卡拉胶是从红藻中分离出的一类线性硫酸多糖,由于其具有良好的稳定性和胶凝性等理化性质,自20世纪50年代以来被广泛应用于食品及日用化工等领域[1]。随着中国食品加工业的快速发展,卡拉胶已成为许多产品的添加剂,如乳制品、果冻、罐头、火腿等。2008年,世界卫生组织统计卡拉胶的人均日消耗量为30～50 mg,而我国婴幼儿配方食品中卡拉胶的添加量是0.3 g/L[2],非母乳喂养的婴儿在前5个月的日消耗量最高可达到240 mg。

科学界和国际官方机构对卡拉胶的食用安全性一直存在争议。欧盟委员会、国际食品添加剂联合专家委员会、美国食品和药物管理局等国际官方机构普遍认为食品级卡拉胶无害,将其定义为“普通安全级”水平,并取消了日允许摄入限制[3-4]。然而以Tobacman为代表的一些研究者认为卡拉胶对人体健康有负面影响,例如食品级卡拉胶具有促炎特性[5-6]。Shang等[7]的研究也发现,小鼠摄入3种未降解卡拉胶6周可诱发肠道炎症。除了卡拉胶的促炎效应之外,近年来越来越多的研究者关注于卡拉胶对代谢的影响。体内研究报道卡拉胶会加剧高脂饮食小鼠的空腹血糖水平升高,并在不增加体质量的情况下加重小鼠高脂血症[1,8]。Bhattacharyya等[9-10]发现,λ-卡拉胶能够通过TLR4-BCL10途径间接抑制胰岛素信号传导。课题组前期的研究也证实,长期摄入食品级κ-卡拉胶可以干扰胰岛素与胰岛素受体的结合,进而影响PI3K和Akt的磷酸化并下调葡萄糖转运蛋白和糖原合酶的表达[11]。

肠道菌群已被公认为肥胖相关代谢性疾病发展的重要因素,参与维持能量稳态和宿主免疫力的内分泌器官[12]。肠道菌群可以通过与肠上皮细胞相互作用直接参与糖代谢过程[13]。此外肠道微生物群可以将人体难消化的多糖(低聚糖和抗性淀粉等)转化为短链脂肪酸(SCFA),如乙酸、丙酸和丁酸,间接参与糖代谢的调控[14]。而饮食会对肠道菌群组成产生影响[15]。摄入卡拉胶可使肠道菌群的微生物组成改变,并影响肠道功能[7,16],这可能是卡拉胶对糖代谢造成影响的重要原因。

随着食品工业的发展以及消费者对精细加工食品需求的增加,人体摄入卡拉胶的剂量在不断上升。但卡拉胶对人体健康的影响仍然存在一些不确定性。因此,本研究拟采用λ-卡拉胶灌胃小鼠12周,通过检测小鼠葡萄糖耐受性、胰岛素抵抗和肠道微生物16S rDNA序列,研究λ-卡拉胶对小鼠糖代谢及肠道菌群的影响。借助粪菌移植技术探究肠道菌群在λ-卡拉胶影响小鼠糖代谢中的作用,以期为卡拉胶的食用安全性评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

λ-卡拉胶,Sigma-Aldrich公司(原料:Eucheumacottonii, 5～25 mPa·s, 25 ℃, type Ⅲ)。48只雄性C57BL/6小鼠(6周龄,体质量15～20 g,每组12只),浙江大学(SCXK2018-0006);32只雄性无菌C57BL/6小鼠(6周龄,体质量15～20 g,每组8只),上海国家实验动物种子中心;小鼠饲料,北京科奥西力饲料有限公司,实验动物饲料的营养成分符合GB 14924.3—2010标准,且饲料中不含有λ-卡拉胶;胰岛素,江苏万邦生物化学医药有限公司。

1.2 仪器与设备

Anodrop TM 2000型分光光度计,美国Thermo Fisher Scientific公司;Mastercycler pro型 PCR仪,德国Eppendorf公司;ACCU-CHEK Guide型动物血糖测试仪,上海罗氏诊断产品有限公司;100 kDa超滤膜,德国Sartorius公司。

1.3 实验方法

1.3.1 λ-卡拉胶预处理

λ-卡拉胶用0.2 mol/L的KCl溶液沉淀再纯化,并溶解在80 ℃的生理盐水中,搅拌2～3 min,冷却至37 ℃。将λ-卡拉胶溶液通过100 kDa超滤膜透析,除去可能存在的低分子量卡拉胶组分。

1.3.2实验动物处理

雄性C57BL/6小鼠在宁波大学医学院动物中心喂养(21 ℃的环境温度和60%的湿度),小鼠自由进食和饮水。对照组小鼠灌胃生理盐水(NC),实验组小鼠灌胃不同剂量的λ-卡拉胶:低剂量组(1.7 mg/kg,CGN-L)、中剂量组(8.3 mg/kg,CGN-M)和高剂量组(41.7 mg/kg,CGN-H),每天灌胃1次,持续12周。实验所用剂量依据本课题组早期研究确定[17]。实验期间每4周测量1次小鼠体质量和 24 h平均食物消耗量(在测试的前一天将每组小鼠单独饲养,然后记录每只小鼠24 h内的食物消耗量),并利用罗氏血糖仪检测小鼠空腹血糖1次。在实验的第12周结束后收集小鼠粪便,立刻置于液氮中速冻,储存于-80 ℃备用。各组一半的小鼠注射过量的戊巴比妥钠实施安乐死。剩余小鼠继续正常饲喂1周(不进行灌胃处理),稳定λ-卡拉胶干预后的肠道微生物群结构,并消除微生物群移植期间粪便样本中存在λ-卡拉胶的可能性。第13周结束后收集小鼠粪便以供粪菌移植使用,全部小鼠注射过量的戊巴比妥钠实施安乐死。

1.3.3 葡萄糖耐受性和胰岛素抵抗检测

喂养结束后,对C57BL/6小鼠进行口服葡萄糖耐受实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT)。OGTT实验中,小鼠禁食12 h,按照小鼠体质量灌胃2 g/kg的葡萄糖,在0、30、60、90、120 min时分别从尾静脉收集血样用于血糖水平检测。ITT实验中,小鼠禁食10 h,按照小鼠体质量腹腔注射1 U/kg的胰岛素,在0、30、60、90、120 min时分别从尾静脉收集血样检测血糖水平。

1.3.4 肠道菌群16S rDNA测序

按照DNA试剂盒(德国Qiagen公司)使用说明,从粪便样品中提取DNA。PCR仪扩增16S rDNA基因的高变区V3～V4,引物为338F(5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。通过使用校准的Ampure XP珠纯化扩增的DNA,构建测序文库。Illumina HiSeq平台(Illumina,圣地亚哥)进行DNA测序,并使用MR DNA分析通道处理序列数据。

1.3.5 16S rDNA基因扩增子序列分析

Mothur(V.1.30.1版)用于计算Chao1、ACE、Simpson 和 Shannon 指数,评估菌群丰富度和多样性。为了比较样品之间的微生物群落组成(β多样性分析),基于Bray-Curtis距离利用R软件(3.6.1版)进行PCoA和非度量多维尺度(NMDS)分析。KEGG通路功能预测以http:∥bioinfo.capitabio.com/mas分析工具对差异表达基因相关生物学信息进行分析,确定该位点的基因功能。登录NCBI数据库(http:∥www.ncbi. nlm. nih.gov/)进行查询,找到相关的差异表达基因,并将差异表达基因富集到信号通路中并进行相关性分析。

1.3.6 粪菌移植实验

无菌小鼠在无菌条件下单独饲养在无菌隔离包中。所有小鼠适应环境5 d,所有实验程序均按照宁波大学实验动物护理和使用健康指南进行,动物方案经宁波大学健康科学中心动物使用与保护伦理委员会批准(2020-41)。将粪便样品以400 mg/mL的质量浓度悬浮于体积分数为30%的甘油溶液中,无菌小鼠从无菌隔离包中取出,分为4组(NCtrans、CGN -Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans,每组8只),分别灌胃200 μL NC组或不同剂量λ-卡拉胶处理组的小鼠粪菌悬液一次。灌胃一周后取粪便样本和原始菌液同时进行16S rDNA测序,相似度达95%以上即表示定植成功,排除其中定植失败的小鼠。在随后的12周时间里,正常喂养小鼠。每4周对小鼠称重一次,并记录小鼠24 h内食物消耗量和空腹血糖。OGTT、ITT及粪便微生物测序的方法同1.3.3节和1.3.4节。最后通过注射过量的戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死。

1.4 数据处理

所有统计分析均使用SPSS 10.0。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用One-way ANOVA with Tukey-Kramer post test评估3组以上结果的差异或unpaired t-tests with two-tailed评估2组结果的差异。

2 结果与分析

2.1 λ-卡拉胶对小鼠糖代谢的影响

λ-卡拉胶对小鼠体质量、摄食量以及糖代谢的影响,如图1。由图1(a)可知,第4周和第8周时,λ-卡拉胶处理组小鼠的体质量增长明显低于NC组(P<0.05)。第12周时,与NC组相比,仅CGN-H组小鼠体质量明显降低(P<0.05)。但由图1(b)可知,各组小鼠的食物消耗量并没有显著差异。实验结果表明,λ-卡拉胶处理组与NC组小鼠的体质量差异不是由食物摄入量引起的。喂养期间每4周检测各组小鼠空腹血糖水平。由图1(c)可知,与NC组相比,λ-卡拉胶处理组小鼠空腹血糖的水平显著增高(P<0.05),其中CGN-M组和CGN-H组小鼠血糖水平分别上升了18.97%和14.99%。由图1(d)、(e)可知,λ-卡拉胶灌胃小鼠12周后,OGTT结果发现各处理组小鼠血糖水平变化趋势一致,均在口服葡萄糖30 min后达到峰值,然后逐渐恢复至最初状态,但CGN-H组小鼠的血糖水平在30 min时,显著高于NC组(P<0.05),且CGN-H组OGTT曲线下面积升高了13.31%(P<0.05)。ITT结果由图1(f)、(g)可知,在注射胰岛素60、90 min时,λ-卡拉胶处理组小鼠的血糖水平明显高于NC组(P<0.05),CGN-L、CGN-M、CGN-H组的曲线下面积分别上升了60.72%、60.06%、42.62%(P<0.05)。研究结果表明,摄入λ-卡拉胶,特别是高剂量λ-卡拉胶(41.7 mg/kg),可能会导致小鼠糖代谢紊乱。

CGN-L组与NC组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01);CGN-M组与NC组相比,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01);CGN-H组与NC组相比,&表示差异显著(P<0.05),&&表示差异极显著(P<0.01)。
图1 λ-卡拉胶对小鼠糖代谢的影响
Fig.1 Effect of λ-carrageenan on glucose metabolism of mice

2.2 λ-卡拉胶对小鼠肠道菌群组成的影响

2.2.1 肠道菌群多样性

对小鼠粪便进行16S rDNA测序,平均序列读数为40 600,coverage值均大于或等于0.994,表明测序结果足以代表样本的真实情况。小鼠肠道菌群α-多样性分析结果如表1。由表1可知,λ-卡拉胶处理组小鼠的Chao1指数均显著高于NC组(P<0.05)。实验结果表明,摄入λ-卡拉胶可提高小鼠肠道菌群多样性。CGN-H组的Shannon指数比NC组高12.34%(P<0.05),而CGN-L组和CGN-M组并无显著变化,说明CGN-H组的微生态多样性显著高于NC组。

表1 不同剂量λ-卡拉胶处理组小鼠肠道菌群的α-多样性

Tab.1 α-Diversity of gut microbiota in mice treated with different doses of λ-carrageenan

*表示与NC组相比差异显著(P<0.05)。

PCoA和NMDS分析比较不同剂量λ-卡拉胶处理的小鼠肠道微生物群结构差异,结果如图2。由图2可知,与NC组相比,不同剂量λ卡拉胶皆引起了小鼠肠道微生物群结构的偏移,且CGN-H和CGN-L组分别与NC组完全分离,CGN-M组与NC组仅有少量重叠。在NMDS分析中也发现各组小鼠肠道微生物群结构完全分离,没有任何重叠。实验结果表明,摄入λ-卡拉胶改变了小鼠的肠道菌群组成。

图2 不同剂量λ-卡拉胶处理组小鼠肠道菌群的β-多样性
Fig.2 β-Diversity of gut microbiota in mice treated with different doses of λ-carrageenan

2.2.2 肠道菌群门属水平及KEGG代谢通路差异

为了进一步探究λ-卡拉胶对小鼠肠道菌群组成的影响,门和属水平下的小鼠肠道菌群相对丰度变化情况,如图3。由图3(a)可知,在门水平下,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)是所有组别小鼠肠道中的优势菌群,占总数的80%以上。λ-卡拉胶干预后,Bacteroidota的相对丰度降低,Firmicutes的相对丰度升高。与NC组相比,CGN-H组Bacteroidota的相对丰度降低了17.85%,Firmicutes的相对丰度提高了18.60%(P<0.05)。变形菌门(Proteobacteria)在灌胃λ-卡拉胶后丰度降低,而脱铁杆菌门(Deferribacteres)丰度增加,但两者均无统计学差异(P>0.05)。由图3(b)可知,在属的水平下,λ-卡拉胶处理组小鼠肠道中与肠黏膜厚度有关的阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度显著升高(P<0.05);而调控糖代谢的Bacteroidales_S24-7_group_norank[18]的相对丰度显著降低(P<0.05);与NC组相比,CGN-H组Bacteroidales_S24-7_group_norank的相对丰度减少了20.03%。λ-卡拉胶使调控脂代谢并减轻体质量的乳杆菌属(Lactobacillus)和毛螺菌属(Lachnospiraceae_unclassified)的相对丰度上升[19]。NC组与CGN-H组之间的差异基因为2 943个,1 631个基因表达出现上调,1 312个基因表达出现下调。差异基因的KEGG通路富集结果如图3(c)所示,主要富集在各类生化代谢途径,如碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子及维生素代谢等,其中碳水化合物代谢通路有显著变化(P<0.05)。

*表示与NC组相比差异显著(P<0.05)。
图3 不同剂量λ-卡拉胶处理组小鼠肠道菌群相对丰度及代谢通路
Fig.3 Relative abundance and metabolic pathways of gut microbiota of mice treated with different doses of λ-carrageenan

2.3 粪菌移植对小鼠糖代谢的影响

利用粪菌移植技术验证肠道菌群在λ-卡拉胶诱导小鼠代谢紊乱中的作用,结果如图4。由图4(a)、(b)可知,在第12周,各组小鼠食物摄入量没有发生明显差异,与NCtrans组小鼠相比,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans组小鼠体质量增长率分别减少了16.41%、21.99%、22.99%(P<0.05)。此外,由图4(c)可知,移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌的无菌小鼠的空腹血糖水平显著高于NCtrans组,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans组小鼠的空腹血糖水平分别升高了13.61%、12.13%、16.58%。OGTT结果由图4(d)、(e)可知,CGN-Htrans组小鼠的血糖水平在灌胃葡萄糖30 min时,显著高于NCtrans组(P<0.05)。且与NCtrans组相比,CGN-Htrans组小鼠血糖曲线下面积升高了13.61%(P<0.05)。ITT结果由图4(f)、(g)可知,在腹腔注射胰岛素后60 min时,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans组小鼠的血糖水平明显高于NCtrans组(P<0.05),曲线下面积分别升高了92.98%、94.34%、97.27%(P<0.01)。研究结果表明,无菌小鼠在移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌后,同样表现出空腹血糖显著升高、葡萄糖耐受性降低和胰岛素抵抗的症状。

2.4 粪菌移植对小鼠肠道菌群组成的影响

2.4.1 肠道菌群多样性

对移植不同剂量λ-卡拉胶处理组小鼠粪菌的无菌小鼠粪便进行16S rDNA测序,平均序列读数为37 644,coverage均大于或等于0.995。实验结果表明,测序结果足以代表样本的真实情况。肠道菌群α-多样性分析结果如表2。由表2可知,与NCtrans组相比,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans组中表示群落丰富度的ACE指数和Chao1指数没有显著差异,表示群落多样性的Shannon指数也没有显著差异,表明移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠的粪菌对肠道菌群的α-多样性无显著影响。

利用PCA和NMDS分析比较移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌的无菌小鼠肠道菌群的β-多样性,结果如图5。由图5可知,与NCtrans组相比,移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌引起了各组小鼠肠道菌群结构的偏移,说明移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌的无菌小鼠肠道菌群组成存在差异。

图4 移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌对无菌小鼠糖代谢的影响
Fig.4 Effects of different doses λ-carrageenan-treated mice fecal bacteria transplantation on glucose metabolism of germ-free mice

表2 粪菌移植小鼠肠道菌群的α-多样性

Tab.2 α-Diversity of gut microbiota in mice treated with fecal bacteria transplantation

组别序列读数OTUACEChao1coverageShannonNCtrans37588.79±658.77495.50±27.35567.50±84.98581.50±101.850.995±0.00113.70±0.33CGN-Ltrans36665.33±1019.16444.33±33.88535.00±57.28553.68±66.740.996±0.00123.65±0.28CGN-Mtrans38730.83±734.47440.25±58.84523.00±79.39563.25±46.700.996±0.00083.53±0.24CGN-Htrans37591.40±1981.20472.00±64.86550.25±74.57580.20±85.510.996±0.00113.56±0.21

图5 移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌的无菌小鼠肠道菌群β多样性
Fig.5 β-Diversity of gut microbiota in germ-free mice transplanted with different doses of λ-carrageenan-treated mice fecal bacteria

2.4.2 肠道菌群门与属水平差异

*表示与NCtrans组相比差异显著(P<0.05)。
图6 移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠粪菌的无菌小鼠肠道菌群相对丰度
Fig.6 Relative abundance of gut microbiota from germ-free mice transplanted with different doses λ-carrageenan-treated mice fecal bacteria

移植不同剂量λ-卡拉胶处理组小鼠粪菌的无菌小鼠,肠道菌群在门、属水平上的差异如图6所示。由图6(a)可知,Bacteroidota与Firmicutes仍是优势菌群,与NCtrans组相比,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans、CGN-Htrans组Bacteroidota的相对丰度分别降低了0.57%、5.11%、12.32%,Firmicutes的相对丰度分别升高了2.90%、4.96%、16.76%。实验结果与灌胃不同剂量λ-卡拉胶小鼠肠道菌群中Firmicutes相对丰度上升和Bacteroidota相对丰度下降的变化趋势相一致。由图6(b)可知,CGN-Ltrans、CGN-Mtrans和CGN-Htrans组的Bacteroidales_S24-7_group_norank的相对丰度低于NCtrans组,其中CGN-Mtrans和CGN-Htrans组的Bacteroidales_S24-7_group_norank的相对丰度分别降低了11.01%和10.48%(P<0.05)。此外CGN-Htrans组的Lactobacillus和Akkermansia的相对丰度分别提高了27.22%和9.62%(P<0.05)。粪菌移植后,无菌小鼠与灌胃不同剂量的λ-卡拉胶小鼠的肠道菌群变化一致。促进体质量减轻和减少内脏脂肪的Firmicutes的Lactobacillus[20]丰度增加;而调节糖代谢的Bacteroidota中的Bacteroidales_S24-7_group_norank的丰度降低。

3 讨 论

卡拉胶是最常见的食品添加剂之一,广泛应用于加工食品中。最近的调查显示,法国126 556种食品中至少有5 322种含有食品级卡拉胶。体质量指数低的消费者往往摄入更多的卡拉胶,这可能是由于他们更偏爱低脂乳制品,如卡拉胶含量较高的酸奶和冰淇淋等加工食品[21]。

据报道,在典型的西方饮食中,60 kg体质量成年人的CGN每日摄入量远远超过500 mg(相当于小鼠8.3 mg/kg的剂量)[22]。而婴儿配方奶粉中卡拉胶的平均添加量甚至达到0.3 g/L[2],相当于5.8 kg体质量的婴幼儿的卡拉胶每日摄入量达到240 mg(相当于小鼠41.7 mg/kg的剂量)。Bhattacharyya等[23]发现,1.7 mg/kg剂量的卡拉胶能够诱发IL-10缺陷小鼠结肠炎症。因此,在本研究中,我们使用这些剂量来研究λ-卡拉胶对C57BL/6小鼠肠道菌群及糖代谢的影响。研究结果表明,摄入λ-卡拉胶,尤其是高剂量λ-卡拉胶(41.7 mg/kg)可使小鼠体质量增长率明显减少,但没有观察到食物摄入量的显著变化,说明饱腹感或厌食症并不是λ-卡拉胶诱导体质量增长率减少的原因。此外,研究发现,摄入λ-卡拉胶的小鼠出现了空腹血糖升高、葡萄糖耐受性受损和胰岛素抵抗的现象,但是这些指标的变化幅度不足以发展成糖尿病。本研究检测到的小鼠血糖水平低于糖尿病标准(空腹血糖大于195.8 mg/dL,OGTT峰值超过64 mg/dL)[24],表明本研究采用的λ-卡拉胶剂量可导致小鼠糖代谢紊乱,但不足以引发小鼠糖尿病。

小鼠粪便16S rDNA测序结果表明,λ-卡拉胶可诱导小鼠肠道菌群紊乱。Wu等[17]发现,λ-卡拉胶能够降低小鼠肠道黏液层厚度,而黏液层的变化会导致肠道菌的移位,进而影响肠道菌群的群落结构和丰度,可能是λ-卡拉胶影响肠道菌的原因。肠道菌群门、属水平差异分析结果表明,在门水平下,与NC组小鼠相比,灌胃λ-卡拉胶的小鼠肠道中的Firmicutes的相对丰度升高,Bacteroidota丰度降低。有研究报道,Firmicutes是产丁酸的主要菌门[25],丁酸盐通过促进肌肉中的线粒体功能来增加能量消耗,还可以通过抑制组蛋白去乙酰化过程来促进脂肪酸氧化[26]。Bacteroidota是肠道中产乙酸盐和丙酸盐的主要菌门[27]。乙酸盐和丙酸盐可通过G蛋白偶联的游离脂肪酸受体FFAR2刺激肠L细胞产生胰高血糖素样肽-1,进而促进胰岛素分泌以调控糖代谢[18,28]。

在属水平,λ-卡拉胶使Lactobacillus、Lachnospiraceae_unclassified和Akkermansia的丰度上升,Bacteroidales_S24-7_group_norank的丰度降低。Firmicutes中的Lactobacillus可通过减少脂肪酸吸收,增加脂肪酸氧化、减少脂肪细胞的体积[29]。Lachnospiraceae_unclassified可参与脂代谢调控并减轻体质量[19]。而Akkermansia是一种黏蛋白降解菌,可将结肠黏蛋白作为碳源吸收降解,其丰度增加可能会降低肠道黏液层厚度,影响肠道功能[30]。Lagkouvardos等[31]借助宏基因研究发现Bacteroidota的Bacteroidales_S24-7_group_norank具有降解多糖和转运碳水化合物的基因,可能具有血糖调控作用。而且在Yao等[32]和Li等[33]的研究中也发现,Bacteroidales_S24-7_group_norank的丰度降低与体质量降低有关。Li等[34]的研究发现,Bacteroidales_S24-7_group_norank水平与空腹血糖水平呈负相关。KEGG通路富集结果显示,λ-卡拉胶处理显著上调碳水化合物代谢通路相关基因,这与促进脂代谢的Firmicutes丰度升高和具有糖代谢调控作用的Bacteroidota相对丰度降低的结果相一致。实验结果表明,λ-卡拉胶诱导的肠道菌群改变可能是小鼠糖代谢紊乱的重要原因。

无菌小鼠的粪菌移植实验结果证实,移植灌胃λ-卡拉胶小鼠的粪菌同样使无菌小鼠产生了葡萄糖耐受性降低和胰岛素抵抗的症状。但是肠道菌群的分析结果显示,移植不同剂量λ-卡拉胶处理小鼠的粪菌后,各组小鼠肠道菌群的α-多样性无显著差异。本研究对无菌小鼠粪菌移植一次,在12周内,各组小鼠的饮食完全一致。α-多样性是衡量一个群落内物种的丰富度以及每个物种数量及分布的指标,在粪菌移植过程中,小鼠个体间存在的差异可能导致粪菌移植后各小鼠肠道中的菌群定植量不同,可能是粪菌移植后各组肠道菌群α-多样性无显著差异的原因。但是各组小鼠的肠道菌群结构(β-多样性)存在显著差异。微生物门和属水平分析结果表明,调节糖代谢的Bacteroidota中Bacteroidales_S24-7_group_norank的丰度降低,而调节脂代谢并与体质量降低有关的Lactobacillus以及与黏液层厚度有关的Akkermansia的丰度上升,并且粪菌移植小鼠与灌胃λ-卡拉胶小鼠的肠道菌群的变化一致。

4 结 论

本文研究了灌胃λ-卡拉胶12周对小鼠体质量、肠道菌群和糖代谢的影响。研究结果发现,1.7、8.3、41.7 mg/kg灌胃剂量的λ-卡拉胶可使小鼠肠道菌群结构发生变化,诱导小鼠糖代谢紊乱并使体质量增长减少。粪菌移植实验结果证明,肠道菌群在λ-卡拉胶诱导的小鼠糖代谢紊乱中发挥重要作用。摄入λ-卡拉胶可能会影响人体血糖代谢,但是对卡拉胶作为食品添加剂的使用剂量的评价仍需要更为全面、深入的基础及临床研究。

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Influence of λ-Carrageenan Induced Gut Microbiota Disorder on Glucose Metabolism of Mice

ZHAI Leilei1, LI Yingxi1, ZHANG Peng2, WANG Tiegan2, WU Wei1,*, CHEN Haimin1,*

(1.Zhejiang Key Laboratory of Marine Bioengineering/Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture/State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products,Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2.Zhejiang Mariculture Research Institute, Wenzhou 325005, China)

Abstract: Carrageenan is a common food additive, but its effect on changing the structure of gut microbiota was questioned. In this study, the C57BL/6 mice were given three dosages of λ-carrageenan, including low, medium and high dose (1.7, 8.3, 41.7 mg/kg) for 12 weeks. The effects of λ-carrageenan on glucose metabolism and gut microbiota in mice were investigated by glucose tolerance test, insulin tolerance test and gut microbiota 16S rDNA sequencing. And the role of gut microbiota in the effect of λ-carrageenan on glucose metabolism in mice was verified by fecal bacteria transplantation experiments. The results showed that intake of different dose λ-carrageenan could cause the symptoms of metabolic disorders in mice, such as decreased body weight gain, elevated fasting blood glucose and insulin resistance. By the analysis of gut microbiota composition, it was found that λ-carrageenan could significantly affect the abundance and structure of gut microbiota. At the phylum level, λ-carrageenan increased the relative abundance of the Firmicutes and reduced the relative abundance of Bacteroidota. At the genus level, the abundance of Bacteroidales_S24-7_group_norankwas reduced, which regulated blood glucose. The abundance of Lactobacillusand Lachnospirarelated to lipid metabolism and weight loss was increased by λ-carrageenan administration. And it significantly increased abundance of Akkermansia, which is related to the degradation of the intestinal mucus layer. In addition, the results of fecal bacteria transplantation showed that the metabolic disorders appeared in fecal transplant mice were consistent with those of λ-carrageenan gavage mice. The results showed that intake of λ-carrageenan, especially high doses of λ-carrageenan, induced metabolic disorders in mice by interfering with the composition of the gut microbiota.

Keywords: λ-carrageenan; gut microbiota; fecal bacteria transplantation; glucose tolerance; insulin resistance

中图分类号: TS202.3

文献标志码: A

doi:10.12301/spxb202200595

文章编号:2095-6002(2023)02-0092-12

引用格式:翟雷雷,李颖曦,张鹏, 等. λ-卡拉胶诱导的肠道菌群紊乱对小鼠糖代谢的影响[J]. 食品科学技术学报,2023,41(2):92-103.

ZHAI Leilei, LI Yingxi, ZHANG Peng, et al. Influence of λ-carrageenan induced gut microbiota disorder on glucose metabolism of mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(2):92-103.

收稿日期: 2022-06-03

基金项目: 国家重大专项(2018YFD0900305;2018YFD0901103);国家自然科学基金资助项目(31772871;31872540);浙江省重大科技专项(2021C02069- 9);浙江省自然科学基金资助项目(LQ20D060001;LY22C190002);宁波市现代种业科技创新重大专项(2021Z004;2021Z104);宁波市公益科技项目(202002N3171);宁波市科技项目(2021S063)。

Foundation: National Key R&D Program of China (2018YFD0900305;2018YFD0901103); National Natural Science Foundation of China (31772871;31872540); Major Scientific and Technological Project of Zhejiang Province (2021C02069-9); Zhejiang Province Nature Science Foundation of China (LQ20D060001;LY22C190002); Major Scientific and Technological Project of Ningbo (2021Z004;2021Z104); Public-Benefit Foundation of Ningbo (202002N3171); Scientific and Technological Project of Ningbo (2021S063).

第一作者: 翟雷雷,男,硕士研究生,研究方向为海洋药理。

*通信作者:

吴 玮,男,讲师,博士,主要从事藻类活性物质开发和药理学方面的研究。

陈海敏,女,教授,博士,主要从事藻类生理和生化方面的研究。

(责任编辑:郝一铭)