乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类可以代谢碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称,是公认的有益安全菌株[1]。乳酸菌具有抑制腐败菌、维持人体肠道菌群平衡、提高免疫力、抗衰老等作用,被广泛应用于食品工业中[2]。乳酸菌生物膜(lactic acid bacteria biofilm,LAB-BF)是乳酸菌为了应对各种不良环境而被自身分泌的胞外多聚物包裹形成的一种菌落聚集体,其主要成分是胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)、蛋白质和胞外DNA[3]。LAB-BF具有抗逆性,能够有效抵抗外界不利环境(金属毒性、干燥、酸、高渗透压等),保证菌体正常的生长与代谢[4]。LAB-BF中的主要成分EPS具有良好的黏性,被广泛应用于改善酸奶和面团质地及其组织状态[5-6];此外,乳酸菌EPS还可以通过阻碍致病菌的群体感应系统(quorum sensing system,QS),降低毒力因子和生物膜的产生,从而达到抑菌效果[7-10]。因此,乳酸菌EPS被广泛应用于乳制品[11-12]和肉制品[13]的生物保鲜中。LAB-BF具有较好的抗逆性、黏附性和抑菌活性等多种物理特性和生理功能,是一种天然、绿色的增稠剂和生物保鲜剂,将在无添加健康食品、生物保鲜食品的开发应用中发挥更大的作用。

近年来,随着合成生物学的快速发展,通过微生物合成活性功能因子,如生物膜、胞外多糖、共轭亚油酸、细菌素和苯乳酸,将是食品功能因子微生物制造的主流发展方向[14]。QS是细菌依赖群体密度,通过信号分子的产生、释放、积累和感应进行种间或种内的信息交流,最终表现出多个细菌合作完成特定生理功能的种群密度依赖的基因表达调控系统,是细菌合成功能因子的重要调控系统[14]。细菌QS的研究已成为微生物学领域的研究热点。信号分子AI-2(autoinducer-2)介导的LuxS/AI-2型QS系统因广泛存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中而受到越来越多的关注[15]。目前对于LuxS/AI-2型QS系统的研究主要集中在致病菌的生物膜、毒力因子等的形成方面,而对于乳酸菌LuxS/AI-2型QS系统的研究相对较晚。虽然前人已经做出了大量卓有成效的工作,但LuxS/AI-2型QS系统调控LAB-BF形成的机制仍不完善[15],特别是LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的信号分子AI-2及其受体蛋白、关键下游调控蛋白和基因,以及代谢路径有待进一步研究[16]。因此,归纳梳理乳酸菌的LuxS/AI-2型QS及其调控LAB-BF形成的机制,寻找人为调控乳酸菌QS的靶点,将为定向调控LAB-BF形成及促进新型、高效、稳定的益生菌产品的开发提供理论指导。

1 LAB-BF形成过程

LAB-BF的形成是一个动态发展过程,需经历附着、形成、成熟、老化脱落和再重新附着5个阶段[16-17],如图1。第一阶段:游离态乳酸菌的黏附。在此阶段,乳酸菌通过范德华力和静电力黏附在载体表面。此外,载体表面的疏水效应通过减少乳酸菌与载体表面的斥力,从而加强乳酸菌的吸附能力[18]。第二阶段:生物膜的发展。乳酸菌在载体表面附着稳定之后,就会大量繁殖,形成微型菌落。第三和第四阶段:生物膜的成熟。在此阶段,乳酸菌达到一定的数量,开始分泌自诱导信号分子,实现乳酸菌之间的信息交流,靶向调控下游基因和蛋白的表达,促进EPS、蛋白质、DNA等大分子物质形成,生成致密的生物膜结构。第五阶段:乳酸菌的脱落与再定植。此阶段乳酸菌继续繁殖,调控转运相关的蛋白表达,使乳酸菌具有趋化运动的能力并引发生物膜的脱落,与此同时继续黏附定植到新的位置,再一次形成生物膜[19]。在LAB-BF形成的第三阶段中,乳酸菌通过分泌自诱导信号分子调控生物膜形成的过程即为群体感应调控过程。

2 QS调控LAB-BF形成的机制

乳酸菌通过自身特定的基因,产生并向胞外分泌自诱导信号分子(autoinducer,AI)开展细胞间的交流。有些乳酸菌自身并不能合成信号分子AI,但它们可以通过感知周围环境中的信号分子AI从而实现细胞间的交流。只有当信号分子AI的浓度达到一定的阈值时,信号分子AI才能被受体蛋白感应或内化进入胞内,激活一系列下游靶基因和蛋白的表达,从而调控乳酸菌生物膜的生成[20]。AIP型[21]和LuxS/AI-2型[22]QS具有调控LAB-BF生成的功能。

2.1 AIP型QS调控LAB-BF的形成

AIP型QS是指乳酸菌通过分泌自身诱导信号肽(autoinducing signalling peptides,AIP)这种信号分子实现乳酸菌间的信息交流,综合前人的研究进展,总结了乳酸菌AIP型QS的调控机制[21],如图2。由图2可见,乳酸菌自身分泌或感知信号分子AIP,当其浓度达到一定的阈值时,信号分子AIP就能被受体蛋白组氨酸激酶蛋白HKP识别并发生自磷酸化,形成调节蛋白和启动子结合体,结合体激活下游的调控生物膜形成的靶基因和蛋白的表达,最终促进LAB-BF的形成。

2.2 LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF的形成

AI-2信号分子介导的LuxS/AI-2型QS系统是乳酸菌中主要的QS系统,对调控LAB-BF的形成起着重要作用。早在20世纪90年代,科学家就发现了信号分子AI-2调控哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)发光的现象,这也是人类首次发现信号分子AI-2[23]。后期研究逐渐发现信号分子AI-2介导的LuxS/AI-2型QS广泛存在于细菌中,承载着多种行为的信号传递与交流任务[22,24]。LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的机理如图3[24]。由图3可见,首先乳酸菌具备产生信号分子AI-2的关键基因luxS,luxS基因编码LuxS蛋白的表达,LuxS蛋白调控信号分子AI-2前体物4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)的形成,紧接着转化为信号分子AI-2。AI-2被分泌到胞外,乳酸菌自身或周围的乳酸菌可以感知释放的胞外信号分子的浓度,从而感知乳酸菌的群体密度并释放更多的信号分子。当胞外的信号分子积累到一定的浓度时,信号分子通过细胞膜上的受体蛋白结合进入到细胞内形成复合体1,复合体1与传感器激酶LuxQ结合形成复合体2,调控下游靶向基因和蛋白的表达,最终调控生物膜的形成。目前的研究还未能完全阐明LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的具体路径,特别是下游的关键调控基因和蛋白、代谢通路,以及信号分子AI-2的受体蛋白尚不明确,应借助分子生物学手段和多组学技术进一步开展相关研究。

2.2.1 关键调控基因

研究表明,luxS基因是LuxS/AI-2型QS中调控LAB-BF形成的关键上游调控基因[25-26]。植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、乳明串球菌(Leuconostoc lactis)、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)等均通过LuxS/AI-2型QS调控生物被膜的形成。植物乳杆菌YM-4-3的群体感应luxS基因在合成信号分子AI-2中起着决定性作用[27]。同源过表达植物乳杆菌的luxS基因,菌株的生物被膜和AI-2形成量均显著增多[28]。此外,研究表明,植物乳杆菌L-ZS9中的luxS基因过表达,不仅提升了菌株产信号分子AI-2的能力,同时提升了该菌株的耐热、耐胆盐和生物膜形成能力[29]。Zhang等[30]通过λRed重组技术构建了luxS基因缺失的发酵乳杆菌,该基因的缺失降低了发酵乳杆菌的生物膜形成能力及其对酸、胆盐、高温和高渗环境的抗性。luxS基因是构成完整的LuxS/AI-2型QS必不可少的元件,乳酸菌只有具备了上游的调控基因luxS,才能合成信号分子AI-2,进而调控下游基因、下游蛋白的表达,最终调控生物膜的形成。

目前对LuxS/AI-2型QS中的上游调控luxS基因研究较为成熟,而对下游调控生物膜形成的基因尚不明确。刘蕾[31]通过基因组学、转录组学和蛋白组学研究了信号分子AI-2调控类植物乳杆菌L-ZS9被膜形成的分子机制;通过外源添加AI-2进行qRT-PCR反向验证和基因同源过表达,并对重组菌株的生物被膜形成能力进行检测,发现基因tuf、fba、gap、pgm、nfo、rpoN和rib受AI-2的调控,且与LuxS/AI-2型QS抑制剂D-核糖的调节作用相反,这说明LuxS/AI-2系统能通过调控tuf、fba、gap、pgm、nfo、rpoN和rib基因的表达从而影响菌株生物被膜的形成。Gu等[32]发现,外源添加AI-2可促进植物乳杆菌(L. plantarum)的lamC和ftsH基因表达,同时促进生物膜和EPS的形成,最终提高菌株的环境耐受力,说明lamC和ftsH基因是调控生物膜形成的关键基因。Zhang等[30]的研究表明,luxS基因缺失导致发酵乳杆菌的生物膜以及生物膜中脂肪酸、胞外多糖、蛋白质和eDNA的形成降低,同时下调了fabI、cysE、argR和purD基因的表达水平。赵佳伟[33]发现与浮游态的植物乳杆菌RS66CD相比,形成生物膜状态的植物乳杆菌RS66CD中的groEL、ftsH、gyrB、alr、LlfabZ1和LlfabZ2基因的表达量显著提高,说明这些基因可能和生物膜的形成正相关。在这些基因中,fba基因被鉴定为调控植物乳杆菌和发酵乳杆菌生物膜形成的关键调控基因。fba家族基因主要参与脂肪酸的合成,脂肪酸是细胞膜的主要成分,并参与细菌的各种生理代谢活动[34]。因此,fba家族基因可能是通过调节脂肪酸的类型和组成,从而调节细胞膜的流动性,影响细菌的信号传递,最终调控生物膜的形成。argR基因被证明参与副溶血性弧菌生物膜的形成[35];rpoN基因能编码Sigma54因子的合成,而Sigma54因子被证明与哈维氏弧菌生物膜合成有关。argR和rpoN基因在乳酸菌中的功能尚不明确,有待进一步研究[36]。不同种属的乳酸菌LuxS/AI-2型QS调控生物膜形成的关键下游调控基因并不是一致的,有待进一步研究最终确定共有的关键调控基因。

2.2.2 关键调控蛋白

关于LuxS/AI-2型QS调控乳酸菌生物膜形成的关键下游调控蛋白研究较少,目前还处于起始阶段。刘蕾等[29,31]通过iTRAQ定量蛋白质组学技术探究了LuxS/AI-2型QS调控植物乳杆菌L-ZS9生物膜形成的关键下游调控蛋白。发现luxS基因过表达可以上调菌株中LacI、AraC以及PadR家族转录调节子的表达,这些转录调节子主要参与物质运输及维持细胞稳态,这说明LuxS/AI-2型QS可能是通过调节细胞膜蛋白及膜上转运蛋白的表达,进而调控菌体对胞外环境的应答,从而影响生物被膜的形成。LacI家族的转录调节蛋白可能通过激活其他调节子和细胞膜转运蛋白的功能来发挥生理作用,其在乳酸菌中的作用机制尚不清楚,有待进一步研究。研究表明:双歧杆菌属(Bifidobacterium)生物膜形成过程中可调控胞外多糖合成相关酶β(葡萄糖-6-磷酸异构酶Gpi、糖基转移酶Glf、6-磷酸脱氢酶Zwf)的表达量显著提高;与此同时,跨膜转运蛋白RbsA、RbsB、RbsC的表达量也显著提升[37]。这些调控酶和蛋白与生物膜的形成息息相关,但目前的研究并未建立信号分子AI-2与这些蛋白的调控机制。

2.2.3 关键代谢通路

LuxS/AI-2型QS通过调控下游基因和蛋白的表达,从而影响胞内的代谢水平,最终促进生物膜的形成。刘蕾[31]的研究发现,信号分子AI-2通过调控糖酵解、糖代谢相关基因的表达,从而促进类植物乳杆菌L-ZS9生物被膜的形成。Wang等[38]通过代谢组学方法对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)生物膜的形成过程进行胞内代谢物水平的动态测定,发现精氨酸生物合成通路在地衣芽孢杆菌生物膜形成的早期发挥了重要作用,原因是精氨酸为碱性氨基酸,可以缓和pH值的下降,维持生物膜形成的稳定pH值环境;半乳糖代谢和鞘脂代谢促进地衣芽孢杆菌生物膜的成熟,其中半乳糖代谢与胞外多糖的合成息息相关,而鞘脂代谢与脂质筏积累和膜完整性相关;糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢共同参与地衣芽孢杆菌生物膜的形成过程,且相互协同、相互影响。Guo等[39]基于靶向代谢组学精确地揭示了大肠杆菌生物膜形成过程中的主要代谢途径,发现Fe2+可以调节生物膜的形成,Fe2+主要通过调控5种直接调节生物膜形成的功能性代谢物(L-色氨酸、50-MTA、亚精胺、CMP和L-亮氨酸)的代谢水平有效调节生物膜的形成。与浮游菌株相比,形成生物膜的植物乳杆菌RS66CD的D-丙氨酸和脂肪酸代谢、赖氨酸和肽聚糖生物合成途径显著提高[33]。刘宗敏[37]发现,两歧双歧杆菌、假小链双歧杆菌和长双歧杆菌生物膜的形成与酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的合成,以及半乳糖的代谢密切相关。因此,下游的调控基因和蛋白通过影响氨基酸的代谢(色氨酸、亮氨酸、丙氨酸)和生物合成(精氨酸、赖氨酸)、半乳糖代谢以及鞘脂代谢,增强细胞壁的合成,调节蛋白质和胞外多糖的分泌,还通过脂肪酸的合成调节细胞膜的流动性,促进生物膜的形成来抵抗外界不良条件。总的来说,目前的研究已经逐步解析了LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的信号分子、调控基因、调控蛋白、受体蛋白以及代谢路途,但5个调控元件之间的关系尚未明确,未来的研究应该通过基因编辑技术和多组学技术探明五者之间的调控关系。综合前人的研究进展,本文探讨了LuxS/AI-2型QS调控乳酸菌生物膜形成的可能机制[29-33,37-39],如图4。

3 信号分子AI-2及其受体蛋白

信号分子AI-2被称为“细菌的世界语”,是介导LuxS/AI-2型QS的关键元件。信号分子AI-2受体蛋白是识别AI-2的靶蛋白,在LuxS/AI-2型QS中起着承上启下的作用。因此,阐明信号分子AI-2的结构及其受体蛋白,对深入理解LuxS/AI-2型QS调控乳酸菌生物膜的形成具有重要意义。

3.1 信号分子AI-2的合成及结构

信号分子AI-2生成代谢通路见图5[40-41]。由图5(a)可知,AI-2不是一个单一的信号分子,而是由DPD快速转化而来的衍生物。DPD是S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAM)代谢的副产物。SAM广泛存在于各种细菌、真菌及多细胞生物中,是主要的细胞甲基化供体,不同物种具有不同的SAM代谢途径。SAM可将甲基基团转移给多种不同的底物,生成具有毒性的产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH),然后通过甲硫腺苷核苷酶(5’-methylthioadenosine nucleosidase,MTAN,pfs基因调控表达)和LuxS蛋白(luxS基因调控表达)将其转化为S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH)和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy),同时产生AI-2的前体物质DPD。DPD是一种高活性分子,通过重排及一系列的附加反应生成AI-2[图5(b)]。因此,信号分子AI-2的生成要求细菌自身必须具备关键基因luxS和pfs,以及其他基因MT、MetK。迄今为止,已鉴定出由相应细菌受体参与的2种AI-2形式,包括由LuxP蛋白识别,仅存在于哈维氏弧菌中的含硼DPD衍生物S-2-甲基-2,3,3,4-四羟基四氢呋喃硼酸盐,以及在沙门氏菌(Salmonella)中被LsrB蛋白识别非硼酸化的R-2-甲基-2,3,3,4-四羟基四氢呋喃。然而,由于2种活性AI-2形式之间的快速相互转换,拥有这2种不同类型受体的细菌物种可以通过信号分子AI-2相互通信。

3.2 信号分子AI-2受体蛋白类型与挖掘

AI-2信号分子随着乳酸菌密度的增加而增加,但当其浓度达到一定阈值时,AI-2会与细胞上的受体膜蛋白或周质蛋白结合并通过相应的转运系统进入细胞内。目前,哈维氏弧菌、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等致病菌的受体蛋白及其对AI-2信号分子的感应及内化途径研究比较清楚,而乳酸菌中信号分子AI-2的受体尚不明确,这严重阻碍了我们对信号分子AI-2介导的乳酸菌生理行为及其调控机制的了解。迄今为止,研究者已从遗传学、生物信息学和生物化学3个层面鉴定出了4种类型的AI-2受体蛋白:1)仅存在于弧菌属中的LuxP蛋白;2)沙门氏菌和芽孢杆菌中的LsrB蛋白;3)嗜血杆菌属中的新型AI-2信号分子受体RbsB蛋白;4)最新鉴定的广泛存在于大量的细菌和古细菌中,包含dCACHE结构域的AI-2受体蛋白[42]。

3.2.1 LuxP和LsrB受体蛋白

目前已发现的信号分子AI-2受体蛋白LuxP和LsrB都是处于周质空间中的周质结合蛋白,它们的一级序列具有一定的相似性(约11%的同一性)[43-44]。LuxP蛋白为哈维氏弧菌和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)特有的信号分子AI-2受体蛋白,该受体蛋白与膜内LuxQ激酶形成一个混合的双组分感应激酶系统,从而感知胞外的信号分子AI-2。当胞外的信号分子AI-2达到一定的浓度阈值时,AI-2被LuxP-LuxQ蛋白复合体识别,并将磷酸化基团转移至下游的LuxU和LuxO蛋白上,最终导致LuxO形成磷酸化LuxO-Pi,磷酸化的LuxO-Pi调节小RNA的表达,小RNA再与转录调节器LuxR结合,诱导荧光素酶Lux操纵子的转录,最终引起发光现象[45-47]。LsrB蛋白为大肠杆菌和沙门氏菌特有的信号分子AI-2受体蛋白。胞外的信号分子AI-2被受体蛋白LsrB感知形成LsrB-AI-2复合体,该复合体通过膜通道蛋白LsrCD内化至胞内[44, 48],进入胞内的AI-2被LsrK磷酸化形成AI-2-Pi,AI-2-Pi再与LsrR相互作用调控下游基因的表达,从而调控生物膜的形成和趋化反应[49-50]。信号分子AI-2受体蛋白在整个群体感应系统中起着承上启下的作用,是关键桥梁,只有明确受体蛋白才能进一步解析下游的联级调控机制。目前乳酸菌中的信号分子AI-2受体蛋白尚不明确,这极大地阻碍了学者对乳酸菌信号分子AI-2介导的乳酸菌益生特性及其调控机制的了解。

3.2.2 RbsB受体蛋白

研究发现,并非所有细菌都具有LuxP和LsrB两种受体蛋白,那么,在其他种类的细菌中信号分子AI-2的受体蛋白是什么呢[51]?近年来,Armbruster等[52]在流感嗜血杆菌(H. influenzae)中发现了一种名为核糖结合蛋白B(Ribose binding protein B, RbsB)的可溶性细胞周质蛋白家族成员。该家族蛋白与大肠杆菌中的信号分子AI-2受体蛋白LsrB的核酸和氨基酸序列同源性分别高达86%和76%,且都具有由L-S-G-G-Q氨基酸残基组成的高亲和力蛋白特征性膜Walker C。Armbruster等[53]通过基因编辑技术构建了rbsB基因缺失菌株,发现rbsB基因缺失菌株的信号分子AI-2产量和生物膜生成量大大降低,推测RbsB蛋白可能是一种新型的细菌AI-2信号分子受体。樊博琳等[54]则对RbsB蛋白的结构进行了研究,根据已知的RbsB基因序列,通过蛋白异源表达[大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞]获得RbsB蛋白,进一步分离获得RbsB蛋白,二级结构预测表明,RbsB蛋白的二级结构以α-螺旋为主。在另外一项研究中,张丙周[55]构建了副猪嗜血杆菌RbsB基因缺失株,发现RbsB基因缺失菌株的信号分子AI-2生成量明显低于正常菌株。此外,通过异源体外表达并纯化原核蛋白RbsB,探究了信号分子AI-2与原核蛋白RbsB之间的结合情况,证明了RbsB蛋白为副猪嗜血杆菌QS中信号分子AI-2的受体蛋白。最近研究发现,双歧杆菌属(Bifidobacterium)中也存在调控RbsB蛋白表达的rbs A、rbs B和rbs C基因,推测乳酸菌中可能存在信号分子AI-2的受体蛋白RbsB,有待进一步通过基因编辑技术进行验证[37]。

3.2.3 含有dCACHE结构域的受体蛋白

化学感应通路是细菌中一种重要的信号传导系统,该感应通路可通过调控胞内环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)合成酶和磷酸二酯酶的水平进而调控细菌生物膜的形成[56]。化学感应通路的核心元件——化学感受器是接收和识别信号分子,实现信号传递的关键组件,由甲基化趋化受体蛋白、组氨酸激酶CheA和偶联蛋白CheW组成[57]。最新研究表明,含dCACHE结构域的蛋白能与AI-2受体结合,是第四类AI-2受体。含有dCACHE结构域的蛋白广泛存在于细菌中,并存在于少量古菌中[58-61]。Zhang等[62]通过生物信息学分析筛选了26种可能的信号分子AI-2受体蛋白,通过等温滴定量热法(ITC)结合分子模拟对接分析受体蛋白与AI-2之间的结合力和结合方式,发现具有结构域dCACHE的蛋白PctA和TlpQ能通过氢键作用力和高亲和力相互作用与AI-2结合并调控细菌生物膜的形成和胞内c-di-GMP含量。PctA和TlpQ蛋白在铜绿假单胞杆菌(Pseudomona aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等众多的原核生物中被发现,这一发现解释了某些细菌不能编码LuxP、LsrB或者是RbsB样的AI-2受体,但能发生AI-2诱导的群体感应的原因。

3.2.4 其他受体蛋白

谢来工等[63]通过同源性分析筛选已知的AI-2受体蛋白,异源表达获取受体蛋白,通过等温滴定量热法测定受体蛋白与信号分子AI-2的结合能,挖掘到恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida,KT2440)信号分子AI-2的甲基化趋化受体McpU,发现AI-2通过作用于该受体McpU调控P. putidaKT2440生物膜的形成。此外,谢晓荣等[64]发现,类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)分泌的信号分子AI-2能与受体蛋白DosC结合,增强自身磷酸二酯酶活性,促进胞内c-di-GMP的降解,影响胞内c-di-GMP的含量,进而调控细菌的生物膜形成和泳动能力等表型。Claudia等[65]发现了人类肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的QS中信号分子AI-2的受体蛋白为黏细菌发育特异性转录因子FruA,这是一个果糖特异性的磷酸烯醇丙酮酸磷转移酶系统,在革兰氏阳性病原体中是高度保守的。

3.2.5 乳酸菌信号分子AI-2受体蛋白挖掘

LuxS/AI-2型QS是LAB中的主要QS,但目前乳酸菌LuxS/AI-2型QS中信号分子AI-2的受体蛋白尚不明确,采用生物信息学方法和化学探针来识别潜在AI-2受体的尝试尚未成功,这表明需要新的策略来寻找潜在的受体蛋白,但也不排除乳酸菌可能具有类似于哈维氏弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌等菌种的信号分子AI-2受体蛋白。目前已知的信号分子AI-2受体蛋白如表1。因信号分子AI-2的受体蛋白主要是周质蛋白和膜蛋白,所以信号分子AI-2与受体蛋白结合的方式主要是感应和内化两种方式[42]。目前已发现的信号分子AI-2受体蛋白主要是周质空间中的周质蛋白(LuxP、LsrB、RbsB、McpU、DosC、PctA和TlpQ),虽然乳酸菌的周质空间较小,但也具有一定数量的周质蛋白,后续探索乳酸菌信号分子AI-2受体蛋白时,应重点关注周质蛋白。综合前人筛选信号分子AI-2受体蛋白的方法,本文整理出了一套筛选信号分子AI-2受体蛋白的参考思路[62,66-67],如图6,即通过“基于膜蛋白组学、免疫磁珠沉淀和数据库的受体蛋白初筛→分子模拟对接筛选受体蛋白→AI-2与受体蛋白的互作机制→基因编辑验证受体蛋白”四步走策略筛选信号分子AI-2的潜在受体蛋白。首先可以通过蛋白组学筛选差异表达蛋白(对照组为信号分子AI-2抑制剂处理组),或者是通过免疫磁珠沉淀法筛选能和信号分子AI-2特异性结合的膜蛋白,然后通过CELLOV 2.5在线软件(http:∥cello.life.nctu.edu.tw/)筛选相关膜蛋白或周质空间蛋白,再根据已知受体蛋白的氨基酸序列进行同源性比较,快速筛选匹配度高的受体蛋白;第二步通过同源性建模获得受体蛋白的三维晶体结构,进行分子模拟对接,进一步筛选可能的受体蛋白;第三步通过蛋白的异源表达合成目标蛋白,通过等温滴定量热仪(ITC)、表面等离子共振仪(SPR)等先进的仪器,测定信号分子AI-2与受体蛋白的体外结合能,确定受体蛋白;最后通过λRed重组技术和CRISPR-Cas9等基因编辑技术敲除调控受体蛋白表达的基因,从而验证受体蛋白[62,66]。

4 总结与展望

微生物间并不是独立的、互不相干的,细菌间的交流(细菌- 细菌、细菌- 真菌、真菌- 真菌)是一种非常普遍的现象,细菌通过QS进行种间及种内的交流,不同细菌的群体感应类型及其调控的生理功能不同,可应用于不同的工业领域[68-69]。乳酸菌的QS能调控生物膜、胞外多糖、共轭亚油酸以及抗菌素和苯乳酸等有益代谢物质的产生,能提供益生菌的抗逆性、黏附性和抗菌特性[5-6],通过QS定向调控乳酸菌产这些功能因子,可实现益生菌产品的个性化定制,促进益生菌产品的开发。虽然目前的研究已经逐步解析了LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的信号分子、调控基因、调控蛋白、受体蛋白以及代谢路途,但5个调控元件之间的关系尚未明确。未来仍需要通过λRed重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术寻找人为调控乳酸菌QS的靶点,以及结合多组学技术探明5个调控元件之间的调控关系,深入解析LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成的分子机制。由此可见,未来LuxS/AI-2型QS在调控益生菌生理功能的研究既充满机遇,又极具挑战。为了更好地适应这种发展,今后对于乳酸菌群体感应领域的研究应主要集中在以下方面。

1)鉴于目前LuxS/AI-2型QS调控益生菌生物膜形成机制研究的不完整性,应借助分子生物学手段和蛋白质组学技术进一步完善相关研究,特别是乳酸菌AI-2受体的挖掘;

2)鉴于目前LuxS/AI-2型QS调控LAB-BF形成过程中的下游基因、下游蛋白以及主要代谢途径尚不明确,应该联合多组学技术从基因水平、蛋白质水平、蛋白质修饰水平、代谢物水平的互作关系,系统阐明LuxS/AI-2型QS调控益生菌生物膜形成的分子机制;

3)鉴于QS在调控乳酸菌益生功能特性方面的广阔前景,除了明悉乳酸菌群体感应中的关键元件信号分子、受体蛋白和下游调控基因和蛋白外,应重点研究和发掘多元的群体感应调控组件,实现定向调控乳酸菌产功能因子,促进新型、高效、稳定的益生菌产品的开发。

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Research Progress of Formation Mechanism of Quorum Sensing Signal Molecule AI-2 Regulated Lactic Acid Bacteria Biofilm

WEI Guangqiang, WANG Teng, ZHAO Bo, TAO Jifang, WANG Daodian, HUANG Aixiang*

(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Abstract: Lactic acid bacteria biofilm has various physical properties and physiological functions such as adhesion, resistance and antibacterial activity. It is widely used in improving the texture of food and in the biological preservation of food. The formation of lactic acid bacteria biofilm needs five stages as attachment, formation, maturation, aging off and reattachment, and is regulated by the quorum sensing system. Quorum sensing system (QS) is a widespread gene expression regulatory system in bacteria, which regulates the physiological functions of bacteria by targeting the expression of related genes through signaling molecules. The LuxS/AI-2 type QS is the main QS for regulating the probiotic properties of lactic acid bacteria. Understanding the LuxS/AI-2 type QS of lactic acid bacteria and its mechanism of regulating biofilm formation is crucial for further applications of lactic acid bacteria in the food industry. The recent research progress on the formation processes of lactic acid bacteria biofilms, and the five regulatory elements of LuxS/AI-2 type QS regulating lactic acid bacteria biofilm formation, including the signaling molecule AI-2 (autoinducer-2), key regulatory genes (luxS, tuf, fba, gap), key regulatory proteins (LuxS, LacI, AraC, PadR, and Rbs family proteins), the possible receptor proteins of signaling molecule AI-2 (LuxP, LsrB, RbsB and the dCACHE domains receptor proteins) and key metabolic pathways was highlighted. Furthermore, the possible molecular mechanisms of signal molecule AI-2 regulating biofilm formation of lactic acid bacteria, as well as the screening strategy of signal molecule AI-2 receptor protein were summarized. The aim of study was to provide a theoretical guide to gain insight into the LuxS/AI-2 type QS that regulates the biofilm formation of lactic acid bacteria.

Keywords: lactic acid bacteria; biofilm; quorum sensing signal molecule autoinducer-2; receptor proteins; molecular regulatory mechanism

中图分类号: TS201.3

文献标志码: A

doi:10.12301/spxb202200930

文章编号:2095-6002(2023)02-0141-13

引用格式:魏光强, 王藤, 赵波, 等. 群体感应信号分子AI-2调控乳酸菌生物膜形成机制的研究进展[J]. 食品科学技术学报,2023,41(2):141-153.

WEI Guangqiang, WANG Teng, ZHAO Bo, et al. Research progress of formation mechanism of quorum sensing signal moleculeAI-2 regulated lactic acid bacteria biofilm[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(2):141-153.

收稿日期: 2022-09-30

基金项目: 云南省教育厅项目(2022Y258);国家自然科学基金资助项目(32260578);云岭产业技术领军人才项目[云发改人事(2014)1782号]。

Foundation: Project of Yunnan Provincial Department of Education (2022Y258);National Natural Science Foundation of China(32260578);Yunling IndustrialTechnology Leading Talent Project[Yunnan Development and Reform &Human Affairs(2014)No.1782].

第一作者: 魏光强,男,博士研究生,研究方向为乳酸菌资源开发利用。

*通信作者: 黄艾祥,男,教授,博士,主要从事食物资源开发与乳品科学方面的研究。

(责任编辑:叶红波)