菠萝蛋白酶是存在于菠萝中的一种蛋白水解酶，可以对氨基酸残基之间的肽键进行水解。菠萝蛋白酶在蛋白质多肽制备、肉类嫩化等领域有重要应用，在消炎、抗水肿，促进抗生素药物的吸收，预防血小板聚集等方面都被证实具有明显作用[1]。菠萝蛋白酶作为生物活性物质发挥作用时，很容易受外界环境影响[2]，因此，增强酶的储存和操作稳定性是其实际应用的一个重要因素。和游离酶相比，固定化酶具有稳定性好、易回收、可重复利用等优点 [3]。固定化效果的好坏很大程度上取决于载体材料的选择，因此选择一种合适的固定化酶载体尤为重要[4]。纤维素作为一种天然高分子材料，来源丰富、成本低，但由于纤维素在普通溶剂中的难溶解性[5]，将纤维素作为固定化酶载体的研究较少报道。将纤维素在离子液体中溶解并改性不仅能形成水凝胶的三维网络空间结构，还能赋予纤维素更多的与酶分子结合的功能基团，使其成为理想的固定化酶载体[6-7]；同时，作为一种废弃资源的利用，将菠萝皮渣纤维素(pineapple peel cellulose，PPC)作为酶的固定化载体，也具有重要的意义。本实验拟将菠萝皮渣纤维素在离子液体中溶解并用L-丝氨酸改性，改性产物用来固定化菠萝蛋白酶，并对固定化工艺和酶学特性进行研究，希望得到一种良好的固定化酶载体。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠萝皮渣，广州市场收集；离子液体[Bmim]Cl，中科院兰州化学物理研究所；菠萝蛋白酶(300 U/mg，CAS:8002-43-5)，上海麦克林生化有限科技公司；L-丝氨酸、氢氧化钠、氯乙酸钠、乙酸、戊二醛、L-半胱氨酸和EDTA·2Na、酪蛋白、三氯乙酸，以上试剂皆为化学纯或分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA12MCW型精密分析天平，赛多利斯仪器有限公司；DF- 101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，广州市星烁仪器有限公司； UV- 1800型紫外/可见分光光度计，日本岛津公司；JW- 3021HR型高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；VECTOR33型傅里变换叶红外光谱仪，德国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菠萝皮渣纤维素的提取

采用Dai等[8]的方法从菠萝皮渣中提取纤维素。将菠萝皮渣榨汁，得到的残渣用清水冲洗后于50 ℃烘箱中干燥，粉碎后过80目筛，得到菠萝皮渣原纤维。称取一定量菠萝皮渣原纤维，加入蒸馏水(料液比为1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴锅中搅拌2.0 h，过滤，滤渣中加入质量浓度为75 mg/mL的亚氯酸钠溶液(pH值3.8～4.0)(料液比1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴锅中反应5.0 h以除去木质素。将混合物过滤，用蒸馏水冲洗至滤渣为纯净的白色。向滤渣中加入10%氢氧化钠溶液(料液比1∶15)，室温下搅拌处理10.0 h，除去半纤维素和其他杂质，过滤。用蒸馏水洗涤至中性，然后用95%乙醇洗涤，冷冻干燥即得PPC，过100目筛备用。

1.3.2 L-丝氨酸改性菠萝皮渣纤维素的制备

称取10.0 g离子液体[Bmim]Cl于试管中，在110 ℃磁力搅拌油浴锅中溶解。另称取一定量提取的PPC添加到溶解的离子液体[Bmim]Cl中，110 ℃磁力搅拌5.0 h，充分溶解PPC。调节温度为80 ℃，加入一定质量的L-丝氨酸，继续磁力搅拌2.0 h。PPC上被活化的羟基与L-丝氨酸发生反应，将氨基接枝到PPC上。反应结束后，用蒸馏水充分浸泡以置换出离子液体[Bmim]Cl，得到L-丝氨酸改性菠萝皮渣纤维素(modified pineapple peel cellulose，MPPC)。将样品冷冻干燥后粉碎，过60目筛，备用。

1.3.3 改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶的制备

称取得到的MPPC粉末20 mg于试管中，加入4 mL菠萝蛋白酶溶液(用pH值为7.0的磷酸缓冲溶液配制，离心去除不溶物，调节菠萝蛋白酶质量浓度为1 mg/mL)。参考Isobe等[9]的方法，将混合物震荡24.0 h，通过改性纤维素的功能基团与菠萝蛋白酶分子之间的化学吸附，以及改性纤维素三维网络结构对菠萝蛋白酶分子的物理吸附来吸附菠萝蛋白酶，吸附完成后离心。将下层沉淀置于4 mL戊二醛溶液中进一步交联一段时间，再次离心后用蒸馏水清洗数次，得到改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶(modified pineapple peel cellulose immobilized bromelain，MPPC-Br)，冷冻干燥备用。

1.3.4 固定化菠萝蛋白酶制备条件优化

分别研究了PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比、L-丝氨酸与PPC的质量比、戊二醛溶液体积分数以及交联时间对固定化菠萝蛋白酶活性的影响。固定L-丝氨酸与PPC的质量比为1∶1、戊二醛溶液体积分数为1%、交联时间为1.0 h，考察不同PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比对固定化菠萝蛋白酶活性的影响；固定PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3∶100、戊二醛溶液体积分数为1%、交联时间为1.0 h，考察不同L-丝氨酸与PPC的质量比对固定化菠萝蛋白酶活性的影响；固定PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3∶100、L-丝氨酸与PPC的质量比为1∶1、交联时间为1.0 h，考察不同戊二醛溶液体积分数对固定化菠萝蛋白酶活性的影响；固定PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3∶100、L-丝氨酸与PPC的质量比为1∶1、戊二醛溶液体积分数为1%，考察不同交联时间对固定化菠萝蛋白酶活性的影响。

1.3.5 菠萝蛋白酶活力的测定

菠萝蛋白酶活性的测定[10]：取1 mL酶液，置于37.2 ℃水浴中预热10 min，加入同样在37.2 ℃预热的酪蛋白溶液2 mL(质量浓度为2 mg/mL，用0.2 mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液配制)，混合摇匀后准确反应10 min，加入体积分数为10%的三氯乙酸溶液3 mL终止反应，将混合物保温10 min后，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液，测定其在275 nm波长下的吸光度。对照组是取1 mL酶液，在37.2 ℃水浴中预热10 min后，先加入3 mL体积分数为10%的三氯乙酸溶液，反应10 min；再加入2 mL酪蛋白溶液，保温10 min。在8 000 r/min下离心10 min，取上清液，测定其在275 nm波长下的吸光度。MPPC-Br的活力测定，是将20 mg MPPC-Br浸入1 mL 0.2 mol/L pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中，其余步骤相同。菠萝蛋白酶活性定义为：1 g(干重)固定化酶或1 mL酶液在上述条件下水解酪蛋白，每分钟产生1 μg酪氨酸，即为一个酶活力单位，表示为U。

1.3.6 结构表征与分析

1.3.6.1 红外光谱分析

对PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC-Br进行红外光谱分析。测定条件为：在4 000～500 cm-1的频率范围内以4 cm-1的分辨率进行FT-IR测量。

1.3.6.2 热稳定性分析

通过热分析仪(TGA)对PPC、MPPC及MPPC-Br进行热稳定性分析。测定条件为：在N2氛围下以10 ℃/min的加热速率从室温升温至500 ℃。

1.3.6.3 X射线衍射分析

采用X射线衍射仪对PPC、MPPC及MPPC-Br进行XRD测试，测试条件为：衍射角2θ为4°～ 40°，扫描速度设定为2°/min，管压和管流分别设置为40 kV和40 mA。

2 结果与分析

2.1 PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC-Br的表征结果

2.1.1 PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC-Br的结构分析

图2 PPC、MPPC和MPPC-Br的TG 和DTG的分析结果
Fig.2 Results of TG and DTG analysis of PPC, MPPC and MPPC-Br

图1是PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC-Br的红外光谱图。可以看到，PPC在3 387 cm-1处有吸收峰，属于O—H吸收峰；在2 900、1 428 cm-1和1 052 cm-1有吸收峰，分别属于C—H伸缩振动吸收峰、C—H弯曲振动吸收峰和纤维素糖苷键C—O—C吡喃糖环的伸缩骨架振动吸收峰，这些都属于天然纤维素的典型吸收峰[11-13]。用L-丝氨酸在离子液体[Bmim]Cl中改性PPC后，发现在1 640 cm-1处的吸收峰明显增强，这是属于—OC吸收峰，说明PPC在离子液体[Bmim]Cl中被L-丝氨酸成功改性[11]。将菠萝蛋白酶固定化在改性菠萝皮渣纤维素上后，在1 550 cm-1处出现新的吸收峰，表明菠萝蛋白酶成功地固定在MPPC上[14]。

图1 PPC、MPPC、MPPC-Br及菠萝蛋白酶的红外光谱
Fig.1 FT-IR spectra of PPC, MPPC,MPPC-Br and bromelain

2.1.2 PPC、MPPC及MPPC-Br的热重分析结果

图2为PPC、MPPC及MPPC-Br的热重分析图。3种物质的热分解过程都可以分为两个阶段，第一阶段发生在50～80 ℃附近，是由于样品中的水分蒸发导致的质量损失；第二阶段是样品的热降解过程，PPC的失重峰值出现在355 ℃附近，MPPC的峰值出现在308 ℃附近，而MPPC-Br的峰值出现在345 ℃附近。另外，当温度到达500 ℃时，PPC的残留质量为19.77%，MPPC的残留质量为18.00%，MPPC-Br的残留质量为23.70%。说明PPC经改性后纤维素分子结构发生了变化，热稳定性降低[15]，用戊二醛将菠萝蛋白酶分子交联到MPPC上后热稳定性又有所上升。

2.1.3 PPC、MPPC以及MPPC-Br的XRD分析结果

图3是PPC、MPPC和MPPC-Br的X衍射图谱。PPC在2θ为22.2°处有一个很强的吸收峰，在2θ为15.7°和2θ为34.6°处分别有一个较弱的吸收峰，这些都属于典型的天然纤维素Ⅰ型结构的特征衍射峰[16]。将PPC在离子液体[Bmim]Cl中用L-丝氨酸改性后，在2θ为15.7°和2θ为22.2°处的衍射峰向左偏移，且强度减小，在2θ为34.6°处的衍射峰已经完全消失。这些结果表明，改性后的菠萝皮渣纤维素晶体结构从纤维素Ⅰ型转变为纤维素Ⅱ型，而纤维素Ⅱ型的晶体结构没有纤维素Ⅰ型稳定，在离子液体中溶解后，结构松散，有利于与氨基酸的接枝共聚反应[17]。另外，MPPC-Br与MPPC比较，其衍射峰没有明显变化。

图3 PPC、MPPC及MPPC-Br的衍射图谱
Fig.3 XRD patterns of PPC, MPPC and MPPC-Br

2.2 菠萝蛋白酶固定化条件的优化结果

2.2.1 PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比对固定化酶活性的影响

PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比对固定化酶活性的影响，实验结果如图4。图4中，当PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为1∶100，此时相对酶活性只有69.6%，这可能是因为MPPC含量太少，形成的凝胶结构不紧密，不能很好地与酶分子结合。随着PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比增加，相对酶活性显著增加，当PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3∶100时，此时相对酶活性达到最大，为100%。继续增加PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比，相对酶活性略有减小，这可能是因为在此PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比值下，溶解的MPPC分子中，与酶的结合位点都得到了充分利用，因此选择PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3∶100。

图4 PPC与离子液体的质量比对固定化酶活性的影响
Fig.4 Effect of mass ratio of PPC to ionic liquid on activity of immobilized enzyme

2.2.2 L-丝氨酸与PPC质量比对固定化酶活性的影响

图5 L-丝氨酸与PPC质量比对固定化酶活性的影响
Fig.5 Effect of mass ratio of L-serine to PPC on activity of immobilized enzyme

L-丝氨酸与PPC质量比对固定化酶活性的影响，实验结果如图5。图5中，当L-丝氨酸与PPC质量比为1∶3时，相对酶活性为29.9%；随着L-丝氨酸与PPC质量比的增加，相对酶活性也显著增加，当L-丝氨酸与PPC质量比为1∶1时，相对酶活性达到最大，为100%，这是因为随着L-丝氨酸含量的增加，更多的L-丝氨酸接枝到PPC上，从而增加了与菠萝蛋白酶的结合位点，酶得以充分的固定化。继续增大L-丝氨酸与PPC质量比，相对酶活性不再提高，这可能是因为PPC上活化的羟基及其结合位点已全部饱和。因此选择L-丝氨酸与PPC质量比为1∶1。

2.2.3 戊二醛溶液体积分数对固定化酶活性的影响

戊二醛溶液体积分数对固定化酶活性的影响，实验结果如图6。图6中，随着戊二醛溶液体积分数的增加，相对酶活性呈现先增大后减小的趋势，这是因为低浓度的戊二醛的交联不够充分，而浓度过高则会导致酶分子本身的结构发生改变，从而影响了酶的活性。

图6 戊二醛体积分数对固定化酶活性的影响
Fig.6 Effect of glutaraldehyde volume fraction on activity of immobilized enzyme

图7 交联时间对固定化酶活性的影响
Fig.7 Effect of crosslinking time on activity of immobilized enzyme

2.2.4 交联时间对固定化酶活性的影响

交联时间对固定化酶活性的影响，实验结果如图7。图7中，随着交联时间的增加，固定化酶相对酶活性呈现先增大后减小的趋势。当交联时间小于1.0 h时，交联程度不够，不能很好地固定菠萝蛋白酶。但交联时间过长，菠萝蛋白酶与MPPC紧密结合，导致酶的活性位点不能很好地与底物分子结合，从而影响了酶的相对活性。因此选择交联时间为1.0 h比较合适。

2.3 MPPC-Br的特性分析

2.3.1 MPPC-Br的热稳定性

将MPPC-Br和游离酶分别在不同的温度环境下(40～80 ℃)放置2.0 h，研究温度对酶活性的影响，结果如图8。随着温度的升高，MPPC-Br在50 ℃时相对酶活性有所提升，这说明50 ℃是MPPC-Br的最适反应温度；继续升高温度，相对酶活性缓慢减小，但是到达80 ℃时，相对酶活性依然还有82.0%。而随着温度的升高，游离菠萝蛋白酶的相对酶活性急剧减小，50 ℃时就只剩下48.0%，80 ℃已基本检测不到活性，这说明MPPC-Br比游离酶具有更好的温度稳定性。这是因为菠萝蛋白酶和MPPC在形成水凝胶过程中，通过固定化形成了共价键或氢键，酶活性位点的空间结构发生了改变，MPPC-Br的热稳定性得以提高，同时水凝胶对酶分子也有一定的保护作用。

图8 MPPC-Br的热稳定性
Fig.8 Thermal stability of MPPC-Br

2.3.2 MPPC-Br的酸碱稳定性

分别将MPPC-Br和游离酶在不同pH值条件下放置24.0 h，测定其酶活性，结果如图9。图9中，pH值为2.0时，MPPC-Br的相对酶活性为80.6%，而游离酶的相对酶活性为55.8%；pH值小于4.0时，游离酶随着pH值的下降相对酶活性显著下降，而MPPC-Br相对酶活性变化不大，说明MPPC-Br比游离酶更耐酸性环境。MPPC-Br在pH值为4.0时稳定性最好，而游离酶在pH值为5.0时稳定性最好，说明MPPC-Br较游离酶最适反应pH值向酸性移动。

图9 MPPC-Br的酸碱稳定性
Fig.9 pH stability of MPPC-Br

3 结 论

本实验将PPC在离子液体中改性并用于固定化菠萝蛋白酶。所制备的MPPC-Br活性受PPC与离子液体的质量比、L-丝氨酸与PPC的质量比、戊二醛体积分数以及交联时间的影响。当PPC与离子液体的质量比为3∶100，L-丝氨酸与PPC的质量比为1∶1，戊二醛体积分数为1.0%，交联时间为1.0 h时，MPPC-Br的活性最高。在80 ℃环境下放置2.0 h后，MPPC-Br仍然具有82.0%的相对酶活，而游离菠萝蛋白酶在此条件下几乎失活，说明MPPC-Br具有更好的温度稳定性。MPPC-Br在pH为4.0时稳定性较好，而游离酶在pH为5.0时稳定性更好，说明MPPC-Br比游离酶更耐酸性环境。本实验以菠萝皮渣为原料，开发了一种新的固定化酶载体，对废弃资源的高值化利用具有重要意义。所制备的固定化菠萝蛋白酶具有较好的温度稳定性和酸环境稳定性，希望能为其他以纤维素为基础的固定化酶载体的开发提供理论参考。

参考文献：

[1] MAURER H R. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2001, 58(9):1234-1245.

[2] MUHAMMAD Z A, AHMAD T. Therapeutic uses of pineapple-extracted bromelain in surgical care: a review[J]. Journal of the Pakistan Medical Association, 2017, 67(1):121-125.

[3] KRAJEWSKA B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(2/3):126-139.

[4] KLIBANOV A M. Enzyme stabilization by immobilization[J]. Analytical Biochemistry, 1979, 93(1):1-25.

[5] EICHHORN S J, DUFRESNE A, ARANGUREN M, et al. Review: current international research into cellulose nanofibres and nanocomposites[J]. Journal of Materials Science, 2010, 45(1):1-33.

[6] FENG L, CHEN Z L. Research progress on dissolution and functional modification of cellulose in ionic liquids[J]. Journal of Molecular Liquids, 2008, 142(1):1-5.

[7] WU X , ZHAO F , VARCOE J R , et al. Direct electron transfer of glucose oxidase immobilized in an ionic liquid reconstituted cellulose-carbon nanotube matrix[J]. Bioelectrochemistry, 2009, 77(1):64-68.

[8] DAI H, HUANG H. Modified pineapple peel cellulose hydrogels embedded with sepia ink for effective removal of methylene blue[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 148:1-10.

[9] ISOBE N , LEE D S , KWON Y J , et al. Immobilization of protein on cellulose hydrogel[J]. Cellulose, 2011,18(5):1251-1256.

[10] 罗苏芹, 戴宏杰, 黄惠华. 海藻酸钠/菠萝皮渣纳米纤维素水凝胶球固定化风味蛋白酶的研究[J]. 食品科技, 2018, 322(8):269-275.

LUO S Q, DAI H J, HUANG H H. Study on immobilization of flavor protease by sodium alginate/pineapple peel nano-cellulose hydrogel ball[J]. Food Science and Technology, 2018, 322(8):269-275.

[11] 张玉丹. 菠萝皮渣纤维素的改性及应用于固定化脂肪酶的研究[D]. 湛江：广东海洋大学, 2012.

ZHANG Y D. Modification of cellulose from pineapple peel residue and its application to immobilization of lipase[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University, 2012.

[12] KLEMM D. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2005, 44(36):1-3.

[13] YANG H, YAN R, CHEN H, et al. Characteristics of hemicellulose, cellulose and lignin pyrolysis[J]. Fuel, 2007, 86(12/13):1781-1788.

[14] TALINGTAISONG S, VONGSETSKUL T, WEERAPHA P. Gauze-reinforced electrospun regenerated cellulose ultrafine fibers for immobilizing bromelain[J]. Cellulose, 2017, 24(7):2967-2975.

[15] SCHLUFTER K, DOM S, SCHMAUDER H P. Efficient homogeneous chemical modification of bacterial cellulose in the ionic liquid 1-n-buty-3-methylimidazolium chloride[J]. Macromolecular Rapid Communications, 2006, 27(19):1670-1676.

[16] 孟效轲, 赵鑫, 杨茗麟, 等. 基于离子液体体系制备纤维素水凝胶[J]. 当代化工研究, 2017(12):4-5.

MENG X K, ZHAO X, YANG M L, et al. Preparation of cellulose hydrogel based on ionic liquid system[J]. Contemporary Chemical Research, 2017(12):4-5.

[17] 顾俐慧, 李韵卒, 杨益琴, 等. BmimCl离子液体中纤维素- 聚己内酯的合成与表征[J]. 纤维素科学与技术, 2017(3):4-6.

GU L H, LI Y Z, YANG Y Q, et al. Synthesis and characterization of cellulose-polycaprolactone in BmimCl ionic liquids[J]. Cellulose Science and Technology, 2017(3):4-6.

Study on Immobilization of Bromelain by Modified Pineapple Peel Residue Cellulose

CHEN Hui, HUANG Huihua*

(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou 510000, China)

Abstract： In order to explore the feasibility of modified cellulose as immobilization enzyme carrier, the extracted pineapple peel residue cellulose was uniformly modified with L-serine in ionic liquid and used to immobilize bromelain. The pineapple peel residue cellulose, modified pineapple peel residue cellulose and the immobilized enzyme were compared and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, thermogravimetric analyzer and X-ray diffraction spectrum. The results showed that the pineapple peel residue cellulose was successfully modified, the crystal structure was changed from cellulose Ⅰ to cellulose Ⅱ. Bromelain was successfully immobilized on the modified pineapple peel residue cellulose, and the thermal stability of immobilized enzyme was higher than that of modified pineapple peel residue cellulose. The immobilization process and enzyme characteristics of the bromelain were studied. The results showed that the optimum preparation process of immobilized enzyme was that the mass ratio of pineapple peel residue cellulose to ionic liquid [Bmim] Cl was 3∶100, the mass ratio of L-serine to pineapple peel residue cellulose was 1∶1, the glutaraldehyde solution volume fraction was 1%, and the cross linking time was 1.0 h. Compared with free bromelain, immobilized bromelain had better temperature stability and acid environment stability.

Keywords： pineapple peel residue cellulose; ionic liquid; L-serine; bromelain; immobilization

中图分类号： TS209； Q814

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.02.008

文章编号：2095-6002(2020)02-0059-07

引用格式：陈辉， 黄惠华. 改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究[J]. 食品科学技术学报，2020,38(2):59-65.

CHEN Hui, HUANG Huihua. Study on immobilization of bromelain by modified pineapple peel residue cellulose[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(2):59-65.

收稿日期： 2019-05-15

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(31471673；31271978)。

第一作者： 陈 辉，男，硕士研究生，研究方向为农产品深加工及高值化利用。

*通信作者： 黄惠华，男，教授，博士生导师，主要从事农产品深加工及高值化利用方面的研究。

(责任编辑：叶红波)