚复合条件,如温度、处理方式、pH值,会严重干预复合物结构[7]。

研究发现,pH值的改变也同样会诱导蛋白质结构展开,疏水基团暴露,进而影响蛋白质与多酚的结合度及相互作用方式。伏二伟等[8]研究发现,碱性条件下,单宁酸与麦醇溶蛋白交联程度随pH值的增大呈先升高后降低的趋势,碱性条件多酚易被氧化为醌中间体,与蛋白质的某些氨基酸生成共价键,增大二者相互作用程度[9];而当pH值大于10时,强碱环境下多酚与蛋白质均携带负电,分子间斥力增大,二者交联度下降[10]。王团结等[11]研究发现,随着pH值的增加,茶多酚与SPI复合乳液的乳化活性和乳化稳定性先降低后增强,其乳化活性和乳化稳定性在碱性条件下比在酸性条件下强。可见pH值的改变会影响多酚与蛋白质相互作用及蛋白质的功能性。

儿茶素是多酚的一种,结构中含有多个羟基基团,蛋白质亲和力更强,有利于新形成的复合物功能改善[12],并具有抑菌、防腐、保鲜、抗氧化的功效。已有研究证实,儿茶素可以与乳清蛋白[13]、大豆分离蛋白[14]、蛋清蛋白等相互作用[15]。但是,pH值是否影响儿茶素与SPI之间的相互作用目前还尚不可知,其相互作用机制也不明晰。本研究着重探究了pH值对儿茶素与SPI相互作用的影响,分析不同pH值对儿茶素与SPI结合亲和力、SPI热稳定性、二级和三级结构、乳化性的影响,并深入探讨儿茶素与SPI的相互作用方式、作用位点等作用机制,以期为多酚-蛋白质相互作用理论及儿茶素、SPI的综合利用提供理论依据与支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

儿茶素(质量分数大于98%),安徽合肥博美生物有限公司;大豆分离蛋白(质量分数98.7%),哈尔滨商业大学旅游烹饪学院烹饪实验室自提;大豆油,哈尔滨九三粮油工业集团有限公司;其他试剂均为分析纯,整个实验过程中均使用去离子水。

1.2 仪器与设备

H1850R型高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV-800型紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;DSC 4000型差示扫描量热仪,珀金埃尔默股份有限公司;LS55型荧光光谱仪,美国PerkinElmer公司;Chirascan型圆二色光谱仪,英国Applied Photophysics公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SPI提取

参考Speroni等[16]的制备方法并适当修改,利用碱溶酸沉的方法获取SPI。将600 g脱脂豆粕加入9 L去离子水中,NaOH溶液(2 mol/L)调节pH值至7.8,搅拌2 h后于8 681 r/min离心20 min,上清液用盐酸(2 mol/L)调节pH值至4.5,4 ℃环境中静置1 h,倒出上清液,沉淀在8 681 r/min下离心10 min,离心后取下部沉淀,用5倍体积蒸馏水清洗后,于8 681 r/min离心10 min,用NaOH溶液(2 mol/L)调节蛋白质溶液至中性。提取后的SPI溶液冻干并研磨,即可获得SPI。利用全自动凯氏定氮仪测定SPI质量分数为98.32%。

1.3.2 复合物样品制备

参考Zhou等[17]的方法并适当修改,将10 g SPI与0.4 g儿茶素粉末溶解在49 mL 10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.0)中,分别用2 mol/L的HCl和NaOH调节溶液pH值至3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5和9.5,室温下磁力搅拌15 min使儿茶素与SPI充分反应,记为pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.5、pH9.5组。将反应样品透析48 h(分子质量截止值：8 000～14 000 kDa),每6 h更换1次水以确保完全透析,使用紫外可见分光光度计记录透析液在280 nm处的吸收峰,直至所有未反应的多酚被完全去除,透析液预先冷冻并真空干燥48 h备用。

1.3.3 儿茶素与SPI结合亲和力测定

参照文献[18]测定儿茶素与SPI结合亲和力,复合物于8 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取沉淀物加入5 mL无水乙醇并置于磁力搅拌器上充分溶解5 min后,于8 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取上清液测定其280 nm处的吸光度,并根据儿茶素标准曲线计算儿茶素质量,儿茶素包埋率和装载质量比计算见式(1)、式(2)。

包埋率

(1)

式(1)中,m1为复合物离心后所得沉淀中儿茶素的质量,mg;m2为添加的儿茶素的总质量,mg。

(2)

式(2)中,w为复合物装载儿茶素的质量比,mg/g;m3为复合物包埋儿茶素的总质量,mg;m4为加入的蛋白质的总质量,g。

1.3.4 复合物热稳定性测定

根据Tang等[19]的方法并适当修改,配置SPI质量分数为10%的儿茶素-SPI复合物溶液,精准称取7 mg的复合物浆液置于具有聚合物涂层的小铝盒内,密封。样品以10 ℃/min的速度从20 ℃升温至200 ℃。结果用Pyris软件分析,记录最大变性温度(Tmax)和热焓变值(ΔH)。

1.3.5 复合物结构测定

用10 mmol/L、pH值 7.0 的磷酸盐缓冲溶液配置不同pH值的儿茶素-SPI复合物溶液,使复合物中蛋白质质量浓度为1 mg/mL,用紫外可见分光光度计扫描儿茶素-SPI复合物样品的紫外吸收光谱,扫描波长为200～400 nm,扫描间隔1 nm,扫描速度100 nm/min。

1.3.6 复合物表面疏水性测定

参照Jiang等[20]的方法,用10 mmol/L、pH值 7.0 的磷酸盐缓冲溶液配置不同pH值的儿茶素-SPI复合物溶液,将样品溶液置于9 705 r/min下离心30 min,取上清液,用磷酸盐缓冲溶液将SPI质量浓度稀释至0.1 mg/mL,取4 mL稀释液加入40 μL浓度为8 mmol/L的8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS),振荡混匀,在激发波长390 nm、发射波长468 nm、狭缝宽度5 nm、扫描速度10 nm/s下记录荧光强度。表面疏水性为荧光强度与蛋白质质量浓度的比值。

1.3.7 复合物二级结构测定

参考由耀辉等[21]的方法,对样品进行圆二色光谱扫描,分析儿茶素-SPI复合物中二级结构的变化。使用10 mmol/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液配置样品溶液,使溶液中SPI质量浓度为0.1 mg/mL,室温条件下设置扫描波长190～260 nm,光径1 mm。结果扣除缓冲溶液对应的圆二色光谱,并通过CDPro软件处理数据。

1.3.8 复合物荧光淬灭类型检测

用10 mmol/L、pH值 7.0的磷酸盐缓冲溶液配置不同pH值的儿茶素-SPI复合物溶液,使复合物中蛋白质质量浓度为0.1 mg/mL。利用荧光光谱仪测定样品的荧光光谱,设置激发波长295 nm,扫描范围为300 ～500 nm,夹缝宽为5 nm,扫描速度为500 nm/min[22],分别在293、310 K的恒温条件下收集荧光光谱信息,分析时需扣除缓冲溶液产生的荧光吸收峰值。

儿茶素对SPI淬灭方式可通过Stern-Volmer方程[23]分析得到,见式(3)。

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q] 。

(3)

式(3)中,F0为不添加儿茶素时SPI的荧光强度;F为添加儿茶素时SPI荧光强度;Kq为分子淬灭常数,L/mol;[Q]为淬灭剂浓度,mol/L;KSV为Stern-Volmer淬灭常数,L/(mol·s);τ0为不添加儿茶素时荧光物质的平均寿命,对于蛋白质等生物大分子,荧光寿命一般为10-8 s[24]。

将Stern-Volmer方程转化为式(4)可进一步分析出儿茶素与SPI相互作用的结合位点数和结合常数[25]。

(4)

式(4)中,Kb为SPI与儿茶素的结合常数,n为二者结合的位点数。

根据热力学参数评估儿茶素与SPI之间的相互作用力,由式(5)～式(7)推算儿茶素与SPI结合的吉布斯自由能(ΔG)、焓变(ΔH)和熵变(ΔS)。ΔH>0,ΔS>0主要表现为疏水相互作用;ΔH<0,ΔS<0主要表现为氢键和范德华力;ΔH<0,ΔS>0主要表现为静电作用力[26]。

ΔG=-RTlnKb ;

(5)

(6)

(7)

式(5)～式(7)中,R为摩尔气体常数,8.314 J/(mol·K);T为实验温度,K;Kb1 为T1 温度下对应的结合常数;Kb2为T2 温度下对应的结合常数;ΔG为吉布斯自由能,kJ/mol;ΔH为焓变,kJ/mol;ΔS为熵变,J/(mol·K)。

1.3.9 复合物分子对接模拟

利用AutoDock Tools 4.2.6软件和Pymol软件研究儿茶素-SPI输送载体机制。SPI的晶体结构取自蛋白质数据库PDB(Protien Date Bank),11S蛋白编码为lOD5、7S蛋白编码为1UIK,参考网址为https：∥www.rcsb.org/pages/search_features。配体儿茶素结构取自PubChem Compound,参考网址为https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound[27]。受体除去多余水分子及金属离子备用。分子对接过程中保持蛋白质分子的刚性结构不变,配体构象发生改变,通过计算配体受体之间的非键相互作用,采用AutoDock Tools 4.2.6软件进行儿茶素与SPI之间的分子对接。在对接过程中仅考虑复合物的10个构象,并分析结合自由能量最低的构象,由Pymol软件平台对结果进行深入分析处理,具体对接方法参照文献[28]。

1.3.10 复合物乳化性的测定

取每组复合物溶液8 mL,向其中加入2 mL大豆色拉油,高速匀浆器10 000 r/min搅打1 min后,立即于容器底部取样50 μL,加入到5 mL质量分数为 0.1%的SDS溶液中,混匀后于500 nm 处测定吸光度,以SDS溶液作为空白对照。将乳化液置于室温下10 min后再次取样测定。乳化活性(EAI)及乳化稳定性(ESI)按式(8)、式(9)计算[29]。

(8)

(9)

式(8)、式(9)中,EAI为单位质量SPI的乳化区域,m2/g;ρ为SPI质量浓度,g/mL;φ为油相体积分数,本实验中油相占1/4,故φ=0.25;dilution为稀释倍数;A0为500 nm处0 min的吸光度;A10为500 nm处10 min的吸光度。

样品乳状液制备完成后,用移液枪吸取20 μL乳液样品,置于干净的载玻片上,盖好载玻片后置于显微镜载物台上,在物镜40×、目镜10×的光学显微镜下进行观察,用手机拍照功能截取图像。

1.4 数据处理

每组实验设置3次重复,结果以平均值±标准偏差表示。数据采用Statistix 8.1分析差异显著性,图片采用Sigmaplot 9.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 pH值对儿茶素-SPI复合物结合情况的影响

儿茶素包埋率和SPI装载儿茶素的质量反映了二者相互作用的结合度,见表1。由表1可知,在酸性条件下,二者结合度随着pH值的增大先升高后下降,在SPI等电点达到最大值。这是由于酸性条件下改变了大豆蛋白的结构,使其聚集沉淀,当达到大豆蛋白等电点时,聚集现象最强,导致大部分多酚随着蛋白质的聚集而被包埋进蛋白质沉淀,使混合体系中游离的多酚含量降低,与大豆蛋白结合的多酚含量增加,从而影响儿茶素的包埋率和SPI装载儿茶素的含量。在碱性环境中,多酚的包埋率和SPI装载儿茶素的质量随着pH值的增加而增加,当pH值达到8.5时,不再有显著变化。这是由于碱性条件下,pH值促使蛋白质结构展开,SPI内的疏水性氨基酸基团暴露,儿茶素与SPI之间的作用力由非共价相互作用转变为共价相互作用,作用力增强,二者相互作用的结合能力也随之加强且包埋率达到100%。

2.2 pH值对儿茶素-SPI复合物热稳定性的影响

蛋白质在商业加工过程易受热变性,蛋白质热稳定性的提高可改善加工过程中的变性情况[30]。表2显示的是pH值对复合物热稳定性的影响。由表2可知,酸性条件下儿茶素-SPI复合物的热稳定性较差。这是由于该条件下儿茶素-SPI复合物溶解性较低,溶液分层后受热易变性,且酸性pH值下,儿茶素与SPI结合度较低,未起到增大儿茶素-SPI复合物热稳定性的作用。中性条件下,儿茶素-SPI复合物的变性温度由69.42 ℃升高至72.34 ℃,说明儿茶素增强了复合物热稳定性。碱性条件下,儿茶素-SPI复合物变性温度显著升高至157.09 ℃,且在pH值8.5、9.5的条件下第一峰值温度提高,第二峰值温度检测不到,表明碱性条件下,儿茶素与SPI交联程度增大,改变了SPI的结构,增大了复合物热稳定性。

2.3 pH值对儿茶素-SPI复合物结构的影响

图1是不同pH值下复合物紫外光谱。由图1可知,酸性环境下儿茶素-SPI复合物的紫外吸收峰值显著低于碱性环境中的,说明pH值影响了儿茶素-SPI复合物的构象。这可能是由于酸性环境使SPI结构发生聚集,使部分芳杂环疏水基团及芳香族氨基酸被包埋,且在SPI等电点附近,SPI沉淀抑制了儿茶素与SPI的相互作用,阻碍了内部发色基团的暴露,导致紫外光谱峰值变小。碱性环境下,SPI结构舒展,包埋在SPI结构内部的发色基团暴露,有利于儿茶素与SPI相互作用,这一结果与包埋率的结果相呼应。

2.4 pH值对儿茶素-SPI复合物表面疏水性的影响

不同pH值对儿茶素-SPI复合物表面疏水性的影响如图2。SPI、儿茶素-SPI复合物表面疏水性均随着pH值的增大呈先下降后上升趋势,且在等电点附近达到最小值。这可能是由于酸性条件不利于SPI溶解,且在等电点附近溶解性最差,SPI分子疏水基团被包埋,导致儿茶素-SPI复合物疏水性较低,阻碍了儿茶素与SPI通过疏水作用结合。当pH值升高至碱性条件时,SPI溶解性增大,且碱性环境下,SPI分子结构展开,有利于大分子的解离,使疏水基团暴露游离在溶液中,增大溶液的表面疏水性。

2.5 pH值对儿茶素-SPI复合物二级结构的影响

圆二色光谱技术可分析儿茶素-SPI复合物的二级结构,不同pH值下复合物各二级结构占比见表3。由二级结构含量变化数据可知,随着pH值的增大,α-螺旋含量呈上升的趋势,β-折叠的含量在中性条件下表现出最高值,β-转角含量无显著变化(P>0.05),无规则卷曲含量呈下降趋势。酸性条件下复合物的疏水性基团被包埋起来,多肽链上羰基与氨基之间氢键作用较弱,α-螺旋结构不稳定,表现为α-螺旋结构含量较少;而在碱性条件下,SPI结构展开,多肽链内部的疏水基团暴露出来,增加SPI与儿茶素相互作用位点与程度,表现为疏水相互作用与氢键作用增强,α-螺旋含量增加。研究结果与王中江等[31]的相似,在中性条件下SPI带负电,降低溶液pH值,环境中的H+与所带的负电荷中和而产生静电作用,影响了氢键的稳定性,在静电相互作用及氢键稳定性改变的共同作用下导致α-螺旋结构的丢失[32],降低酸性条件下复合物的稳定性。碱性条件下,α-螺旋结构比较稳定,这可能是由于碱性条件下,儿茶素与SPI结合得更加紧密,二者相互作用主要为共价结合,复合体系结构稳定,这与碱性条件下荷载率高的结果相互佐证。

2.6 pH值对儿茶素-SPI复合物相互作用的影响

表4是儿茶素-SPI复合物的荧光淬灭常数(Kq)、结合位点数(n)、结合常数(Kb)。已知动力学机制的最大动态淬灭常数为2.0×1010 L/(mol·s),一般认为当荧光淬灭常数远远超过此数值时,二者间的淬灭不是通过碰撞或动态方式发生的,而是在基态下荧光基团和淬灭剂之间的静态机制下发生的[33]。由表4可知,不同pH值下,各处理组的Kq均大于2.0×1010 L/(mol·s),儿茶素引起的SPI淬灭速率常数远大于最大动态淬灭速率常数的极限,因此,儿茶素对SPI的淬灭机制应为静态淬灭,表明儿茶素以静态淬灭方式与SPI结合,结合反应几乎是不可逆的[34]。然而当pH值为3.5、4.5、5.5、6.5时,Ksv随温度的升高而增大,这是动态淬灭的重要标志,与先前认为的该过程为静态淬灭矛盾,该结果与张怀斌等[35]研究核黄素与牛血清蛋白相互作用的结果类似,即改变溶液离子浓度,Kq的数量级不变,淬灭过程仍以静态淬灭为主。因此,推测此时儿茶素-SPI复合物的结合和解离之间存在动态平衡,但此淬灭过程仍以静态淬灭为主。

由表4可知,酸性条件下Kb随着温度的升高而降低,碱性条件下Kb呈现相反趋势,说明在碱性条件下升高温度更有利于儿茶素与SPI的相互作用,且当pH值为8.5、9.5时,儿茶素与SPI相互作用的结合位点接近为1,而在荧光淬灭实验中,当结合位点等于或接近1.0时,表明只有一个多酚分子与一个蛋白质分子结合[34],因此这一结果表明儿茶素与SPI的结合比例接近于1,这也与荷载率的结果相互佐证,即当pH值为8.5、9.5时,二者相互作用的结合能力也随之加强且荷载率达到100%。酸性条件下Kb随着温度升高而降低归因于2点：一是酸性条件下,体系中存在不能溶解的SPI聚集颗粒,升温再次促进了体系的热聚集,从而抑制儿茶素与SPI的相互作用;二是酸性条件下,温度升高使儿茶素与SPI相互作用形成的儿茶素-SPI复合物不稳定,导致结合常数与结合位点数均有所下降,这与热稳定性变化规律相互佐证。

表5是pH值对儿茶素与SPI相互作用热力学参数的影响。由表5可知,在不同pH值下,各处理组的ΔG均为负值,说明儿茶素与SPI的相互作用不受pH值影响,均为自发进行。而在不同pH值下,二者相互作用力有所不同。由表5可知,当pH值为3.5、5.5、6.5时,ΔH<0,ΔS<0,此时儿茶素与SPI的相互作用主要为静电作用力[26];当pH值为4.5时,ΔH<0,ΔS>0,分子间作用力主要为氢键和范德华力;当溶液处于中性或碱性条件时,ΔH>0,ΔS>0,分子间作用力主要为疏水相互作用。结合表面疏水性的结果发现,酸性条件不利于SPI的溶解,且pH值在等电点附近时SPI溶解性最差,SPI分子疏水基团被包埋,导致儿茶素-SPI复合物疏水性较低,阻碍了儿茶素与SPI通过疏水作用相结合,因此表现为酸性条件下儿茶素与SPI依赖于静电作用力结合。当pH值升高至碱性条件,SPI溶解性增大,且碱性环境下,SPI分子结构展开,有利于大分子的解离,使疏水基团暴露游离在溶液中,增大溶液的表面疏水性,并且由于儿茶素具有疏水基团,将可能更有助于与SPI的非极性基团发生疏水相互作用。儿茶素可通过在碱性pH值下形成的酚基或醌,与蛋白质相互作用形成共价键[36],因此表现为当pH值在中性或碱性条件时,儿茶素与SPI以疏水相互作用而结合。

2.7 儿茶素-SPI复合物分子对接分析

根据沉降系数不同,SPI可分为2S、7S、11S和15S蛋白,其中7S和11S蛋白共占SPI的70%左右并严重影响SPI的功能性质,因此将SPI中的7S、11S蛋白分别与儿茶素进行分子对接[37]。图3是7S蛋白、11S蛋白与儿茶素的结构,图4、图5分别是7S蛋白、11S蛋白与儿茶素的对接结果。由图4可知,在7S蛋白中有3个氨基酸残基参与了与儿茶素的对接,其中疏水性残基分别为Ser275、Ala283、Gln158,它们彼此之间存在较强的疏水相互作用。由图5可知,在11S蛋白中有2个氨基酸残基参与了与儿茶素的对接,其中疏水性残基分别为Gly242、Ser248。结果表明：SPI与儿茶素之间形成了7个氢键,由此可以推断在儿茶素与SPI结合过程中,酚羟基与氨基酸残基通过氢键协助了两者之间的键合,这有利于配体小分子在蛋白活性位点上更好地发挥靶向作用,因此在儿茶素与11S蛋白和7S蛋白结合过程中疏水作用力发挥着主要作用,这一结果也与荧光光谱的结果一致,pH值为中性条件下儿茶素与SPI相互作用方式主要为疏水相互作用。

2.8 pH值对儿茶素-SPI复合物乳化性及乳状液的影响

2.8.1 pH值对儿茶素-SPI复合物乳化性的影响表6是pH值对SPI和复合物乳化活性及乳化稳定性的影响。由表6可知,在pH值为3.5、6.5时,儿茶素-SPI复合物与相应pH值条件下SPI乳化活性无显著差异(P>0.05);其余pH值下,儿茶素-SPI复合物乳化活性均显著大于对照组(P<0.05)。随着pH值的增大,儿茶素-SPI复合物乳化活性呈先降低后上升的趋势,在SPI等电点(pH值 4.5)附近达到最小值;当pH值为碱性时,儿茶素-SPI复合物乳化活性升高但无显著差异(P>0.05)。这可能是由于酸性条件下,尤其是SPI等电点附近,SPI及儿茶素-SPI复合物大量聚沉,使溶液中结构致密的大分子颗粒增多,不利于乳液的形成;而碱性条件下,SPI结构溶解性增大,与儿茶素相互作用程度加深,复合体系无不溶性聚集颗粒,有利于复合体系乳化性的增强。当pH值为7.5时,复合物乳化活性和乳化稳定性比同pH值下SPI的分别显著提高7.70%和13.44%(P<0.05)。理论上,pH值逐渐增大,儿茶素-SPI复合物结合度增强,体系乳化活性应随之增大,但由于pH值为碱性环境,SPI与儿茶素之间结合度增大,且存在共价键的相互作用,使溶液中可溶性聚集体的含量增多,抑制儿茶素-SPI复合物乳化活性的持续升高。此外,结合表6的结果可知,儿茶素可提高中性及碱性条件下SPI的乳化稳定性,说明儿茶素会掩盖部分蛋白质的解折叠现象,限制了蛋白质的运动,提高乳液稳定性并延长储藏时间[38]。此外,pH值对儿茶素-SPI复合物乳化性的影响与表面疏水性的变化趋势一致,说明儿茶素-SPI复合物乳化性主要受到溶液表面疏水性大小的影响,pH值的变化使儿茶素-SPI复合物结构发生改变,从而影响复合物功能性质。

2.8.2 pH值对儿茶素-SPI乳化液滴分布的影响

图6是不同pH值对复合体系乳状液的影响。由图6可知,复合体系在酸性环境中乳化液滴大小不一,乳状液均匀度较差;而在中性和碱性条件下,乳化液滴粒径较大,乳状液整体更加均匀。在pH值为4.5时,可清晰看到较大的乳化颗粒,且大小不一,这是因为蛋白质表面电荷接近于0,复合体系的乳化颗粒容易聚集在一起,乳化颗粒的粒径较大。相同pH值下,与SPI组相比,复合体系的乳化颗粒聚集程度更高,乳化颗粒也较大。此结果也与乳化活性和乳化稳定性的结果一致。

3 结 论

本研究分别从儿茶素与SPI结合亲和力、相互作用机制及乳化性方面,研究了不同pH值处理对儿茶素与SPI相互作用的影响。结果发现,儿茶素与SPI在碱性环境中结合亲和力增强,这可能是由于碱性条件下二者相互作用存在共价结合。进一步深入探讨相互作用机制发现,pH值的改变并不影响儿茶素对SPI的淬灭方式,二者之间仍以静态淬灭方式为主,且二者结合位点数均为1左右。当pH值为3.5、5.5、6.5时二者之间的相互作用力主要为静电作用力;当pH值为4.5时,主要为氢键和范德华力,当溶液处于中性或碱性条件时,主要为疏水相互作用。此外,碱性环境中复合体系α-螺旋结构显著增多、表面疏水性增大。pH值可通过影响复合体系的二、三级结构进而改善其功能性质,在碱性条件下儿茶素结构展开,与SPI进行共价结合,进而提高复合体系热稳定性和乳化性。

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Effects of pH on Structure and Emulsibility of Catechin-Soy Protein Isolate Complex

ZHAO Juyang1,YUAN Huiping2,YAO Hengzhe3,CHEN Yiyu4,GAO Shiyong1,*

(1.Postdoctoral Programme of Meteria Medical Institute,Harbin University of Commerce,Harbin 150030,China;2.School of Food Science and Engineering,Zhengzhou University of Science and Technology,Zhengzhou 450064,China;3.Culinary Art Department,Qingdao Vocational and Technical College of Hotel Management,Qingdao 266100,China;4.College of Tourism and Cuisine,Harbin University of Commerce,Harbin 150030,China)

Abstract：Soy protein isolate (SPI) was used as raw material to prepare protein complexes loaded with catechins under different pH conditions.The interaction mechanism was explained by analyzing thermal stability,fluorescence quenching type,binding site number,thermodynamic parameters,and secondary structure content by differential scanning calorimetry,ultraviolet-visible spectroscopy,fluorescence spectroscopy,and circular dichroism spectroscopy.The binding affinity between catechin and SPI,and the emulsibility of the complexes were analyzed.The results showed that fluorescence quenching type of catechin on SPI under different pH was static quenching.Electrostatic interaction was the main force between catechin and SPI when treated under pH 3.5,5.5 and 6.5.Additionally,hydrogen bonds and van der Waals forces were the mainly intermolecular forces for the complex under pH 4.5.Moreover,hydrophobic interactions played major roles in the interaction between catechin and SPI at pH 7.0,7.5,8.5 and 9.5.The thermal stability of the complex gradually increased with the increase of pH value.Furthermore,the SPI denaturation temperature of complex increased to 157.09 ℃ at pH 9.5.The emulsifying activity and emulsion stability of the complex at pH 7.5 were 7.70% and 13.44% which were significantly higher than those of the control group (SPI) under the same pH (P<0.05).The catechin-SPI complex structure could be changed under different pH treatments.Thus,soybean protein food base with good emulsibility could be prepared by regulating the pH value.

Keywords：catechin;soy protein isolate;interaction;pH;emulsibility

中图分类号：TS201.6

文献标志码：A

doi：10.12301/spxb202200988

文章编号：2095-6002(2023)03-0127-12

引用格式：赵钜阳,袁惠萍,姚恒喆,等.pH值对儿茶素-大豆分离蛋白复合物结构与乳化性的影响[J].食品科学技术学报,2023,41(3)：127-138.

ZHAO Juyang,YUAN Huiping,YAO Hengzhe,et al.Effects of pH on structure and emulsibility of catechin-soy protein isolate complex[J].Journal of Food Science and Technology,2023,41(3)：127-138.

收稿日期：2022-10-29

基金项目：黑龙江省自然科学博士后基金面上项目(LBH-Z22204);黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划项目(UNPYSCT-2020213)。

Foundation：Heilongjiang Natural Science Postdoctoral Foundation (LBH-Z22204);University Nursing Program for Young Scholars with Creative Talents in Heilongjiang Province (UNPYSCT-2020213).

第一作者：赵钜阳,女,副教授,博士,主要从事大豆蛋白加工和烹饪科学方面的研究。

*通信作者：高世勇,男,研究员,博士,博士生导师,主要从事功能活性物质的提取和抗肿瘤中药方面的研究。

(责任编辑：张逸群)