藏羊(Tibetan sheep)，主要分布于我国西藏、青海和甘南，据统计，我国现有藏羊3 000多万只[1]。藏羊肉具有“高蛋白、低脂肪”的优点[2]，但随宰后贮藏时间的延长，藏羊肉风味和营养价值会随脂肪氧化而严重损失，使肉表面褪色，可接受性变差。肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)羰基和羧基化与蛋白功能受损密切相关[3]，导致肉品质构和风味劣变。虽然冷藏条件下，微生物以及酶活性受到抑制，但仍会发生脂肪和蛋白质氧化，进而影响肉品品质，这不仅影响肉品企业的经济效益，同时对消费者的健康也会产生不良的影响。

孜然精油、肉桂精油、花椒精油均为GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》允许使用的食用香料，主要成分有肉桂醛、丁子香酚、枯茗醛、β-丁香烯、乙酰丁香酚等，具有良好的抑菌抗氧化效果[4-8]。Mexis等[9]研究表明，采用精油保鲜的方法，在4 ℃下对虹鳟鱼进行保鲜，发现复配溶液能有效延长虹鳟鱼的货架期；Mendel等[10]指出，丁子香花油和月桂叶油等6种精油对大肠杆菌、肠沙门氏菌等致病菌均有较强的抑制作用；张旭等[11]发现，芥末、肉桂和丁香等几种植物提取的精油均能明显防止大米发霉，其中芥末精油的效果最好；夏秀芳[12]以冷却肉为实验材料，研究发现肉桂、丁香、迷迭香3种天然香辛料对冷却肉具有良好的保鲜效果；吴周和等[13]以酱油为材料，发现香辛料精油用于酱油防腐可取代苯甲酸，存放两个月后检测卫生指标全部合格。

目前复配香辛料精油处理对冷藏过程中藏羊肉脂质氧化和蛋白质氧化影响尚未见报道。本研究拟探究孜然精油、花椒精油和肉桂精油复配在真空状态下对冷藏过程中藏羊肉脂质和蛋白氧化的影响，希望为延长藏羊肉的贮藏时间，同时减少贮藏损失提供一种合理可行的方法，并为藏羊肉贮藏保鲜方法的深入研究提供有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

藏羊肉采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲县欧拉乡，为藏绵羊的后腿肉，经检验检疫合格；香辛料(花椒、肉桂、孜然)购于西安百味福食品有限公司，经安全性评价合格。

将花椒、肉桂、孜然依次用粉碎机粉碎，过40目筛备用。称取香辛料粉末200 g，置于3 000 mL的圆底烧瓶中，加水2 000 mL，从微沸开始计时，恒温蒸馏4 h，得到精油；按照本课题组前期的体外抑菌实验和正交试验确定的优化复配精油比例：0.8%孜然精油、0.35%花椒精油、0.25%肉桂精油，将3种精油溶解于吐温80(TW- 80)(体积分数0.01%)中，制成复配香辛料精油备用。

宰后45 min内取下欧拉藏羊右后腿，立即放入-18 ℃冷库中冷却至中心温度低于4 ℃，用已消毒处理的刀具剔除肉表面脂肪和筋膜，并将其精确分割为20.000 g的肉块，随机分为3组，每组27块。第一组不做任何处理，做空白组；第二组用移液枪吸取0.5 mL TW- 80涂抹于藏羊肉表面，作为对照(CK)组；第三组用移液枪吸取0.5 mL复配香辛料精油涂抹于藏羊肉表面，作为处理组，然后在无菌环境下进行真空包装，置于4 ℃冷库中冷藏。分别在贮藏时间点0、3、6、9、12、15、18、21、24 d对羊肉取样，进行指标测定。

1.2 主要试剂

氯化钠、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、1,1,3,3,-四乙氧基丙烷、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、可溶性淀粉、硫代硫酸钠、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、亚硫酸钠、异硫氰酸胍、甘氨酸、EDTA、氢氧化钠、硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)、酒石酸钾钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴酚蓝、十二烷基硫酸钠(SDS)均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

HHS- 4型电热恒温水浴锅，西安科昊生物工程有限责任公司；FSH- 2A型可调高速匀浆机，江苏省常州市金坛友联仪器研究所；HX202T型电子天平，慈溪市天东衡器厂；雷磁PHS- 25型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TGL- 16MC型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪集团；SP- 756P型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；镀铝阴阳真空袋，深圳市妙洁日用品有限公司；真空包装机、水蒸气蒸馏提取装置。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪氧化指标的测定

1.4.1.1 过氧化值的测定

过氧化值(POV)参考GB/T 5009.227—2016 《食品中过氧化值的测定》中的滴定法进行测定[14]。

1.4.1.2 TBA含量的测定

参考Pikul等[15]的方法，并做适当修改。以TBA反应物丙二醛(MDA)含量来反映样品中脂质氧化的程度(硫代巴比妥酸值，thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)，在532 nm处读取吸光值。使用标准曲线y=1.421 3x+0.009 7，R2=0.996 9计算MDA浓度，TBARS值表示为单位质量(kg)肉中MDA质量(mg)，计算公式见式(1)。

TBARS=(C×V×1 000)/(m0×1 000)。

(1)

式(1)中，C为从标准系列曲线中得到的试样溶液中MDA的质量浓度，μg/mL；V为试样溶液定容体积，mL；m0为试样质量，g。

1.4.2 蛋白质氧化指标的测定

1.4.2.1 MP的提取

参照Goll等[16]的方法并稍做修改。称取2 g肉样，加40 mL标准盐溶液(20 mmol·L-1磷酸钾缓冲液，0.1 mol·L-1KCl，2 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸EGTA，pH值6.8)，13 000 r·min-1匀浆10 s，4 ℃离心10 min(4 300 r/min)，弃上清液。沉淀用32 mL标准盐溶液溶解后，4 ℃离心10 min(4 300 r/min)，弃上清液，重复两次。沉淀用32 mL 100 mmol·L-1KCl溶液溶解后，4 ℃离心10 min(4 300 r/min)，弃上清液，重复两次。沉淀中加8 mL 100 mmol·L-1KCl溶液，溶解后采用双缩脲法测定蛋白，以吸光值为横坐标，以牛血清白蛋白质量浓度(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，标准方程见式(2)。

y=0.061 3x+0.000 6 (R2=0.999 7)。

(2)

1.4.2.2 羰基含量的测定

依据Levine等[17]的方法，略做修改。用100 mmol·L-1KCl溶液将MP质量浓度调整为5 mg/mL，分别取0.5 mL MP溶液分装至两个10 mL塑料离心管，其中一份加2 mL 2 mol·L-1 HCl溶液(对照)，另一份加2 mL含体积分数为0.2% 2，4-二硝基苯肼(DNPH)的2 mol·L-1 HCl溶液，室温下避光反应1 h(每10 min旋涡振荡一次)。分别添加2 mL体积分数为20%的三氯乙酸沉淀蛋白，10 000 r/min离心5 min，弃清液。沉淀用2 mL体积比为1∶1的乙酸乙酯与乙醇清洗，重复3次。待沉淀中试剂挥发完后，分别加3 mL 6 mol·L-1盐酸胍(含20 mmol·L-1磷酸钾，pH值6.5)溶液，置于37 ℃下水浴保温30 min溶解沉淀。将反应液以10 000 r/min离心5 min，除去不溶物质，在370 nm处测定上清液吸光度，比色光径1 cm。摩尔消光系数为22 000 g·mol-1·cm-1，代入式(3)，计算羰基含量。

羰基含量

(3)

式(3)中，羰基含量(以每毫克蛋白质计)，nmol/mg；A，溶液吸光度；ε，摩尔消光系数。

1.4.2.3 总巯基含量的测定

巯基按照Liu等 [18]的方法进行测定。将提取的MP分散在25 mmol/L磷酸钠缓冲液中(pH值6.25)，调整蛋白质量浓度为2 mg/mL。取 0.5 mL稀释后的MP溶液依次加入2 mL尿素-十二烷基硫酸钠溶液(含 8.0 mol/L 尿素， 30 g/L SDS， 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液， pH值7.4)和 0.5 mL 10 mmol/L DTNB 试剂(溶解在 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液中，pH值7.4)，在室温下反应15 min，取上清液在412 nm下测定吸光值A。以0.5 mL 25 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH值6.25)代替蛋白液用于空白对照。摩尔吸光系数为13 600 g·mol-1·cm-1，代入式(4)，计算总巯基含量。

总巯基含量

(4)

式(4)中，总巯基含量(以每毫克蛋白质计)，nmol/mg。

1.4.2.4 二硫键含量的测定

参考Thannhauser等[19]的方法，并做适当修改。将提取的MP分散在25 mmol/L磷酸钠缓冲液中(pH值6.25)，调整蛋白质量浓度为5 mg/mL。取100 μL稀释后的蛋白液与3 mL新鲜配制的2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸盐溶液混合，在室温避光反应25 min，然后在412 nm下测定吸光值A。以100 μL 25 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH值6.25)作为空白。摩尔消光系数为13 600 g·mol-1·cm-1，代入式(5)，计算二硫键含量。

二硫键含量

(5)

式(5)中，二硫键含量(以每毫克蛋白质计)，nmoL/mg。

1.4.2.5 表面疏水性的测定

根据文献[20-21]的方法，并做适当调整。将提取的MP溶解于20 mmol·L-1磷酸钠缓冲液中(pH值6.0)，调整蛋白质量浓度为1 mg/mL。取2 mL稀释后的MP溶液加入80 μL的溴酚蓝(1 mg/mL)混匀，室温下搅拌10 min，4 000 r·min-1离心15 min。取离心后的上清液(稀释10倍后)在595 nm下测定吸收值A。溴酚蓝空白样是用2 mL pH值为6.0、20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液，加80 μL溴酚蓝。表面疏水性计算公式见式(6)，计算溴酚蓝结合疏水性残基的量。

m(溴酚蓝)=80 μg×(A空白-A样品)/A空白 。

(6)

1.5 数据分析

采用Excel 2013对数据进行处理并绘图；使用SPSS 19.0软件进行数据分析；采用LSD法和Duncan法进行方差分析，显著水平P=0.05。

2 结果与分析

2.1 脂肪氧化指标分析

2.1.1 冷藏过程中TBA含量变化规律

冷藏过程中的TBA含量变化见图1。由图1可知，贮藏期间藏羊肉TBA值总体呈上升趋势。贮藏0～6 d，3组TBA值均上升缓慢，分别增加了70.59%、70.00%、10.00%；贮藏9～15 d，空白组和CK组的TBA值分别快速增加了56.03%、56.52%，处理组增加了46.15%；贮藏18～24 d，空白组和CK组的TBA值分别增加了10.29%、8.15%，处理组增加了19.79%。由此可知，藏羊肉贮藏中期脂肪氧化速率比前期和后期快。15 d后，空白组和CK组TBA值均大于国标规定值1.00 mg/kg(分别为1.16 mg/kg、1.15 mg/kg)，表明藏羊肉氧化严重，无法食用；而贮藏至24 d时，处理组TBA值才达到了0.96 mg/kg。实验结果表明，空白组和CK组间无显著性差异，二者与处理组相比均差异显著(P<0.05)，说明TW- 80的加入对试验结果无影响，复配香辛料精油可以有效减缓贮藏过程中藏羊肉的脂肪氧化速率。

2.1.2 冷藏过程中POV值变化规律

POV是油脂初级氧化的一个常用指标，反映初级氧化产物氢过氧化物积累量的多少。POV越大，说明氢过氧化物的积累量越多[21]。冷藏过程中的POV变化见图2。由图2可知，整个贮藏过程中藏羊肉POV总体呈上升趋势。贮藏0～12 d，空白、CK和处理组POV分别增加了61.82%、60.42%和48.78%；贮藏15～24 d，空白组和CK组的POV分别快速增加了43.27%、44.00%，处理组增加了37.80%。由此可知：空白组和CK组之间无显著性差异，二者与处理组间均呈显著差异(P<0.05)；贮藏后期脂质过氧化速率低于贮藏前期，说明贮藏后期过氧化物分解速度加快，亦或后期过氧化物的分解速率大于脂肪过氧化速率，POV增加缓慢。实验结果表明，复配香辛料精油的加入有助于延缓藏羊肉脂肪的氧化分解，进而减少过氧化物的产生。

2.2 蛋白氧化指标分析

2.2.1 冷藏过程中羰基含量变化规律

羰基是蛋白质发生氧化的标志性产物[22]，冷藏过程中的羰基变化见图3。由图3可知，羰基含量随贮藏时间的延长显著上升(P<0.05)。羰基含量的逐渐增多可能是由于贮藏过程中藏羊肉肌肉组织中各生化反应逐渐发生，导致部分肽链骨架断裂成氨基酸，侧链上带有NH-和NH2-的氨基酸又易被羟自由基氧化形成NH3+和相应的羰基，致使羰基含量增加[23]。贮藏0～9 d过程中，处理组的氧化速率大于其他两组氧化速率，12 d之后，空白组和CK组的氧化速率显著高于处理组(P<0.05)，这可能是后期复配香辛料精油有效减缓了羰基氧化。原料肉羰基含量为4.07 nmol/mg，贮藏15 d时：空白组羰基含量为14.09 nmol/mg，升高了10.02 nmol/mg，CK组羰基含量为14.18 nmol/mg，升高了10.11 nmol/mg，两组之间没有显著性差异(P<0.05)，说明TW- 80作为溶剂加入对藏羊肉的羰基含量基本没有影响；处理组羰基含量为11.89 nmol/mg，升高了7.82 nmol/mg，与前两者相比差异显著(P<0.05)，说明复配香辛料精油的加入有效减缓了藏羊肉MP羰基的氧化。鲁小川等[24]研究了不同浓度的鼠尾草提取物对鲢鱼MP功能特性的影响时指出，鼠尾草提取物对冷藏鲢鱼肌原纤维蛋白的氧化具有显著的抑制作用，这与本实验结果相似。

2.2.2 冷藏过程中巯基和二硫键含量变化规律

MP巯基容易氧化损失，氧化程度越高，巯基含量越低[22]，冷藏过程中的巯基变化见图4。由图4可知，在整个贮藏过程中藏羊肉巯基含量总体呈下降趋势。贮藏15 d时：空白组巯基含量为43.82 nmol/mg，降低了51.62 nmol/mg，CK组巯基含量为43.75 nmol/mg，降低了51.54 nmol/mg，两组之间没有显著性差异(P<0.05)，说明TW- 80作为溶剂加入对藏羊肉的巯基含量基本没有影响；处理组巯基含量为63.01 nmol/mg，降低了31.99 nmol/mg，与前两者相比差异极显著(P<0.01)，说明复配香辛料精油的加入有效减缓了藏羊肉MP巯基的氧化，其抗氧化机理可能与其自身含有的酚类物质有关。这与贾娜等[25]研究没食子酸对猪肉糜脂肪和蛋白氧化的抑制作用及其对肉糜品质特性的影响结果类似。

由于MP含有较多的自由巯基，容易被氧化而转化为分子内或分子间二硫键，这是氧化过程中MP发生聚合的主要途径[22]，图5表示藏羊肉在贮藏过程中二硫键含量变化情况。在整个贮藏过程中，藏羊肉二硫键含量逐渐增加，贮藏15 d时：空白组二硫键含量为22.91 nmol/mg，升高了18.00 nmol/mg，CK组二硫键含量为22.88 nmol/mg，升高了17.97 nmol/mg，两组之间无显著性差异(P<0.05)，说明TW- 80作为溶剂加入对藏羊肉的二硫键含量基本没有影响；处理组二硫键含量为15.59 nmol/mg，降低了10.68 nmol/mg，与前两者相比差异极显著(P<0.01)，说明复配香辛料精油的加入可有效减缓了藏羊肉二硫键的生成，验证了总巯基的变化结果。

2.2.3 冷藏过程中表面疏水性变化规律

蛋白质的表面疏水性可用来衡量蛋白质的变性程度[22]。冷藏过程中的表面疏水性变化见图6。由图6可见，藏羊肉贮藏过程中，表面疏水性呈先增加后下降的趋势，这是由于蛋白质氧化后，蛋白质分子发生折叠和肽键断裂，改变了蛋白质分子的构象，蛋白质分子内部的疏水性集团暴露，使其表面疏水性增强[26]；而蛋白质分子聚集或交联则使其表面疏水性降低[27]。采用真空包装处理的羊肉肌原纤维蛋白在贮藏0 d时，空白组的表面疏水性为13.33 ug、CK组为13.60 ug；贮藏0～15 d，表面疏水性显著增加(P<0.05)，15 d时达到最大；24 d时，两组表面疏水性分别降为18.28、17.92 ug。两组间无显著性差异(P>0.05)，说明TW- 80作为溶剂加入对藏羊肉的表面疏水性基本没有影响。在贮藏0 d时，处理组表面疏水性为13.43 ug，0～18 d显著增加(P<0.05)，18 d时达到最大，至24 d时，表面疏水性降为19.94 ug。与前两组相比，处理组差异显著(P<0.05)，并且推迟了表面疏水性最大值出现的时间，可能是因为贮藏过程中，复配香辛料精油能够减少疏水性氨基酸残基的暴露，降低表面疏水性的增加程度[28]。实验结果表明，复配香辛料精油的加入可有效抑制藏羊肉蛋白质的变性。

2.3 各指标相关性分析

对藏羊肉贮藏过程中各指标进行相关性分析，结果如表1。由表1可知：随贮藏时间的延长，空白组和CK组肉样TBA含量、POV、羰基含量和二硫键含量各指标间均呈极显著正相关(P<0.01)，TBA含量、POV、羰基含量和二硫键含量均与总巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)；而两组表面疏水性均与POV和二硫键含量之间相关性不显著，与羰基含量相关性显著(P<0.05)，与总巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)。

*表示相关性显著(P<0.05)，**表示相关性极显著(P<0.01)。

随贮藏时间的延长，处理组肉样TBA含量、POV、羰基含量、二硫键含量和表面疏水性各指标间均呈极显著正相关(P<0.01)，TBA含量、POV、羰基含量、二硫键含量和表面疏水性均与总巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)。处理组表面疏水性与POV和二硫键含量均呈极显著正相关(P<0.01)，与羰基含量相关性极显著(P<0.01)，与总巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)。与空白组和CK组相比，处理组各指标间相关性显著增加。

分析结果表明，复配香辛料精油的使用，在很大程度上提高了各个指标间的相关性，其中最显著的是表面疏水性与各指标间的相关性。今后的研究中，我们可以表面疏水性作为指示因子研究MP氧化的机理。

3 结 论

1) 复配香辛料精油具有抗MP氧化的能力。复配精油处理有效抑制了贮藏过程中藏羊肉MP巯基氧化损失，从而减缓了MP二硫键的产生；同时有效抑制了MP中侧链上带有NH-和NH2-的氨基酸的氧化，减缓了羰基含量的增加。

2) 复配香辛料精油具有抗MP变性的能力。复配精油处理有效减缓了贮藏过程中藏羊肉MP表面疏水性的上升速率，明显提高了表面疏水性与各个指标间的相关性。

3) 复配香辛料精油具有抗藏羊肉脂质氧化的能力。复配精油处理有效减缓贮藏过程中藏羊肉的脂肪氧化速率，并有助于延缓藏羊肉脂肪的氧化分解，进而减少过氧化物的产生。

4) 经过各指标相关性分析可以得出，复配香辛料精油处理后各指标相关性明显增加。复配香辛料精油良好的抗氧化效果使得其具有较高的开发应用前景，可推广为继壳聚糖、茶多酚之后的又一天然抗氧化剂。

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Effect of Compound Spice Essential Oil on Oxidation Characteristics of Tibetan Mutton During Refrigeration

XU Honyan,ZHANG Zhen*,CHEN Xueqin,WANG Xueqi,FEI Yingying,LI Xiaoye

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract： To explore an effective anti-oxidation method of chilled mutton myofibrillar protein (MP) and lipid. The compound essential oil with a volume fraction of 0.8% cumin essential oil, 0.35% pepper oil, 0.25% cinnamon, and 98.6% TW-80 was applied to Tibetan mutton. MP and lipid oxidation was detected during vacuum storing at 4 ℃. With the extension of refrigerating time, the carbonyl content, sulfhydryl content, surface hydrophobicity, thiobarbituric acid (TBA) value and peroxide value (POV) of blank, CK and treatment groups were gradually increased. The disulfide bond was gradually decreased. However, the increasing rate in the treatment group was slower than those in the blank and CK groups. The TBA values in the blank group (1.16 mg/kg) and the CK group (1.15 mg/kg) after 15 d storage were greater than the national standard value of 1.00 mg/kg, while the TBA value in the treatment group reached 0.96 mg/kg until storage for 24 days. Compared with the blank and CK groups, the compound essential oil treatment improved the correlation between the surface hydrophobicity of Tibetan mutton MP and other various indexes, significantly inhibited the oxidation of Tibetan mutton MP, and attenuated the lipid oxidation rate of Tibetan mutton to some extent. It indicated that the combination of essential oil treatment under vacuum packaging method could prolong the storage period of Tibetan mutton for 9 days, and provided an effective theoretical basis for the in-depth study of Tibetan mutton storage and preservation methods.

Keywords： compound spice essential oil; Tibetan mutton; myofibrillar protein; protein oxidation; lipid oxidation

中图分类号： TS251.5

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.02.012

文章编号：2095-6002(2020)02-0090-09

引用格式：徐红艳，张珍，陈雪琴，等. 复配香辛料精油处理对冷藏藏羊肉氧化特性的影响[J]. 食品科学技术学报，2020,38(2):90-98.

XU Honyan, ZHANG Zhen, CHEN Xueqin, et al. Effect of compound spice essential oil on oxidation characteristics of tibetan mutton during refrigeration[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(2):90-98.

收稿日期： 2019-06-29

基金项目： 中国- 马来西亚清真食品及相关产业国际创新合作项目(1504WKCA094)； 甘肃省高等学校创新能力提升项目(2019B- 077)； 中国- 马来西亚在清真食品生物科技、检测及标准体系的合作研究项目(17YF1WA166)； 科技部援助项目(KY201501005)； 甘肃省财政厅高校基本业务项目(1011JKCA179)； 甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSW- 2013- 22)； 甘肃省科技计划资助项目(17YF1WA166)。

第一作者： 徐红艳，女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工。

*通信作者： 张 珍，女，副教授，博士，主要从事农畜产品加工方面的研究。

(责任编辑：叶红波)