微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的高分子化合物，具有易提取、生产不受季节影响、生产周期短等优势[1]。但其产量受多种因素的影响，不仅与自身的遗传性质有关，还容易受到菌体生长环境的影响，培养基的组成以及培养条件都会对多糖的产量产生影响[2]。因此，选择合适的培养条件至关重要。微生物EPS具有多种生物学活性。Sasikumar等[3]研究发现，Lactobacillus plantarum BR2产生的EPS具有DPPH自由基清除能力，对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。许女等[4]对干酪乳杆菌KW3 EPS进行抗氧化研究，体外研究结果显示，EPS具有DPPH自由基清除能力；体内实验结果显示，KW3胞外多糖可显著降低衰老小鼠血清、肝和脑组织中的MDA含量, 提高其SOD活性和GSH- Px活性。

甲基营养型芽孢杆菌广泛存在于自然界，具有重要的商业价值，目前对其代谢物的研究主要集中在蛋白酶、氨肽酶的培养条件优化、抗菌肽对罗非鱼片的保鲜效果等方面[5-7]，但对EPS的研究报道较少。

本研究针对一株从传统酒曲中分离筛选得到的高产EPS的菌株GSBm- 1，16S rDNA进行菌株鉴定，响应面法优化培养条件，旨在提高其EPS的产量，探究EPS生物活性，包括体外抗氧化和降血糖活性，为EPS在功能性食品中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株GSBm- 1由实验室从传统酒曲中分离纯化并保藏。

胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、柠檬酸铵、尿素、大豆蛋白胨、三氯乙酸(TCA)、无水乙醇、苯酚、浓硫酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

菌株GSBm- 1基础培养基组成：酵母浸粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化钠10.0 g，去离子水1 L。调节pH值为7.2，121 ℃高温灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

低温冰箱(-80 ℃)， 美国Thermo公司； MLS- 3750型高压灭菌锅，日本Sanyo公司；CR21GⅢ型高速冷冻离心机、HZQ- Q型气浴恒温摇床，日本Hitachi公司；Elx800型酶标仪，美国博腾仪器有限公司；S20型数显pH计，上海Mettler Toledo仪器有限公司；透析袋(8 000～14 000 D)，北京生物技术有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基于16S rDNA的菌种分子生物学鉴定

样品由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序，测序结果与Gen Bank中已知菌株的相应序列进行比对,构建系统发育进化树。

1.3.2 菌株活化

将菌株接种到基础培养基中，接种量为3%，37 ℃、140 r/min培养18 h，连续活化两代后备用。

1.3.3 胞外多糖的提取

参照Wang等[8]的方法，略作改动。将活化后的菌株接种在基础培养基中，接种量为3%，140 r/min、37 ℃培养24 h，加入TCA使其最终质量分数为4%，140 r/min震荡2 h除去杂蛋白，而后9 810 r/min、4 ℃离心45 min，收集上清液。将2倍体积的无水乙醇加入到上清液中，并4 ℃静置24 h。沉淀后的溶液在9 810 r/min、4 ℃的条件下离心30 min后，除去上清液，用蒸馏水溶解沉淀，4 ℃条件下透析48 h，每8 h换一次水。

1.3.4 胞外多糖的测定

采用苯酚- 浓硫酸法测定菌株胞外多糖的产量：从透析袋中取100 μL样品用蒸馏水稀释至1 mL，加入500 μL质量分数为6%苯酚及2.5 mL浓硫酸，摇匀，避光静置30 min。取200 μL混合静置后的溶液于96孔板中，在490 nm条件下测吸光度。

将葡萄糖溶液作为标准品，490 nm条件下测吸光度，得到回归方程，y=0.006 3x+0.001 9，R2=0.999 7。

1.3.5 单因素实验设计

首先对影响多糖产量的因素进行单因素实验，分别选取碳源(蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖)、氮源(尿素、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、柠檬酸铵、牛肉膏)、pH值(5、6、7、8、9)、温度(27、32、37、42、47 ℃)、转速(100、120、140、160、180 r/min)、时间(12、24、36、48、60 h)、接种量(1%、2%、3%、4%、5%)为单因素，按照1.3.3的方法提取多糖，1.3.4的方法测定菌株胞外多糖的产量。

1.3.6 Plackett- Burman试验设计

依据前期单因素实验的因素水平，用MINITAB 15.0选取N=12的Plackett- Burman设计试验，对影响胞外多糖产量的7个因素进行考察，每个因素取2个水平，因素与水平见表1。

1.3.7 响应面试验设计

用Design-Expert 8.0.6设计响应面试验，以胞外多糖产量作为响应值，对3个因素进行考察，以单因素实验中胞外多糖产量最高的条件为0水平，设计因素水平见表2。

1.3.8 体外抗氧化活性测定

取EPS样品，配制成0、2、4、6、8、10、15、20、25 mg/mL的样品溶液，分别测定抗氧化指标。

DPPH自由基清除能力测定：参照Xu等[9]的方法，略作改动。取1 mL多糖样品与2 mL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液混合，室温避光反应1 h，离心，于517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率计算见式(1)。

DPPH清除率=[1-(A1-A)/A0]×100%。

(1)

式(1)中，A，以等体积甲醇代替DPPH溶液的空白组吸光度；A0，以等体积无菌水代替样品的对照组吸光度；A1，样品组吸光度。

ABTS+自由基清除能力测定：采用ABTS+测定试剂盒。

亚铁螯合能力的测定：参照Tang等[10]的方法，略作改动。多糖样品1 mL，2 mol/L氯化亚铁溶液0.05 mL，5 mol/L菲啰嗪0.2 mL，2.75 mL蒸馏水，室温下放置10 min，于562 nm处测定其吸光度。亚铁螯合能力计算见式(2)。

Fe2+螯合能力=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

(2)

式(2)中，A0，对照组的吸光度(蒸馏水代替样品)；A1，样品组吸光度；A2，空白组吸光度(蒸馏水代替氯化亚铁)。

1.3.9 降血糖活性测定

参照Wang等[11]的方法，略作改动。5 μL α-葡萄糖苷酶，20 μL EPS溶液与165 μL PBS(0.1 mmol/L, pH 值6.8)混合，37 ℃放置10 min，加入10 μL 含0.95 mmol/L PNP- Glu的0.1 mol/L的PBS溶液(pH值6.9)，37 ℃放置10 min，加入100 μL的1 mol/L Na2CO3。测定405 nm处的吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率计算见式(3)。

α-葡萄糖苷酶抑制率=
[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%。

(3)

式(3)中，A1，PBS、酶、底物、 Na2CO3溶液的吸光度； A2，PBS和Na2CO3溶液的吸光度；A3，PBS、酶、样品、底物、 Na2CO3溶液的吸光度；A4，PBS、酶、样品、 Na2CO3溶液的吸光度。

1.4 数据处理

每组样品重复实验3次，实验数据采用Sigmaplot 10.0绘图，结果均用“平均值±方差”表示。

2 结果与分析

2.1 基于16S rDNA的序列相似性比对及系统进化树分析

将菌株的16S rDNA基因序列与在Gen Bank中序列大小相近的已知菌株的序列进行比对后, 选取与菌株序列相似性较高的菌株序列, 构建系统进化树, 结果如图1。 由图1可知,菌株与Bacillus methylotrophicus 261AY3在同一分支上,且置信度支持率高, 可将菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。目前对甲基营养型芽孢杆菌EPS的研究较少，本实验主要针对甲基营养型芽孢杆菌产EPS的发酵条件及其生物活性进行研究。

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 碳源的影响

碳源对微生物生长繁殖有至关重要的作用，对胞外多糖产量也有重要影响。对于不同的菌株，最适合其生长的碳源种类及质量浓度不一定相同，因此，选择合适的碳源及添加量是十分必要的。已有研究发现，在蔗糖质量浓度为25.449 g/L时，枯草芽孢杆菌胞外多糖产量达到最大值[12]。本实验选取5种不同的碳源进行研究，结果如图2(a)。甲基营养型芽孢杆菌能利用多种碳源合成EPS，其中当蔗糖作为碳源时，甲基营养型芽孢杆菌EPS的产量最大。

研究进一步测定了添加不同质量浓度的蔗糖时胞外多糖的产量，结果如图2(b)。当蔗糖质量浓度低于20 g/L时，随蔗糖添加量升高，胞外多糖产量升高，胞外多糖产量最大值为434.9 mg/L；但超过20 g/L时，胞外多糖产量呈现出下降的趋势。赵雯等[13]对解淀粉芽孢杆菌GSBa- 1产EPS的培养条件优化的研究中发现，当蔗糖的质量浓度为40 g/L时，EPS产量有明显的提升，当超过40 g/L时出现下降的趋势。可能由于蔗糖含量相对过高时会对菌体产生渗透压胁迫，抑制菌体的生长及EPS的合成。

2.2.2 氮源的影响

氮源主要影响菌体细胞的生长，与其次级代谢产物的合成有关。本实验选取6种不同的氮源进行探究，实验结果如图3(a)。当加入的氮源为大豆蛋白胨时，胞外多糖的产量明显升高，为434.5 mg/L。 因此，选取大豆蛋白胨进行后续实验。

不同大豆蛋白胨质量浓度下胞外多糖的产量如图3(b)。添加不同质量分数的大豆蛋白胨时，菌株产生胞外多糖的能力不相同。随添加量的增加，胞外多糖产量呈现出先升高后降低的趋势。当添加量达到30 g/L时，菌株胞外多糖产量达到最大值。根据姜云芸等[14]的研究，植物乳杆菌K25也是以大豆蛋白胨为最佳氮源，当其质量浓度为8 g/L时, EPS的产量有显著提升。在添加量过低时，大豆蛋白胨不足以为菌体的生长提供氮元素，导致产糖量偏低；当添加量过大时，可能由于大豆蛋白胨对菌体的渗透压胁迫作用导致产糖量偏低。

2.2.3 培养基初始pH值的影响

本研究选择培养基初始pH值为5～9进行实验，结果如图4。随着pH值的升高，胞外多糖的产量先呈现出升高的趋势，当初始pH值为7时，产糖量达到最大值；当pH值大于7时，EPS产量逐渐下降。不同菌体所要求的生长环境pH值不同，研究发现，酒酒球菌(Oenococcus oeni)在pH值为4.3时EPS产量达到最大值[15]。因此，酸性过大或者碱性过大都可能导致菌株生长缓慢，进而影响次级代谢物的产量；这可能是由于pH值能够影响菌体对营养物质的吸收及酶的活性。

2.2.4 发酵温度的影响

每株菌都有适宜自身生长的最适温度，生产不同代谢产物的菌株的最适温度不相同。实验测定了在不同温度下胞外多糖的产量，结果如图5。随着发酵温度的升高，胞外多糖产量呈先升高后降低的趋势，在37 ℃条件下达到最大值，在此条件下，产糖量为313.7 mg/L。张爱梅等[16]的研究发现，菌株TT207的EPS产量随温度变化也呈现出先升高后下降的趋势，当培养温度达到34 ℃时，EPS产量最高，说明温度过高或过低都不利于EPS的产生。温度过低，可能不利于微生物的生长代谢及次级代谢产物的合成；温度过高可能导致微生物体内合成胞外多糖的酶活性降低甚至失去活性。因此应选择适当的发酵温度，合适的温度可以使菌株的生长速度加快，进而提高胞外多糖的产量。

2.2.5 转速的影响

转速对胞外多糖产量的影响见图6。由图6可知，当转速低于140 r/min时，产糖量随转速的升高而增多；但超过140 r/min时，产糖量呈现出下降的趋势。可能是由于当转速过低时，菌液的透气性不好，导致菌体生长缓慢；转速过高时，虽然菌液透气性较好，但可能会由于震荡过于剧烈而对菌体造成机械损伤，生物量偏低，也导致产糖量偏低。

2.2.6 接种量的影响

接种量会对生物量造成直接影响，从而间接影响次级代谢产物的产量(见图7)。由图7可知，当接种量为4%时，产糖量达到最大值，为355.9 mg/L。接种量过低时，生物量也偏低；随着接种量增加，产糖量并非持续增加。接种量过高时，培养基中的养分可能不足以为菌体提供足够的营养，EPS合成能力不足，还可能由于氧气供应量较低导致菌体生长缓慢、次级代谢产物产量偏低。

2.2.7 发酵时间的影响

随着发酵时间的延长，胞外多糖产量呈现出先升高后降低的趋势，在发酵48 h时达到最大值，见图8。发酵时间过短，只能保证菌体自身生长，而胞外多糖可能尚未有效产出。曹永强等[2]和Zhang等[17]研究发现，当培养时间过长时，植物乳杆菌YW11和植物乳杆菌C88的EPS产量都出现了下降的趋势，可能由于菌体自身产生了降解EPS的酶，使EPS产量下降[18]。因此，选择合适的培养时间至关重要。

2.3 主因素选取结果分析

实验以多糖产量为响应值Y，实验结果和方差分析见表3、表4。

从表4方差分析中可以看出此实验模型的P值为0.004小于0.05，且R2=0.976 0,R2(调整)=0.933 9，表明此模型显著，拟合性好。由T值可得知转速、培养温度、氮源、碳源、接种量对胞外多糖产量的影响是正向的，培养时间、培养基初始pH值对胞外多糖产量的影响是负向的。

*表示显著水平(P<0.05)，** 表示极显著水平(P<0.01)。

由表4可知，大豆蛋白胨对EPS产量影响非常显著(P<0.01)，蔗糖、培养基初始pH值对EPS产量影响显著(P<0.05)。由此得知，大豆蛋白胨添加量、蔗糖添加量、培养基初始pH值对EPS影响最大，以上述3个因素为研究对象进行后续优化实验。

2.4 响应面试验结果分析

2.4.1 响应面结果分析

响应面试验的结果如表5，以胞外多糖产量作为响应值，得到Y对自变量A、B、C的二次多项拟合方程：

Y=496.40+37.69A+5.88B-10.26C+36.65AB-
92.13AC-27.25BC-56.84A2-52.56B2-80.24C2。

模型方差分析见表6，模型F值为135.95，P<0.000 1，影响极显著；失拟项F值为5.94，P值为0.059 0>0.05，失拟项不显著。且函数的相关系数为R2=0.984 3，R2(调整)=0.977 0，说明该模型能够充分反应胞外多糖产量的情况。通过比较各因素的F值，各个因素对胞外多糖产量影响的大小顺序依次是大豆蛋白胨添加量、培养基初始pH值、蔗糖添加量。单独分析各因素可知，大豆蛋白胨添加量影响极显著，培养基初始pH值影响显著，所有二次项以及交互项的影响极显著。由此可知，各因素对胞外多糖产量的影响不是线性关系。

*表示显著水平(P<0.05)，** 表示极显著水平(P<0.01)。

2.4.2 响应面交互作用分析

各个因素之间的相互作用如图9至图11，其含义为当其中一个因素取0水平时，另两个因素之间的相互作用，等高线图可表示交互作用的强弱，其中圆形表示相互作用较弱，椭圆形则表示交互作用显著。

大豆蛋白胨含量与蔗糖含量交互作用的等高线图呈椭圆形，说明二者交互作用比较显著(如图9)。当固定pH值为7时，相同蔗糖质量浓度下，大豆蛋白胨质量浓度对胞外多糖产量有较大影响，随大豆蛋白胨质量浓度的增大而呈现升高的趋势。

大豆蛋白胨含量与培养基初始pH值交互作用的等高线图呈椭圆形，说明二者交互作用比较显著(如图10)。固定蔗糖添加量为20 g/L时，相同大豆蛋白胨质量浓度下，随pH值的升高，胞外多糖产量呈现先升高后降低的趋势。

蔗糖含量与培养基初始pH值交互作用的等高线图呈椭圆形，说明二者交互作用比较显著(如图11)。固定大豆蛋白胨的添加量为30 g/L时，蔗糖含量的等高线更为紧密，培养基初始pH值等高线更为稀松，这说明培养基初始pH值对胞外多糖产量的影响更大。

由Design-Expert软件分析可得出，优化发酵条件为酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、蔗糖26.0 g/L、大豆蛋白胨40.0 g/L、pH值 6.26、接种量4%、温度37 ℃、时间48 h、转速140 r/min，预测胞外多糖产量为522.8 mg/L。利用软件给出的培养条件进行验证实验，设置3个平行实验组，对测量结果取平均值。经验证在此条件下，胞外多糖产量为(520.1±1.2) mg/L，与预测结果基本一致。

2.5 EPS抗氧化活性分析

DPPH自由基是一个稳定的自由基，若能将其清除，则表明样品具有较强的自由基清除能力，因而DPPH自由基清除能力常作为评价某物质抗氧化性的有效指标[19]。图12是不同质量分数EPS的抗氧化活性。如图12(a)，甲基营养型芽孢杆菌EPS对DPPH自由基有一定清除能力，且清除能力与EPS质量浓度有关。董乐等[20]研究发现，当EPS质量浓度为10 mg/mL时，EPS对DPPH自由基的清除率为19.32%。本实验研究中，当EPS为10 mg/mL时，DPPH自由基清除率已经达到40.04%。随着EPS质量浓度的升高，DPPH自由基清除能力继续升高；在EPS质量浓度为25 mg/mL时，DPPH自由基清除能力达到70.67%。这可能是由于EPS存在一些官能团使自由基转化成了更稳定的形式，或与自由基反应终止了其链式反应[21]。不同来源的EPS在DPPH自由基清除能力上存在差异，可能与EPS的单糖组成、羟基和羧基的含量以及供氢能力有关。

ABTS+自由基是一种稳定的有机自由基，在抗氧化剂存在的情况下，ABTS+自由基将会减少[22]。如图12(b)，当EPS质量浓度为10 mg/mL时，对ABTS+自由基的清除能力超过了50%。随着EPS质量浓度继续升高，ABTS+自由基清除能力也随之增强，EPS质量浓度为25 mg/mL时，ABTS+自由基清除能力达到71.69%。

铁是各种金属离子中最强的促氧化剂，催化脂质、蛋白质和其他细胞成分的氧化反应[23]。金属螯合剂可以将这些过渡金属转化为稳定的化合物，通过螯合作用抑制氧化反应。如图12(c)，EPS在质量浓度为2 mg/mL时，没有螯合作用，但随着EPS含量的提高，逐渐体现其螯合作用；当EPS质量浓度为25 mg/mL时，螯合作用最大为55.25%。据报道，具有-OH，-SH，-COOH，-PO3H2，-CO，-NR2，-S-和-O-官能团中两个或更多个结构的化合物可以显示金属螯合活性[24]。因此甲基营养型芽孢杆菌产生的EPS可能含有一部分以上官能团。

2.6 EPS降血糖活性分析

食物中的淀粉、双糖等较大的分子不能直接被人体吸收，需通过协同作用生成单糖后才能被人体吸收，因此可以通过阻止α-葡萄糖苷酶的酶促反应来实现降低血糖的效果[25]。甲基营养型芽孢杆菌产生的EPS对α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用，且抑制率与EPS质量浓度有关(如图13)。当EPS质量浓度为10 mg/mL时，抑制率为33.79%；当EPS质量浓度继续升高时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率也呈现出上升的趋势。已有研究发现，来源于Probio 65的EPS也对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且当EPS质量浓度为10 mg/mL时，抑制率为7.05%[26]，低于本实验中的研究结果。不同来源的EPS对α-葡萄糖苷酶的抑制效果存在差异，可能是由于EPS结构的不同。

3 结 论

一株从传统酒曲中分离的产EPS的菌株，经16S rDNA鉴定为甲基营养型芽孢杆菌GSBm- 1。本实验通过单因素实验及响应面试验对其发酵条件进行了优化，优化发酵条件为氯化钠10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、蔗糖26.0 g/L、大豆蛋白胨40.0 g/L、pH值6.26、温度37 ℃、时间48 h、转速140 r/min、接种量4%，在此条件下胞外多糖的产量达到最大值，为(520.1±1.2) mg/L。与优化前相比，EPS产量提高了33.8%。将提取得到的EPS进行体外抗氧化能力及降血糖活性的测定，结果表明，EPS具有DPPH、ABTS+自由基清除能力、Fe2+螯合能力，表现出一定的抗氧化性；且对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，对降血糖有一定效果。因此，甲基营养型芽孢杆菌GSBm- 1具有高产EPS的能力，其EPS具有多种生物学功能，在功能食品研发领域具有潜在的应用价值。

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Research on Fermentation Conditions and Bioactivity of Exopolysaccharide Produced by Bacillus methylotrophicus

CAI Miao1，CHEN Chao2，CAO Yongqiang2，YANG Zhennai1，*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048，China；2.Dongjun (Yucheng) Dairy Co Ltd, Dezhou 253000, China)

Abstract： A strain with high production of exopolysaccharide was isolated from the traditional rice wine starter, which was identified as Bacillus methylotrophic GSBm- 1 after 16S rDNA identification. The optimal fermentation conditions obtained by single factor experiments and response surface analysis were as follows: the culture medium with pH 6.26 and consisted of yeast extract 5.0 g/L, peptone 10.0 g/L, NaCl 10.0 g/L, soy peptone 40.0 g/L, and sucrose 26.0 g/L, and the culture condition was performed for 48 h at 37 ℃ with an inoculum size of 4% and shaking speed at 140 r/min. The maximal production of exopolysaccharide was reached to (520.1±1.2) mg/L under the above conditions. The results of bioactivity studies indicated that the exopolysaccharide had anti-oxidant activity, which could remove DPPH and ABTS+ free radicals, and showed chelation ability to Fe2+. The exopolysaccharide also had antidiabetic activity via inhibiting α-glucosidase. The results could provide a technical reference for the industrial production of microbial exopolysaccharide and the development of functional raw materials for the food industry.

Keywords： Bacillus； exopolysaccharide； fermentation conditions； antioxidant； antidiabetic

中图分类号： TS201.3； TQ929.2

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2020.02.007

文章编号：2095-6002(2020)02-0048-11

引用格式：蔡淼，陈超，曹永强，等. 甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究[J]. 食品科学技术学报，2020,38(2):48-58.

CAI Miao， CHEN Chao， CAO Yongqiang, et al. Research on fermentation conditions and bioactivity of exopolysaccharide produced by Bacillus methylotrophicus[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020,38(2):48-58.

收稿日期： 2019-07-22

基金项目： 国家自然科学基金面上项目(31871823)；北京市人才培养质量建设项目(PXM2019_014213_000010)；北京工商大学大学生科研与创业行动计划项目(G001)。

第一作者： 蔡 淼，女，硕士研究生, 研究方向为乳品生物技术。

*通信作者： 杨贞耐，男, 教授, 博士, 主要从事乳品科学及加工技术方面的研究。

(责任编辑：张逸群)