显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)是被子植物门(Angiospermae)双子叶植物纲(Dicotyledoneae)原始花被亚纲(Archichlamydeae)鼠李目(Rhamnales)葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄属(Ampelopsis)木质藤本植物,产于我国江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、贵州、云南等省,多生于沟谷林或山坡灌丛中[1]。2013年12月国家卫生计生委批准显齿蛇葡萄叶作为新食品原料使用。以显齿蛇葡萄叶制成的藤茶富含以二氢杨梅素、蛇葡萄素为主的黄酮、多糖等化学成分[2],具有抗菌抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、调节免疫功能[2]等活性,在中国南方民间被广泛用作解暑祛湿、治疗感冒发热的中草药和保健茶。

目前,关于显齿蛇葡萄叶研究主要集中于二氢杨梅素的功能活性和应用上,而其中的多酚类物质尚未引起研究人员的重视,对显齿蛇葡萄叶中的多酚类物质的研究和应用还很少。研究表明,显齿蛇葡萄叶还富含多酚类物质,同样具有很多功能活性。张友胜等[6]从显齿蛇葡萄叶中鉴定出了没食子酸及没食子酸酯类化合物,多酚含量高达18.5%。肖浩等[7]和Cui等[8]研究发现,显齿蛇葡萄叶具有较强的体外抗氧化活性,在相同质量浓度下显齿蛇葡萄叶的黄酮和多酚对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除和抑制能力均强于维生素C。因此,显齿蛇葡萄叶中的多酚类物质具有很好的开发前景。

尽管显齿蛇葡萄叶富含黄酮、多酚等成分,具有多种功能活性,但是因显齿蛇葡萄叶的资源有限,制约了其活性成分的开发利用。显齿蛇葡萄生长周期长,受自然环境和病虫害的影响比较大,且会因为品种和成熟度等影响导致活性成分含量变化较大,同时叶片等植物原料成分复杂,活性成分提取和纯化的难度较大[9],这些因素都会影响植物活性成分的应用。

植物细胞和组织培养技术由于其生产周期短、可控性强和受自然环境影响小等优势[10],被认为是一种潜力巨大的、提供可代替自然生长植物原料来生产次生代谢产物的生物技术[11]。王晓惠等[12]通过诱导和筛选醉金香葡萄愈伤组织细胞,悬浮培养制备白藜芦醇,进一步优化培养条件,使白藜芦醇的含量达到了(3 026.64±56.00)μg/g。Liu等[13]建立了管花肉苁蓉的愈伤组织和细胞悬液,在1 g/L的酪氨酸诱导下,松果菊苷和毛蕊花糖苷的质量分数分别提高到18.83%和2.92%;在200 μmol/L的茉莉酸甲酯的诱导下,其含量分别比野生植物提高了近2倍。这些研究结果表明:植物细胞和组织培养技术可以有效辅助植物细胞产生和调控多酚类物质,提高其功能活性。

目前,显齿蛇葡萄叶当中的黄酮类物质已多有报道,植物细胞和组织培养技术已经应用于多种药用植物活性成分的研究和生产,但关于显齿蛇葡萄叶中的多酚类物质的功能和生物合成调控途径研究还很少,细胞悬浮培养及其多酚类物质生产方面的研究更是鲜有报道。本研究以显齿蛇葡萄嫩叶为外植物体,诱导和筛选优良的愈伤组织,建立较为系统的显齿蛇葡萄组织培养体系,采用UPLC- Q- TOF MS/MS和HLPC技术鉴定和检测其中的主要多酚类物质,并评价其抗氧化活性。希望本研究可为显齿蛇葡萄细胞培养及其多酚类次生代谢产物的合成调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

显齿蛇葡萄叶:江西峡江野生品种,经植物学教授鉴定为显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata);MS(Murashige and Skoog)培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司;二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D),合肥巴斯夫生物科技有限公司;激动素(kinetin,KT),阿拉丁试剂(上海)有限公司;α-萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid,NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)、甲酸,国药集团化学试剂上海有限公司;甲醇、乙腈,美国Tieda试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHWY- 3222型高精度恒温振荡摇床,美国惠普公司;SW- CJ- ICU型洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;SY- 360型超声波提取仪,上海宁商超声仪器有限公司;1260型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪,美国 Agilent科技有限公司;TripleTOF 5600+型质谱仪,美国ABSCIEX公司;DZF- 6090Z型真空干燥箱,上海跃进医疗器械有限公司;TGL- 16B型高速离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 显齿蛇葡萄叶愈伤组织的诱导和筛选

根据赵文佳[14]的方法,选取显齿蛇葡萄植株中黄绿色幼叶及其茎段,流动水冲洗30 min后擦干表面水分,在超净工作台上,采用φ=75%的酒精消毒25 s后用无菌水冲洗3～4次,再用质量分数为0.1%的氯化汞水溶液灭菌6 min,用无菌水冲洗5～6次,去除叶片边缘,将叶片剪成约5 mm×5 mm的片段,茎段剪成1 cm,备用。将其滤干水分后接种在含2 mg/L 2,4-D和30 g/L蔗糖的MS培养基中。培养条件为温度(28±1)℃,避光培养,空气相对湿度40%～60%。将诱导出的愈伤组织挑取出来继代培养,继代培养基和培养条件与本节方法相同。

1.3.2 愈伤组织培养基激素优化实验设计

根据周耀等[15]的研究,采用3因素3水平正交试验,将诱导出的愈伤组织接种于不同激素浓度组合的MS固体培养基上,共9组实验,每个实验组作3次平行。

1.3.3 愈伤组织细胞生长曲线的绘制

参照赵文佳[14]的方法加以修改,将愈伤组织接种于继代培养基中,接种量为0.7 g/瓶,培养基装液量为250 mL培养瓶中装40 mL培养基,培养周期为30 d,2 d收获1次,测定干质量。以干质量为纵坐标、收获时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。

1.3.4 愈伤组织中多酚类物质的鉴定

1.3.4.1 多酚的提取方法

将新鲜显齿蛇葡萄叶片、愈伤组织和悬浮培养细胞置于真空干燥箱中,50 ℃干燥至恒重,研磨成粉末;根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,检测3种粉末的含水量分别为3.646、4.678、3.204 g/100g。准确称取0.05 g叶片、愈伤组织、悬浮培养细胞粉末于试管中,加入1.75 mL甲醇,在35 ℃恒温条件下超声辅助提取30 min,提取液3 000 r/min离心10 min,吸取上清液,经0.22 μm有机滤膜过滤,4 ℃避光保存备用。

1.3.4.2 UPLC- Q- TOF MS/MS对多酚的定性检测方法

UPLC- Q- TOF MS/MS检测是委托苏州帕诺米克生物医药科技有限公司进行的。检测按照该公司的标准检测程序、参照Bourgou等[16]的样品处理方法和Sonda等[17]的检测方法进行。

1.3.5 悬浮培养细胞体系的建立及优化方法

参考李燕平等[18]的方法,选取优良愈伤组织,取8～10 g鲜重细胞于含有40 mL液体培养基的100 mL锥形瓶中,液体培养基为含有1.0 mg/L KT、0.3 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L NAA和30 g/L蔗糖的MS培养基。培养pH值为5.8±0.2,温度(28±1)℃,转速110 r/min,每4 d继代一次。

1.3.6 悬浮培养细胞生长规律的测定

参照Liu等[19]的方法绘制悬浮培养细胞生长曲线。细胞培养条件同1.3.5节,培养周期为16 d,每1 d收获1次,55 ℃真空干燥箱中干燥12 h至恒重,测定细胞干质量,绘制细胞生长曲线。

1.3.7 悬浮培养细胞中多酚的测定

1.3.7.1 多酚的提取方法

悬浮培养细胞多酚的提取方法同1.3.4.1节。

1.3.7.2 UPLC- Q- TOF MS/MS对多酚的定性检测方法

多酚的定性检测方法同1.3.4.2节。

1.3.7.3 HPLC对多酚的定量检测

HPLC检测条件:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),流速0.8 mL/min。柱温35 ℃,进样量10 μL。 流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为乙腈,流动相B为体积分数0.3%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0～10 min时,φ(流动相A)由5%变为10%;10～12 min时,φ(流动相A)由10%变为15%;12～20 min时,φ(流动相A)由15%变为30%;20～28 min时,φ(流动相A)由30%变为50%;28～45 min时,φ(流动相A)由50%变为80%;45～50 min时,φ(流动相A)由80%变为10%。检测波长280 nm。

1.3.7.4 多酚标准品溶液的制备

称取标准品[原花青素B1、(+)-儿茶素、表儿茶素、原花青素C1、表儿茶素没食子酸酯、矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷],用甲醇溶解配制成1 mg/mL的标准品溶液,吸取不同体积配制成7～9个适当浓度梯度的标准品溶液备用。采用1.3.7.3节中的HPLC检测条件,多酚类物质标准品质量浓度(x)与HPLC峰面积(y)的线性关系见表1。

1.3.8 显齿蛇葡萄叶中多酚的测定

1.3.8.1 多酚的提取方法

显齿蛇葡萄叶中多酚物质的提取方法同1.3.4.1节。

1.3.8.2 UPLC- Q- TOF MS/MS对多酚的定性检测方法

UPLC- Q- TOF MS/MS检测是委托苏州帕诺米克生物医药科技有限公司进行的。检测按照该公司的标准检测程序、参照Vasilev等[20]的样品处理方法和Lei等[21]的检7测方法进行。

1.3.9 悬浮培养细胞多酚抗氧化活性的测定

根据1.3.4.1节中的提取方法,参考黄采姣等[22]的方法将悬浮培养细胞的多酚提取液分别稀释成5～7个适当浓度梯度的提取液用于抗氧化能力的测定。称取维生素C标准品,用超纯水溶解配制成1 mg/mL的溶液备用。以维生素C为阳性对照组,测定相同质量浓度下的悬浮培养细胞的多酚提取液和4种标准品[表儿茶素没食子酸酯、(+)-儿茶素、原花青素B1、原花青素C1]的ABTS+、DPPH自由基的清除率和总还原力。

ABTS+自由基清除率计算方法见式(1)。

ABTS+自由基清除率

(1)

式(1)中,Ac为40 μL甲醇和160 μL ABTS+母液的混合物于732 nm波长处测得的吸光度值;As为40 μL悬浮培养细胞的多酚提取液和160 μL ABTS+母液反应6 min于732 nm波长处测得的吸光度值;Ao为40 μL悬浮培养细胞的多酚提取液和160 μL 95%乙醇的混合物于732 nm波长处测得的吸光度值。以维生素C替换悬浮培养细胞的多酚提取液测定吸光度作为阳性对照组。

DPPH·清除率计算方法见式(2)。

DPPH·清除率

(2)

式(2)中,A1为40 μL甲醇和160 μL DPPH·的混合物于517 nm波长处测得的吸光度值;A2为40 μL悬浮培养细胞的多酚提取液和160 μL DPPH·反应6 min于517 nm波长处测得的吸光度值;A3为40 μL悬浮培养细胞的多酚提取液和160 μL95%乙醇的混合物于517 nm波长处测得的吸光度值。以维生素C替换悬浮培养细胞的多酚提取液测定吸光度作为阳性对照组。

总还原力的测定采用铁氰化物还原法作为总还原能力测定的方法。200 μL悬浮培养细胞的多酚提取液、200 μL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH=6.6)和200 μL质量分数为0.3%的铁氰化钾水溶液混合,摇匀静置50 ℃反应5 min后加入200 μL质量分数为10%的三氯乙酸水溶液,离心机12 000 r/min离心5 min,取上清液100 μL。100 μL上清液、70 μL蒸馏水和30 μL质量分数为0.3%的FeCl3水溶液混合,摇匀静置10 min于700 nm波长处测定吸光度。以维生素C替换悬浮培养细胞的多酚提取液测定吸光度作为阳性对照组。

1.4 数据处理

实验数据采用Origin和SPSS Statistic 20软件进行分析,每次实验均进行3 次重复。数据结果以平均值±标准偏差表示,样品间多重比较采用邓肯新负极差法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导和优良愈伤系的筛选结果

本研究以显齿蛇葡萄幼叶和幼茎为外植体诱导了愈伤组织,愈伤组织诱导和筛选过程及悬浮细胞的照片见图1。在接种后第7天左右,叶片开始蜷曲,叶片边缘逐渐出现白色愈伤颗粒;新诱导的愈伤组织生长较为缓慢,直到第12天左右愈伤组织迅速繁殖;在第22天时,愈伤组织包裹了整个叶片,见图1(d);从叶片外植体开始诱导到形成愈伤组织大约需要30 d。从诱导实验结果可知,幼茎外植体难以诱导出愈伤组织,因此放弃以幼茎为外植体的诱导方式。以叶片为外植体所诱导出来的初代愈伤组织,质地较硬,生长速度较慢,对其进行连续的继代和筛选。在继代和筛选的过程中,愈伤组织的质地逐渐变得松散、脆嫩,在继代和筛选到第10代以后,获得了质地较软、生长速度较快的绿色愈伤系,但有明显的水渍感,且其内部易褐化,见图1(e)。随着继代和筛选次数的增加,愈伤组织逐渐适应了培养环境,生长周期变短,从初代的30 d缩短到了20 d,且生长状态和表型稳定。这与赵文佳[14]所述的愈伤诱导过程基本一致,在诱导过程中会形成不同性状的愈伤系,赵文佳所述诱导形成了5个愈伤系,本实验产生了灰白色和绿色2种愈伤系,且绿色愈伤系表观状态和生长状态都更有优势,得以存活下来。

2.2 愈伤组织培养基激素的优化结果

在预实验中,对其他影响显齿蛇葡萄叶愈伤组织生长的重要因素做了系列实验,如培养基种类和接种量等因素。对常见的“1/2MS、NB、B5、White”培养基进行了比较,发现这些培养基都不太利于显齿蛇葡萄叶愈伤组织的生长。对于培养基中的蔗糖含量,目前已经有很多的文献报道和实际使用案例,因此就直接选择了常用的30 g/L蔗糖添加量,实验结果也证明选择这一浓度对愈伤组织生长是有较好效果的。综合预实验结果来看,笔者认为培养基的激素对显齿蛇葡萄叶愈伤组织的生长影响更大,因此将研究重点放在了激素上面。根据周耀等[15]的研究,笔者选取6-BA、KT、NAA、2,4-D这4种激素对其进行单因素实验,通过外观形态观测和生物量监测基本上可以判断这4种激素对细胞生长和繁殖的影响,如高浓度的6-BA对愈伤组织的生长有明显的抑制作用,所得愈伤组织均褐化严重甚至死亡,见图1(f)。因此后续实验选取KT、NAA、2,4-D这3种激素进行正交试验并且初步选定了后续正交试验的浓度范围。在实验过程中,各个实验组的愈伤组织前期差异不明显,在第12天左右表观和生长速度开始发生明显差异,在第20天收获了细胞,根据愈伤组织的外观形态和生长速度进行了初步筛选,实验结果见表2。

由表2可知,当培养基中KT含量远低于生长素含量时,如正交试验2和3组,愈伤组织体积不大,且质感较硬,没有疏松感;当KT含量远高于生长素含量时,如正交试验4、7、8组,愈伤组织呈现黄绿色,表面有轻微颗粒感,但是由于生长素含量低,生长缓慢,且在1周左右后发生褐变;当KT含量略高于生长素含量时,如正交试验1、6、9组,在这3种激素组合条件培养下的愈伤组织颜色较好,但均有不同程度的表面褐化,而正交试验6和9组可能由于2,4-D浓度偏高,愈伤组织褐化较组合1更为严重,在组合1中进行连续继代,5代后正交试验组合1内部变成空心,表面褐化,生物量较少;而在正交试验组合5中,愈伤组织逐渐长成淡黄白色愈伤系[图1(g)],颗粒感明显,生长速度快,性状优良。因此选取激素组合5(即含有1.0 mg/L KT、0.5 mg/L2,4-D和0.3 mg/L NAA)的MS培养基作为愈伤组织继代培养基。

2.3 愈伤组织细胞的生长特性

对在优化激素条件下培养的显齿蛇葡萄叶愈伤组织生长规律进行了为期30 d的培养观测(见图2),由图2(a)可知,其生长规律呈现典型的“S”形,可大致分为4个阶段:缓慢期(0～10 d)、指数生长期(10～18 d)、稳定期(18～20 d)、衰退期(20～30 d)。根据结果,优化稳定后的愈伤细胞最佳继代时间为第16 d,与初始诱导的细胞相比缩短了4 d,仅在第18 d就达到生物量峰值;22 d后,细胞衰退,开始停止生长。晋海军等[23]研究了红花龙胆的组织培养及其理化特性,发现红花龙胆愈伤组织的最佳继代时间长达42 d,表明愈伤组织的继代周期因植物本身和诱导条件而异。

2.4 愈伤组织中主要多酚类物质的鉴定结果

采用了UPLC- Q- TOF MS/MS技术对愈伤组织进行定性分析(图3),之后采用HPLC将显齿蛇葡萄叶愈伤多酚提取物的各个色谱峰得到了较好的分离[图3(a)],并根据UPLC- Q- TOF MS/MS结果[图3(b～c)]对物质进行鉴定(表3),物质质谱的二级碎片离子见图3(d～l)。结果表明,显齿蛇葡萄叶愈伤多酚提取物中有9个分离明显的色谱峰,鉴定出了其中7个多酚化合物[图3(a)],尤其以表儿茶素没食子酸酯(6号峰)丰度最高。

化合物1准分子离子峰m/z=577.132 9,特征碎片离子407.071 1、289.071 9、425.086 8、125.026 1等。根据文献报道[24],原花青素二聚体失去一个聚合单元产生m/z=289的碎片离子,或者发生逆狄尔斯- 阿德尔反应且失去一分子水分别产生m/z=425和m/z=407的碎片离子。推测峰1为原花青素B1。

化合物2的保留时间为5.889 min,出现准分子离子峰m/z=289.070 8,特征碎片离子为123.047 1、203.071 4、125.021 9。花青素是由儿茶素、表儿茶素、没食子酸酯结合而成的聚合单元[25],其准分子离子峰为289,由于没有检测到没食子酸的特征离子169,又加入标准品进行比对,鉴定峰2为(+)-儿茶素。

化合物3的保留时间为6.042 min,对比准分子离子峰和特征碎片离子,目前暂未发现相关物质报道,所以未知该化合物种类。

化合物4准分子离子峰m/z=729.146 3,出现没食子酸特征碎片离子169,推测其可能失去没食子酰基产生二聚体m/z=577,或者失去一个T-unit生成表儿茶素没食子酸酯m/z=441。这与徐德平等[26]报道的葡萄籽当中的花青素结构裂解规律吻合,所以化合物4,推测为原花青素二聚体没食子酸酯。

化合物5和8的保留时间分别为7.146 min和9.305 min,出现相同的准分子离子峰和特征碎片离子分别为m/z=389和m/z=227,推测其为白藜芦醇苷,根据白藜芦醇苷出峰时间后于反式白藜芦醇苷[27],推测峰5为反式白藜芦醇苷,化合物8为白藜芦醇苷。

化合物6的保留时间为7.455 min,准分子离子峰m/z=441.080 8,根据文献报道[28],推测失去一分子没食子酸,得到m/z=289,或失去一分子表儿茶素,得到负离子没食子酸m/z=169,加标检测后,鉴定化合物6为表儿茶素没食子酸酯。

化合物7的保留时间为7.885 min,准分子离子峰为m/z=471.092 9,特征碎片离子出现了287.056 8、303.051 3、125.027 0,其裂解方式与表儿茶素没食子酸酯类似,初步推断化合物7为3″-O-甲基表没食子儿茶素没食子酸酯。

化合物9的保留时间为33.616 min,本研究仅鉴定出其准分子离子峰和二级质谱,查阅文献未找到可能符合的化合物。

2.5 悬浮培养细胞培养体系建立及优化

以筛选和优化后的愈伤组织为原料,通过对接种量、装液量、培养基蔗糖含量以及基础培养基的种类等因素进行逐个而系统的实验,建立高质量且稳定的显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养体系(图4)。

2.5.1 接种量对悬浮培养细胞生长的影响

细胞密度会影响细胞的生长速度,起始接种量的大小直接影响悬浮细胞的生长,不同细胞建立悬浮体系最适的细胞密度略有差异,李燕平等[18]的实验结果表明:牛至悬浮细胞的最佳接种量为15%。由图4(a)可知,当接种量达到20%时,增长倍数达到最大为4.45倍。虽然在接种量为35%时细胞生物量达到最高,但是考虑到经济性,接种量为20%时,接种量和生物量以及生物量增长倍数综合性价比较高。因此,显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞体系最佳的接种量是20%,即8 g。

2.5.2 装液量对悬浮培养细胞生长的影响

由图4(b)可知,当装液量过少时,细胞密度过高,同时竞争有限的培养基营养组分,表现为细胞生物量增长倍数较小;当装液量过多时,培养基液面过高,导致培养基内悬浮体系振幅过小,出现分层现象,细胞缺氧导致褐化和死亡。根据本实验结果,当装液量为40 mL液体培养基装入100 mL锥形瓶时,细胞生物量增殖倍数高达5.8倍。

2.5.3 蔗糖含量对悬浮培养细胞生长的影响

过高的蔗糖含量会加速细胞褐化和衰老,导致细胞死亡,同时增加污染风险;过低的蔗糖含量则无法给细胞提供足够的能量,不利于悬浮细胞的生长。如图4(c)所示,当蔗糖含量为3%时,细胞的生物量最大。林秀莲等[29]建立的相思树悬浮细胞最适蔗糖含量也为3%,大量文献也验证植物悬浮细胞的蔗糖含量为3%可能是一个比较合适的浓度。

2.5.4 基础培养基对悬浮培养细胞生长的影响

培养基是悬浮细胞生长最为基础的营养物质,不同植物所需营养物质不同,对基础培养基的要求也不一样[15],基于原诱导基础培养基,对其进行筛选。由图4(d)的结果可知,最适于显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞的培养基由优至劣依次是MS、B5、NB和1/2MS,MS培养基中的细胞生物量增长倍数可高达5.75倍。

2.6 悬浮培养细胞的生长规律

优化后的稳定显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞的生长规律呈现“S”形 [图2(b)],在为期15 d的培养观测中得出结果,显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞的生长大致分为4个阶段:缓慢期(0～7 d)、指数生长期(7～9 d)、稳定期(9～12 d)、衰退期(12～15 d)。细胞在前4天生长缓慢,从第7天开始大量增殖,在第9天达到生物量峰值18.5 g/L;大约2～3 d生物量趋于稳定;12 d后,细胞开始衰退,生物量减少。因此初步判断其继代的最佳时间为第7天,收获最佳时间为第9天。根据报道,剑麻细胞悬浮继代周期为其对数生长期8 d,整个生长周期仅有12 d,说明不同植物的生长周期因理化特性和诱导条件存在差异[30]。

2.7 悬浮培养细胞主要多酚类物质的鉴定

采用UPLC- Q- TOF MS/MS和HPLC进行联合检测,从悬浮培养细胞中检测到11个分离明显的色谱峰,见图5,鉴定出了其中10种化合物(表4),物质二级碎片离子见图5(e～o)。其中原花青素B1、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯为显齿蛇葡萄叶愈伤组织和悬浮培养细胞中共有的物质,同样未检测出二氢杨梅素的存在,可待后续研究。

化合物1出现的准分子离子峰和特征碎片与表2中的化合物1一致,推测化合物1为B型原花青素二聚体。

化合物2和化合物4具有相同的准分子离子峰m/z=289.070 8以及特征碎片离子109.034 6、203.064 1、123.048 8,又根据洗脱时间不同,加入标准品进行HPLC比对,鉴定化合物2和化合物4分别为(+)-儿茶素和表儿茶素。

化合物3的保留时间为15.562 min,准分子离子峰m/z=355.092 4,碎片离子为193.064 3、160.023 2、132.030 3,与文献报道一致[31],推测其为黄腐醇。

化合物5的保留时间为16.676 min,与蒋彤等[24]报道的一样,准分子离子峰m/z=865.202 2,出现碎片离子577.137 8、407.080 2、287.056 9,初步推断化合物5是原花青素C1。

化合物6的准分子离子峰m/z=729.144 8,碎片离子为577.126 5、169.015 2、407.076 4、289.071 9,推断化合物6为原花青素二聚体没食子酸酯,但是原花青素二聚体没食子酸酯含有多达十几种的异构体,后续需要借助核磁共振技术对其具体结构进行确定。

化合物7和化合物10均出现准分子离子峰m/z=449和特征碎片离子287,推测其失去一个六元糖苷,生成287(矢车菊素特征质荷比),推测2个峰分别为矢车菊素3-O-半乳糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷。又因为矢车菊素3-O-半乳糖苷洗脱时间早于矢车菊素3-O-葡萄糖苷。进而确定2个峰。

化合物8和化合物9都出现准分子离子峰和碎片离子分别为m/z=441和m/z=169、125、289,根据2.4节中分析,又加入标准品HPLC比对,得出结论,化合物8和化合物9分别为儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。

化合物11准分子离子峰m/z=663.388 3,仅有一个碎片离子m/z=175.042 0,暂时未能鉴定。

2.8 悬浮培养细胞主要多酚类物质的定量检测

悬浮细胞中多酚类物质的含量见表5。从实验结果可知一共测定了7个多酚类物质的含量,其中表儿茶素没食子酸酯的质量浓度最高,达到1 044.725 μg/g,其次是(+)-儿茶素755.957 μg/g;原花青素C1含量为272.497 μg/g;原花青素B1为367.726 μg/g。

2.9 愈伤组织、悬浮培养细胞与叶片中主要多酚类物质的比较

采用LC- MS方法,从叶片中检测出了831种物质,见图3(c),鉴定出物质23种,包括2个色酮类物质、3个查尔酮类物质和18个黄酮类物质,其中二氢杨梅素的色谱峰分离明显且丰度较高,质量分数高达15.937 mg/g。从愈伤组织和悬浮细胞中分别鉴定出了7(表3)和10(表4)种多酚类物质,其中原花青素B1、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯为显齿蛇葡萄叶愈伤组织和悬浮细胞中共有的物质,且丰度较高。与愈伤组织和悬浮细胞相比,叶片中物质的种类非常多,黄酮类物质尤其是二氢杨梅素的含量很高。在愈伤组织和悬浮细胞中未检测到二氢杨梅素,但却发现了高含量的表儿茶素没食子酸酯等多酚,这可能是基因选择性表达的结果。愈伤组织和悬浮细胞是脱分化了的细胞,在这些细胞中二氢杨梅素的合成未启动,或合成量很低检测不出来。那么悬浮培养细胞中多酚类物质组成和含量的这些变化会不会导致活性的变化,于是又对其进行了抗氧化活性评价。

2.10 悬浮培养细胞多酚提取物的抗氧化活性

鉴于显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞中检测出了较多的多酚类物质,因此采用自由基清除实验(ABTS+·、DPPH·)和还原能力实验(铁氰化物),对显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞的多酚提取物进行了抗氧化能力的评估,见图6。结果表明:在20～100 μg/mL实验浓度内,显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞多酚提取物对DPPH· [图6(a)]和ABTS+·[图6(c)]清除能力以及还原能力的吸光度值 [图6(e)]分别达到了95.071%、94.875%和2.145,ABTS+·和DPPH·清除实验IC50值分别为30.681 μg/mL和3.685 μg/mL,且在相同质量浓度下总多酚对DPPH·的清除和总还原能力均强于维生素C。徐新等[32]在研究显齿蛇葡萄叶片提取物的抗氧化活性中发现其具有确切较强的体外抗氧化作用,叶片提取物中的主要成分二氢杨梅素等其他黄酮可能是起抗氧化活性作用的主要物质。但是本研究的悬浮培养细胞中并未检测到高含量的二氢杨梅素,这就说明悬浮培养细胞中的抗氧化能力可能来源于其他物质。

为了进一步明确细胞多酚提取物中对抗氧化活性起主要贡献的物质,本研究对2.8节中质量浓度较高的前4种多酚化合物[表儿茶素没食子酸酯、(+)-儿茶素、原花青素B1、原花青素C1]进行了抗氧化能力检测,同时根据其在提取物中的含量进行了模拟复配,检测了模拟复配物的抗氧化能力。在DPPH自由基清除实验中 [图6(b)],表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、(+)-儿茶素、原花青素B1、原花青素C1 4种多酚单体在实验浓度范围内呈现良好的剂量效应关系,对DPPH·的清除率均达到了20%～35%,尤其以ECG和C贡献最大;模拟复配物的清除能力虽然不及总多酚提取物,但是贡献率也在50%～76%。在ABTS+自由基清除实验中 [图6(d)],4种多酚单体依旧呈现良好的剂量效应关系,对ABTS+的清除率均在20%以内,而原花青素C1在其中的贡献率却略有增加,最高达到了20%的清除能力,ECG和C次之;模拟复配物的清除能力与4种多酚单体单独作用能力之和基本一致,占总多酚提取物清除能力的46%～67%。在总还原能力测定实验中 [图6(f)],4种多酚单体的吸光度值在0.1～0.2,ECG和C的吸光度值达到了0.38和0.40,贡献率最大;模拟复配物的还原能力与4种多酚单体单独作用的还原能力之和基本一致,最高占总多酚提取物还原力的60%。

因此,显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞总多酚提取物具有较强的抗氧化能力可能是由于含有较高含量的表儿茶素没食子酸酯和(+)-儿茶素。李银平[33]在研究中发现葡萄籽多酚提取液的抗氧化活性与各多酚单体物质如儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素等呈良好的正线性相关。张建华[34]比较了不同多酚的抗氧化和抑菌能力,发现儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等其他三种多酚单体的抗氧化能力较高。但是,4种多酚模拟复配的抗氧化能力均未达到总多酚提取物的抗氧化能力,甚至部分有较大差距,说明显齿蛇葡萄叶细胞提取物中可能存在其他含有较强抗氧化活性的物质,有待后续研究。

3 结果与讨论

显齿蛇葡萄叶,富含多酚类物质并且具有多种活性功能,但是,其研究和开发利用受到植物生长、提取纯化工艺等影响和限制。植物细胞培养是一种植物组织和器官的人工无菌培养技术。目前,关于植物细胞培养方面已有较多的研究,甚至已有部分植物细胞培养已经实现了工业化和规模化生产。研究人员通过高产组织或细胞系的筛选与培养条件的优化等措施来提高次生代谢产物的产量,或者通过对次生代谢产物生物合成途径的调控来达到相同的目的[13]。Liu等[13]建立了管花肉苁蓉的愈伤组织培养和细胞悬液,在1 g/L酪氨酸诱导下,松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分别提高到18.83%和2.92%;在200 μmol/L的茉莉酸甲酯的诱导下,其含量分别比野生植物提高了近2倍。王晓惠等[12]诱导和筛选了醉金香葡萄愈伤组织,通过悬浮培养制备白藜芦醇,优化了培养条件,使白藜芦醇的含量达到了3 026.640 μg/g。这些研究结果表明:优化培养条件和诱导能显著提高悬浮培养细胞中多酚类物质的含量。本研究目前建立和优化了显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞的培养条件,细胞生物量和总多酚含量在第9天就达到峰值为17.375 g/L和2 963.388 μg/g,有望通过诱导子的添加和培养激素的改变进一步提高多酚类物质的含量和产量。

本研究采用UPLC- Q- TOF MS/MS技术对显齿蛇葡萄叶、愈伤组织和悬浮培养的细胞的主要活性物质进行检测和鉴定,发现3者在主要成分方面存在比较大的差异,显齿蛇葡萄叶中以二氢杨梅素含量最高,达到15.937 mg/g ,与杨志坚等[35]报道的结果基本一致。而愈伤组织和悬浮培养细胞中没有检测出二氢杨梅素,但发现了较高含量的表儿茶素没食子酸酯,其含量分别达到了5 020.965 μg/g和1 044.725 μg/g。尽管在显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞当中没有检测到二氢杨梅素,却检测出较高含量的多酚类物质,尤其是表儿茶素没食子酸酯,其含量达到了1 044.725 μg/g,基本上达到了茶叶中的水平[36],甚至超过了赵国玲等[37]报道的47.95 mg/kg。研究表明:这些多酚类物质都具有很强的抗氧化活性[4]。从实验结果来看,(+)-儿茶素和表儿茶素没食子酸酯是显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞多酚提取物抗氧化活性的物质基础。根据Li等[38]的报道,显齿蛇葡萄叶片也具有较强的抗氧化活性,其抗氧化活性的物质基础是二氢杨梅素。

二氢杨梅素是显齿蛇葡萄叶片的标志性物质和主要活性成分,由于植物可能发生基因选择性表达,其在愈伤组织和悬浮培养细胞中的含量很低,但是多酚类物质含量很高。然而,愈伤组织和悬浮培养细胞中的表儿茶素没食子酸酯含量相差较大,这可能是培养环境和生长周期不同造成的,那么提高悬浮培养细胞中的多酚含量和产量也有很大的研究意义和前景。如果进一步进行前体饲喂,或者采用诱导等次生代谢调控技术,将能进一步提高多酚类物质的含量,其提取物的抗氧化活性也可能增强。另外,后续还将深入研究显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞中二氢杨梅素含量很低甚至没有的原因,并采取有效调控措施来刺激二氢杨梅素的合成,提高其产量,则能更好地提升显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养在生产二氢杨梅素和多酚类物质方面的应用价值。

4 结 论

本研究建立了显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养体系,优化后的培养条件:培养基是含有1.0 mg/L KT、0.3 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L NAA和30 g/L蔗糖的MS培养基,装液量为40 mL液体培养基装于100 mL锥形瓶中、接种量20%、培养温度(28±1)℃,摇床转速110 r/min,连续光照培养;优化培养条件下,细胞生物量和总多酚含量在第9天达到最大值,分别为17.375 g/L和2 963.388 μg/g;采用UPLC- Q- TOF MS/MS和HLPC检测技术,鉴定了悬浮细胞中的原花青素B1、(+)-儿茶素、黄腐醇、表儿茶素、原花青素C1、原花青素二聚体没食子酸酯、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯10种主要的多酚类物质,其中表儿茶素没食子酸酯和(+)-儿茶素含量较高,分别达到了1 044.725 μg/g和755.957 μg/g;显齿蛇葡萄叶悬浮培养细胞多酚提取物的ABTS+和DPPH自由基清除能力达到了95.071%和94.875%,还原能力的吸光度值达到2.145,ABTS+和DPPH自由基清除实验IC50值分别为30.681 μg/mL和3.685 μg/mL,在相同质量浓度下总多酚对DPPH·的清除和总还原能力均强于维生素C。

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Development of Cell Suspension Culture System for Ampelopsis grossedentataLeaf and Its Production of Polyphenolic Compounds

LING Lijuan1, ZHONG Yijia1, PAN Xiaoyang1, LIANG Qi1, CHEN Yuqin1, TANG Daobang2, CHEN Jiguang1, YIN Zhongping1,*

(1.College of Food Science and Engineering/Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Sericultural &Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610, China)

Abstract: Ampelopsis grossedentataleaf is rich in polyphenols, and now is regarded as a new food material with high value for utilization. Two typical kinds of calluses were induced from Ampelopsis grossedentatayoung leaves. The excellent calluses were successfully obtained by hormone optimization and successive screening, which were further used to develop the cell suspension culture system of Ampelopsis grossedentataleaf. The main polyphenols in the suspensively cultured cells were identified, and their antioxidant activities were evaluated in the meantime. Seven polyphenols were identified in the extracts of calluses by the UPLC- Q- TOF MS/MS and HLPC detection, while ten polyphenols were identified in the suspensively cultured cells. Three polyphenols including proanthocyanidin B1, (+)-catechin, epigetechin gallate were found both in calluses and cells with high concentration, among which epicatechin gallate was the most abundant compound, whose contents reached 5 020.965 μg/g and 1 044.725 μg/gin calluses and cells, respectively. In addition, total polyphenols extracts from the suspensively cultured cells displayed strong antioxidant activities, with IC50values of 30.681 μg/mL and 3.685 μg/mL respectively in the ABTS+and DPPH free radical scavenging tests. What’s more, both the DPPH radical scavenging and total reduction ability of the polyphenol extracts were significantly stronger than vitamin C under the same mass concentration, which were mainly attributed to epicatechin gallate and (+)-catechin. It was hoped that this study would provide a reference for the culture of Ampelopsis grossedentataleaf cells and the regulation of its polyphenolic secondary metabolite synthesis.

Keywords: Ampelopsis grossedentataleaf; vine tea; callus; suspension culture; cell; polyphenol

中图分类号: TS201.4

文献标志码: A

doi:10.12301/spxb202200412

文章编号:2095-6002(2023)02-0104-17

引用格式:凌丽娟,钟伊嘉,潘晓洋,等.显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养体系的建立及其产多酚类物质研究[J]. 食品科学技术学报,2023,41(2):104-120.

LING Lijuan, ZHONG Yijia, PAN Xiaoyang, et al. Development of cell suspension culture system for Ampelopsis grossedentataleaf and its production of polyphenolic compounds[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(2):104-120.

收稿日期: 2022-04-20

基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (31960515);江西省自然科学基金资助项目 (20192BAB204004);广东省农业科学院农产品加工国家重点实验室培育基地开放基金资助项目(202109)。

Foundation: NationalNatural Science Foundation of China (31960515); Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20192BAB204004); Open Funding Project of Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing (202109).

第一作者: 凌丽娟,女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。

*通信作者: 尹忠平,男,教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。

(责任编辑:李 宁)