苹果酸最早是由Carl Wilhelm Scheele于1785年在苹果汁中分离得到。苹果酸结构上类似于琥珀酸及富马酸，其内在的四碳二元羧酸分子结构拓展了苹果酸的用途[1]，如广泛用于食品添加剂、医药化工领域及作为聚苹果酸的前体物质等[2]。

目前，大多数工业生产的苹果酸通过化学合成方法制备，酶催化法合成仅占一小部分，直接发酵法合成更少。化学合成方法[3]通过加热马来酸得到苹果酸；酶催化法[4]通过微生物中分离得到的富马酸酶转化富马酸得到苹果酸，其中富马酸是由石化资源制得的马来酸转化而来。酶催化法[5]和化学方法的原料均来自石化资源。由可再生糖质原料直接发酵转化制备苹果酸，虽然尚未在工业上广泛应用，但显示出了产品安全特性及原料供应丰富的巨大优势，正在获得越来越多的关注和研发投入。目前，苹果酸与琥珀酸、富马酸共同被美国能源部列为未来12种顶级生物基平台化学品的首位[5]，因此，直接发酵法代表了苹果酸生物炼制技术的未来。

本文期望在细菌、酵母和丝状真菌的转化机制方面进行分析，通过将细胞的代谢与发酵过程联系起来，讨论苹果酸生物精炼上游原料和下游发酵过程的组合。根据原料及菌种的特性考虑了水解和发酵的整合(同步糖化发酵)；基于纤维素糖中共存有五碳或六碳糖，讨论了五六碳共发酵；基于发酵中存在的减缓温室效应特点，分析了碳的固定化；基于纤维素糖独有的抑制特性，分析菌种对发酵抑制的适应性；同时，提出了能量调控的观点，以促进发酵中的苹果酸产物通量的提升。

1 苹果酸生物炼制研究现状

1.1 发酵原料的范围研究

将可再生生物质转化为生物燃料、化学品及食品添加剂是当前生物化工领域研究的热点课题，许多不同类型的生物质水解产物均可用于制备苹果酸。文献[2,6-8]报道：用玉米芯水解产物可生产苹果酸；Rhizopus delemar菌株被用于转化玉米秸秆水解物生产苹果酸，也具有工业应用意义；其他生物质也可被用于苹果酸发酵。这些研究表明，苹果酸生物炼制的原料范围很广。

1.2 菌种的筛选研究

近年来，有17种微生物被用于苹果酸转化研究，这些微生物可分为3种类型：细菌、酵母和丝状真菌。细菌具有发酵周期短、生长快的优点，通常用于有机酸的工业发酵；作为模型微生物，酵母广泛应用于酒精发酵领域，虽然酵母不是最重要的苹果酸生产菌种，但由于其代谢能力多样，受到广泛关注；丝状真菌发酵苹果酸最大的优势是营养需求简单，利于产品分离。丝状真菌是最重要的苹果酸产生菌，科研人员也多围绕该类菌种开展研究。产苹果酸菌株情况见表1。Jantama等[9]发现，大肠杆菌KJ070能够利用10%的葡萄糖在24 h内生产626 mmol的苹果酸；Crtereal等[10]研究表明，汉逊酵母具有较好的生产苹果酸及其他多种四碳二元羧酸的潜力。

表1 生产苹果酸的菌株

Tab.1 Strains producing malic acid

微生物类型名称菌株ρ(产物)/(g·L-1)t(发酵)/h产率/(g·(L·h)-1)得率/%分析参考文献细菌Nonrecombinant Escherichia coliKJ07083.9243.500.84Brevundimonas diminutaIFO13182----Escherichia coliXZ65833.9720.471.03Thermococcus kodakarensisKOD1---0.45尽管细菌生产苹果酸的产量不是最高的,但其快速生长的优势,显示出发酵苹果酸的最高生产力;因此,需要进一步调查细菌产苹果酸能力[9][11][12][13]酵母Candida sphaericaIGC3208----Zygosaccharomyces rouxiiV1974.91400.540.33Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK59.03100.190.31Torulopsis glabrataT.G-PMS8.5600.140.14虽然酵母不是最重要的生产苹果酸的菌种,但因其产苹果酸浓度较高,仍显示出较好的生产潜力。作为模型微生物,酵母的生物乙醇生产具有更明显优势[10][14][15][16]丝状真菌Aspergillus flavusATCC1369717.3500.35-Monascus araneosusAHU908728.01200.230.28Schizophyllum communeIFO492818.01000.180.36Penicillium sclerotiorumK30292.0721.230.88Aspergillus oryzaeNRRL348830.3480.630.81Aureobasidium pullulansZX-10142.21920.740.55Penicillium viticolaNo.152168.0961.751.28Rhizopus delemarHF-121120.5602.000.96Ustilago trichophoraTZ1196.0(195.0)5040.390.82丝状真菌是最重要的苹果酸生产菌种,大多数苹果酸发酵研究都集于此。丝状真菌显示出最高的产物浓度和相当大的产率和得率,特别是一些菌株具有利用生物质糖(包括木糖)的潜力,并且它们的营养需求简单。丝状真菌具有最重要的工业开发潜力[17][18][19][20][21][6][22][7][23]

1.3 基本代谢路径研究

类似丁二酸及L-乳酸，苹果酸的合成路径引起人们重视，尤其是其工业化生产调控[24]。作为四碳二羧酸最重要的生产菌，大肠杆菌的代谢途径被广泛研究[25]，也可通过琥珀酸产生菌的代谢修饰生产苹果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人们用于苹果酸生产，13C同位素示踪分析表明，Saccharomyces cerevisiae[15]的苹果酸累积通过丙酮酸的羧化、三羧酸循环及其逆循环合成而得；丝状真菌米曲霉的13C同位素示踪分析[26]表明，线粒体内TCA循环(三羧酸循环)的活性对苹果酸的分泌贡献较大。

苹果酸生物炼制的中心代谢途径如图1。分析表明，细菌中苹果酸的通量主要来源于草酰乙酸的直接代谢；酵母菌中除了草酰乙酸的代谢外，部分苹果酸来自TCA循环；丝状真菌中除了草酰乙酸代谢和TCA循环代谢外，苹果酸的通量也来自苹果酸酶的直接催化以及乙醛酸循环的代谢。

Glucose,葡萄糖；PEP, 磷酸烯醇式丙酮酸；pyk, 丙酮酸激酶；pepck，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；Pyruvate, 丙酮酸；pyc, 丙酮酸羧化酶; pdc,丙酮酸脱氢酶； Oxaloacetate, 草酰乙酸；mdh, 苹果酸脱氢酶；Acetyl-CoA, 乙酰辅酶A； Citratate, 柠檬酸；sdh, 琥珀酸脱氢酶；fum，富马酸酶；Isocitratate, 异柠檬酸；aco, 乌头酸酶；mse, 苹果酸合酶；ace, 异柠檬酸裂解酶；me，苹果酸酶；Mitochondrion， 线粒体；Cytosol，胞液。
图1 苹果酸生物精炼的中心代谢途径
Fig.1 Central metabolic pathway for malic acid bio-refinery

1.4 关键酶研究

富马酸酶是生产苹果酸的重要酶，特别是由富马酸为原料生产苹果酸时。已在酿酒酵母中检测到富马酸酶，并且在面包酵母细胞中测量到其高比活性[27]。苹果酸酶在大肠杆菌中介导C3代谢物羧化成C4代谢中起重要作用[28]。研究表明，也可以通过用修饰电极再生辅酶来生产苹果酸[11]。此外，在米曲霉中检测到丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶的活性也是影响苹果酸通量高低的主要原因[26]。

苹果酸代谢的关键酶见表2。对这些关键酶的分析表明，产生苹果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且参与TCA和乙醛酸盐循环的合成。

1.5 代谢改造策略研究

通过对苹果酸代谢的全面研究，尤其是全细胞优化的研究[31]，人们借助代谢途径改造生产多种有机酸，包括C4苹果酸[32]。Ye等[13]通过从Thermococcus kodakarensis中提取苹果酸酶来构建体外人工苹果酸合成途径，发现其对葡萄糖的得率可以达到60%。

为了提高苹果酸的产量，在大肠杆菌中实施了富马酸还原酶的敲除以提升产物[12]，根据苹果酸的通量来源，削弱富马酸酶可以增加苹果酸的产量；同时富马酸酶的过度表达也可以反过来从下游改善其代谢[33]。对于酿酒酵母K-901H[34]，Vid24p基因功能丧失导致了苹果酸脱氢酶累积，进而实现苹果酸产率的提升。所有这些改造策略显著促进产物代谢。苹果酸代谢改造策略及效果如表3。

1.6 发酵工艺研究

对于发酵过程，通常采用3种类型的发酵模型，包括深层发酵、固体发酵和酶催化。Zou等[2]探讨了深层发酵过程并进行了总结。Penicillium sclerotiorum K302[20]可以在有氧条件下高产苹果酸钙(92.0 g/L)，该深层培养工艺具有较大潜力。寄生曲霉CICC40365深层培养8 d可得到55.47 g/L的苹果酸，黄曲霉ATCC13697和米曲霉QM No.821[37]则可通过固体发酵方法生产苹果酸。酶生物催化和膜分离[38]过程被应用于富马酸和苹果酸生物转化。微生物电渗析与细胞催化相结合的方法也是一个亮点，该方法具有电耗低和外源电子利用的多种底物的优点[39]。

表2 苹果酸代谢中的关键酶

Tab.2 Key enzymes involved in metabolism of malic acid

关键酶[29]代谢反应辅酶因子共基质比活性[30]/(U·mg-1)特殊特征富马酸酶Fumarate+H2O=Malate-104在苹果酸的生产中,负责富马酸的吸收苹果酸酶Pyruvate+CO2+NADPH+H+=Malate+NADP+NADPH, CO292.3对于苹果酸的通量和CO2固定非常重要苹果酸脱氢酶OAA+NADH+H+=Malate+NAD+NADH, CO2740.1直接负责苹果酸的主要通量丙酮酸羧化酶ATP+Pyruvate+HCO-3=ADP+Pi+OAAATP, CO2351.5负责CO2固定并启动rTCA循环丙酮酸激酶ADP+PEP=ATP+PyruvateADP-丙酮酸途径的关键节点丙酮酸脱氢酶Pyruvate+CoA+NAD+=Acetyl-coA+CO2+NADH+H+CoA, NAD+-丙酮酸途径的关键节点磷酸烯醇丙酮酸羧激酶CO2+PEP+ADP=OAA+ATPADP, CO2-负责CO2固定并启动rTCA循环琥珀酸脱氢酶FAD++Succinate=Fumarate+FADHFAD+46.2富马酸和苹果酸生产中负责琥珀酸的吸收富马酸还原酶Fumarate+FADH+H+=FAD++SuccinateFADH-负责涉及富马酸和琥珀酸的新陈代谢苹果酸合酶Glyoxylate+Acetyl-CoA=MalateCoA33.5直接负责乙醛酸循环中苹果酸的通量柠檬酸合酶Acetyl-coA+H2O+OAA=Citrate+CoACoA19.2负责TCA循环乌头酸酶Citrate=Isocitrate--负责TCA循环异柠檬酸裂解酶Isocitrate=Glyoxylate+Succinate-15.0负责乙醛酸的合成木糖还原酶NADPH+H++Xylose=NADP++XylitolNADPH57.0对木糖的新陈代谢非常重要木糖醇脱氢酶Xylitol+NAD+=Xylulose+NADH+H+NAD+54.1对木糖的新陈代谢非常重要木酮糖激酶ATP+Xylulose=ADP+Xylulose-5PATP54.5对木糖的新陈代谢非常重要葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Glucose-6P+2×NADP+=2×NADPH+H++Ribulose-5P+CO2NADP+82.8对于EMP和HMP的通量以及能量调节非常重要

NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原态；NADP+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化态；OAA，草酰乙酸；NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态；NAD+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态；ATP，三磷酸腺苷；ADP，二磷酸腺苷；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；Pi，磷酸盐；FADH，还原型黄素腺嘌呤二核苷酸；FAD+，黄素腺嘌呤二核苷酸；Acetyl-CoA，乙酰辅酶A；CoA，辅酶A；Xylulose-5P，5-磷酸木酮糖；Glucose-6P，6-磷酸葡萄糖；Ribulose-5P，5-磷酸核酮糖。

1.7 影响发酵的关键因子研究

影响发酵的主要因素包括溶解氧、中和剂、微生物形态、二氧化碳及细胞状态等。

微生物在有氧(偶尔厌氧)条件下产生苹果酸，其中溶解氧在细胞生长中起关键作用。中和剂如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有机酸发酵过程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3确保了酿酒酵母在整个苹果酸发酵过程中保持很好的发酵指数[15]，其中CaCO3通过保持恒定的pH值在苹果酸生物合成中起重要作用。显著影响氧转移速率的另一种情况是真菌的形态，当丝状真菌在深层培养基中生长时，在不同的发酵过程中形成不同类型的形态。代谢网络显示苹果酸积累的几种途径与CO2固定密切相关，因此CO2影响着苹果酸的发酵。对于苹果酸生产菌大肠杆菌[40]而言，CO2参与磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饥饿条件下对米曲霉中苹果酸生产状况研究表明[21]，氮源亚适量反而会增加苹果酸的代谢，这可能与TCA循环的代谢、细胞呼吸和溶解氧吸收间接相关。

2 苹果酸生物炼制研究发展趋势

2.1 苹果酸炼制各阶段研究发展趋势

2.1.1 同步糖化发酵研究

纤维素原料转化为高附加值化学品(如苹果酸)主要包括4个加工步骤：原料预处理、水解、发酵和产品回收[41]。由于同步糖化发酵提高了产品的整体转化效率，是未来苹果酸生物炼制研究的重要发展趋势。

表3 苹果酸代谢重建策略及效果

Tab.3 Reconstruction strategies and results for metabolism of malic acid

微生物代谢的改善策略提升效果参考文献Thermococcus kodaka-rensis KOD1通过源自Thermococcus kodakarensis的苹果酸酶构建体外人工合成途径葡萄糖直接转化为苹果酸的产率达到60%[13]Escherichia coli KJ071为了减少副产物(乳酸、乙酸盐、甲酸盐和乙醇),删除了它们相应的基因(Δ ldhA、 Δ adhE、 Δ ackA、 Δ focA-pflB、 Δ mgsA)苹果酸的质量浓度达到69.1g/L[9]Pichia pastoris GS115预计基因过量表达会增加苹果酸的产量(↑pc、↑mdh和↑fum)苹果酸的质量浓度达到42.28g/L,并且富马酸和琥珀酸的质量浓度分别达到0.76、9.42g/L[33]Aspergillus oryzaeSaMF2103a68通过基因的过表达(↑pc和↑mdh),苹果酸脱氢酶的比活性和苹果酸浓度显著增加苹果酸的质量浓度达到154g/L[35]Saccharomyces cerevi-siae RWB525该菌株的代谢工程策略基于3种基因蛋白的高水平表达(↑pc、↑mdh和↑mae),这种变化直接影响苹果酸的产生苹果酸的滴度达到 54g/L,得率为0.42mol/(mol 葡萄糖)[15]Escherichia coli ZX658通过删除菌株KJ073的基因(Δ frdBC、 Δ sfcA、 Δ maeB、 Δ fumB、 ΔfumAC),苹果酸的通量有效增加在72h内产生253mmol·L-1苹果酸盐,得率为1.42mol/(mol葡萄糖)[12]Escherichia coli WGS10缺失基因(ΔldhA、 ΔadhE、 Δpta)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(↑pck)的引入改善了苹果酸通量好氧培养12h,苹果酸终质量浓度为9.25g/L[36]Rhizopus delemarHF119乙醇脱氢酶基因的致死突变(Δadh)降低了乙醇的通量,增加了苹果酸的通量获得超过120g/L的苹果酸,杂酸的水平显著降低[7]Saccharomyces cerevisi-ae K901H基因突变(vid24)提出了一种调节酵母细胞中有机酸生成的新机制VID24的突变导致苹果酸生产力的显著增强[34]Penicillium viticola 152克隆并表征丙酮酸羧化酶(pc)基因,用于Penicillium viticola 152中的苹果酸过量产生该菌株具有产生丙酮酸羧化酶的能力,可以抵抗高工业温度和pH值[22]Thermobiida fusca muC生产苹果酸的Thermobiida fusca muC HPr的系统分析两种突变菌株均证实HPr是T. fusca氮源代谢的关键调节蛋白[8]

ldhA，乳酸脱氢酶基因；adhE，乙醇脱氢酶基因；ackA，乙酸激酶基因；focA，甲酸转运蛋白基因；pflB，丙酮酸甲酸裂解酶基因；mgsA，甲基乙二醛合酶；pc，丙酮酸羧化酶基因；mdh，苹果酸脱氢酶基因；fum，富马酸酶基因；mae，苹果酸通透酶；frdBC，富马酸还原酶；sfcA，NAD+依赖的苹果酸酶基因；maeB，NADPH连接的苹果酸酶基因；fumB和fumAC，富马酸酶的几个基因；pck，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；vid24，别名gid4，葡萄糖诱导的降解缺陷复合物；HPr，含组氨酸蛋白。

2.1.2 提高细胞耐受性的改善策略研究

当碳源从葡萄糖扩展到生物质糖时，必须考虑一系列抑制剂和所产生的细胞耐受性或适应性。纤维素糖降解过程中形成或释放多种细胞抑制剂，特别是在预处理过程中[42]。这些抑制剂对微生物有一定的毒性和负面影响，例如形成的糠醛会导致细胞损伤[43]。研究发现，参与硫同化途径的4种基因转录水平能显著保护细胞免受糠醛氧化应激的影响，也可通过与质膜密切相关的化学和遗传扰动来改善细胞对乙酸抑制剂的耐受性[44]。如果高浓度抑制剂在发酵系统中积累，则需要脱毒[42]。

2.1.3 五六碳糖共发酵研究

拓宽生物质糖生物转化苹果酸的基质范围对其未来成功应用至关重要。EMP途径的葡萄糖代谢已经在大多数生物体中得到很好的应用，六碳糖(低聚糖、纤维二糖、淀粉、蔗糖和麦芽糖)都通过EMP途径引入或参与葡萄糖代谢。五碳糖(木糖和阿拉伯糖)是来自生物质的水解糖中的重要糖成分，含量仅次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同发酵苹果酸[7]对工业制备苹果酸具有重要意义。六碳糖和五碳糖的共代谢途径见图2。

Glucose-6P，6-磷酸葡萄糖；Fructose-6P，6-磷酸果糖；Fructose-1,6-2P，1,6-二磷酸果糖；G3P，3-磷酸甘油醛；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；Pyruvate，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；Xylose，木糖；Xylitol，木糖醇；Xylulose，木酮糖；Xylulose-5P，5-磷酸木酮糖；Eyr-4P，4-磷酸赤藓糖；Sep-7P，7-景天磷酸庚酮糖；Arabinose，阿拉伯糖；Arabinitol，阿拉伯糖醇；Ribulose，核酮糖；Ribulose-5P，5-磷酸核酮糖；Ribose-5P，5-磷酸核糖；Acetyl-coA，乙酰辅酶A。
图2 六碳糖和五碳糖的共代谢途径
Fig.2 Co-metabolism pathway of hexose and pentose

2.1.4 碳固定化的强化研究

CO2是温室气体的主要成分，在苹果酸[45]发酵过程中将CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中会产生较大的益处。CO2的固定效率对苹果酸的生产有积极作用[7]，碳固定的关键酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和苹果酸酶[15]。Rhizopus delemar[7]胞内的苹果酸酶活性非常高，在苹果酸的总产量中，突变菌株中检测到20%的通量来自苹果酸酶对CO2的直接固定化。

2.1.5 能量平衡改善代谢研究

对于苹果酸合成的基本代谢，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[15]和丙酮酸羧化酶合成途径差异显著，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化为OAA(草酰乙酸)的过程净消耗ATP。当在产生苹果酸的菌株代谢中检测到PEPCK和PC时，细胞的ATP能量平衡将起决定性作用；因此，在了解细胞能量供应时，分析能量平衡很关键。类似琥珀酸等四碳二羧酸的发酵[46]，能量不平衡也是菌种高产的瓶颈。当NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-还原态，还原型辅酶Ⅰ)细胞供应不足时，可以通过氧化还原平衡和调节NADH/NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化态)比例[47]提升系统能量的稳定；同时通过乙酰辅酶A代谢，可以另外获得NADH，因此可以通过控制电子传递链来产生ATP。NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶Ⅱ)则在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的苹果酸生物转化中起重要作用。如果一个菌株中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[7]的代谢成功启动，这个关键途径将产生双倍还原力(NADPH)，以补偿能量供应，并进而缓解整体代谢还原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，这是一种有效改善NADHP平衡的方法。

2.2 苹果酸生物精炼研究的总体趋势

2004年，美国能源部将苹果酸列为未来高附加值生物基化学品的首位，苹果酸将广泛应用于化工、食品和制药等各领域。由于人体只能代谢L-型苹果酸，研究人员已经提出逐渐使用L-苹果酸代替混合型DL-苹果酸，特别是在食品和医药应用中，欧美已经禁止混合型产品的乱用。由于大多数苹果酸产品是通过化学方法合成的，而富马酸酶的催化不是真正的一步发酵，并且反应中存在其他化学残留的可能，因此，苹果酸的一步法生物精炼技术具有重要发展前景。

未来苹果酸生物炼制研究总体趋势为，在原料利用上实现同步糖化发酵，利用细胞耐受性的改善提高其发酵适应性，并进而提升碳糖的共发酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升苹果酸产量。

3 结束语

利用生物炼制手段转化可再生糖制备苹果酸具有重要意义，其未来的发展定位是将原来的淀粉质糖水解系统逐渐过渡到纤维质水解糖系统，而如何克服其生物转化过程中的诸多限制因素至关重要。本文介绍和总结了苹果酸生物炼制流程，包括原料选择、菌种筛选、基本代谢路径研究、关键酶研究、发酵工艺研究以及关键影响因子研究；同时，统筹分析了转化生物体的内部代谢与外在条件之间的关联，进而提出苹果酸生物转化研究的发展趋势，期望为苹果酸生物精炼提供一定参考。

参考文献：

[1] YANG S T， HUANG H J, TAY A， et al. Extractive fermentation for the production of carboxylic acids[J]. Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007(4):421-446.

[2] ZOU X, ZHOU Y P, YANG S T. Production of polymalic acid and malic acid by Aureobasidium pullulans fermentation and acid hydrolysis[J]. Biotechnology & Bioengineering, 2013, 110(8):2105-2113.

[3] MILTENBERGER K. Ullmann’s encyclopedia of industrial chemistry[M]. Neinheim: Wiley-VCH, 2000: 481-491.

[4] WU J L, WU Q P, ZHANG J M, et al. Progress in L-malic acid biosynthesis [J]. Food Science, 2014. 35(3): 5.

[5] WERPY T A， HOLLADAY J E， WHITE J F. Top value added chemicals from biomass: I. results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas[J]. Synthetic Fuels, 2004,11(1):1-76.

[6] ZOU X， WANG Y K， TU G W， et al. Adaptation and transcriptome analysis of Aureobasidium pullulans in corncob hydrolysate for increased inhibitor tolerance to malic acid production[J]. Plos One, 2015, 10(3):e0121416.

[7] LI X J, LIU Y， YANG Y， et al. High levels of malic acid production by the bioconversion of corn straw hydrolyte using an isolated Rhizopus delemar strain[J]. Biotechnology & Bioprocess Engineering, 2014, 19(3):478-492.

[8] DENG Y， MAO Y， ZHANG X J. Metabolic engineering of a laboratory-evolved Thermobifida fusca MUC strain for malic acid production on cellulose and minimal treated lignocellulosic biomass[J]. Biotechnol Prog, 2016, 32(1):14-20.

[9] JANTAMA K， HAUPT M J， SVORONOS S A， et al. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate[J]. Biotechnology & Bioengineering, 2010, 99(5):1140-1153.

[10] CRTEREAL M, LEO C. Transport of malic acid and other dicarboxylic acids in the yeast Hansenula anomala[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1990, 56(4):1109-1113.

[11] ZHENG H， OHNO Y， NAKAMORI T， et al. Production of L-malic acid with fixation of by malic enzyme-catalyzed reaction based on regeneration of coenzyme on electrode modified by layer-by-layer self-assembly method[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2009, 107(1):16-20.

[12] ZHANG X， WANG X， SHANMUGAM K T， et al. L-malate production by metabolically engineered Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(2):427-434.

[13] YE X T， HONDA K， MORIMOTO Y， et al. Direct conversion of glucose to malate by synthetic metabolic engineering[J]. Journal of Biotechnology, 2013, 164(1):34-40.

[14] TAING O， TAING K. Production of malic and succinic acids by sugar-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii[J]. European Food Research & Technology, 2007, 224(3):343-347.

[15] ZELLE R M， DE HULSTER E， VAN WINDEN W A， et al. Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reduction, and malate export[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2008, 74(9):2766-2777.

[16] CHEN X L， Xu G Q， Xu N， et al. Metabolic engineering of Torulopsis glabrata for malate production[J]. Metabolic Engineering, 2013, 19:10-16.

[17] PELEG Y， STIEGLITZ B， GOLDBERG I. Malic acid accumulation by Aspergillus flavus[J]. Applied Micro-biology & Biotechnology, 1988, 28(1):69-75.

[18] LUMYONG S， TOMITA F. L-malic acid production by an albino strain of Monascus araneosus[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1993, 9(3):383-384.

[19] KAWAGOE M, HYAKUMURAK, SUYE S I, et al. Application of bubble column fermentors to submerged culture of Schizophyllum commune, for production of L-malic acid[J]. Journal of Fermentation & Bioengineering, 1997, 84(4):333-336.

[20] WANG Z P， WANG G Y， KHAN I， et al. High-level production of calcium malate from glucose by Penicillium sclerotiorum K302.[J]. Bioresource Technology, 2013, 143(17):674-677.

[21] KNUF C， NOOKAEW I， BROWN S H， et al. Investigation of malic acid production in Aspergillus oryzae under nitrogen starvation conditions[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2013, 79(19):6050-6058.

[22] KHAN I， NAZIR K， WANG Z P， et al. Calcium malate overproduction by Penicillium viticola 152 using the medium containing corn steep liquor[J]. Applied Micro-biology and Biotechnology, 2014, 98(4):1539-1546.

[23] ZAMBANINI T， KLEINEBERG W， SARIKAYA E， et al. Enhanced malic acid production from glycerol with high-cell density Ustilago trichophora TZ1 cultivations[J]. Biotechnology for Biofuels, 2016, 9(1):135.

[24] SUN J， ALPER H S. Metabolic engineering of strains: from industrial-scale to lab-scale chemical production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2015, 42(3):423-436.

[25] CAO Y J， CAO Y G, LIN X Z. Metabolically engineered Escherichia coli for biotechnological production of four-carbon 1,4-dicarboxylic acids[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2011, 38(6):649-656.

[26] KNUF C， NOOKAEW I， REMMERS I， et al. Physiological characterization of the high malic acid-producing Aspergillus oryzae strain 2103a-68[J]. Applied Micro-biology & Biotechnology, 2014, 98(8):3517.

[27] PRESEKI A V, ZELI B, VASI-RAKI D. Compari-son of the L-malic acid production by isolated fumarase and fumarase in permeabilized baker’s yeast cells[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2007, 41(5):605-612.

[28] KWON Y D， KWON O H， LEE H S， et al. The effect of NADP-dependent malic enzyme expression and anaerobic C4 metabolism in Escherichia coli compared with other anaplerotic enzymes[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 103(6):2340-2345.

[29] XIA J， XU J X， HU L， et al. Enhanced poly(L-malic acid) production from pretreated cane molasses by Aureobasidium pullulans in fed-batch fermentation[J]. Preparative Biochemistry, 2016, 46(8):798-802.

[30] SAUER M， PORRO D， MATTANOVICH D， et al. Microbial production of organic acids: expanding the markets[J]. Trends in Biotechnology, 2008, 26(2):100-108.

[31] CHEN Y， NIELSEN J. Advances in metabolic pathway and strain engineering paving the way for sustainable production of chemical building blocks[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2013, 24(6):965-972.

[32] YIN X， Li J H， SHIN H D， et al. Metabolic engineering in the biotechnological production of organic acids in the tricarboxylic acid cycle of microorganisms: advances and prospects[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6):830-841.

[33] ZHANG T， GE C， DENG L， et al. C4-dicarboxylic acid production by overexpressing the reductive TCA pathway[J]. FEMS Microbiology Letters, 2015, 362(9):1-7.

[34] NEGORO H， KOTAKA A， MATSUMURA K， et al. Enhancement of malate-production and increase in sensitivity to dimethyl succinate by mutation of the VID24 gene in Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2016, 121(6):665-671.

[35] BROWN S H， BASHKIROVA L， BERKA R， et al. Metabolic engineering of Aspergillus oryzae NRRL 3488 for increased production of L-malic acid[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(20):8903-8912.

[36] MOON S Y， HONG S H， KIM T Y， et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of malic acid[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 40(2):312-320.

[37] SHIGEO A, AKIRA F, ICHIRO T K. Method of producing L-malic acid by fermentation:US635360A [P/OL].(1962-11-13)[2018-11-28]. http:∥www.freepatentsonline.com/3063910.html.

[38] BÉLAFI-BAK K, NEMESTThY N, GUBICZA L. A study on applications of membrane techniques in bioconversion of fumaric acid to L-malic acid[J]. Desalination, 2004, 162(1):301-306.

[39] LIU G L. Malic acid production using a biological electrodialysis with bipolar membrane[J]. Journal of Membrane Science, 2017, 523(6):122-128.

[40] ZHANG B H. Metabolic engineering for fumaric and malic acids production[D]. Ann Arbor: The Ohio State University, 2012.

[41] JAGER G， BUCHS J. Biocatalytic conversion of lignocellulose to platform chemicals[J]. Biotechnology Journal, 2012, 7(9):1122-1136.

[42] PALMQVIST E， HAHN-HGERDAL B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates I: inhibition and detoxification[J]. Bioresource Technology, 2000, 74(1):17-24.

[43] ALLEN S A， CLARK W， MCCAFFERY J M， et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biotechnology for Biofuels, 2010, 3(1):2.

[44] KIM S K， JIN Y S， CHOI I G， et al. Enhanced tolerance of Saccharomyces cerevisiae to multiple lignocellulose-derived inhibitors through modulation of spermidine contents[J]. Metabolic Engineering, 2015, 29:46-55.

[45] ABBOTT D A， ZELLE R M， PRONK J T， et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of carboxylic acids: current status and challenges[J]. Fems Yeast Research, 2010, 9(8):1123-1136.

[46] SINGH A， SOH K C， HATZIMANIKATIS V， et al. Manipulating redox and ATP balancing for improved production of succinate in E. coli[J]. Metabolic Engineering, 2011, 13(1):76-81.

[47] LIANG L， LIU R， WANG G， et al. Regulation of NAD(H) pool and NADH/NAD+ ratio by overexpression of nicotinic acid phosphoribosyl transferase for succinic acid production in Escherichia coli NZN111[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2012, 51(5):286-293.

Progress for Bio-Refinery of Malic Acid

JIANG Shaotong, LI Xingjiang*

(Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province/School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract： Being a top bio-derived value added chemical, malic acid is used widely in various industries including chemical engineering, food, and pharmaceutical. It is of great significance to produce malic acid by converting sustainable cellulosic raw materials. This review has introduced and summarized the malic acid bio-refinery process, which was inoculating the fermented raw materials, analyzing the main metabolic pathways of the fermented raw materials, identifying the key enzymes for malic acid production, and determining the malic acid metabolism improvement strategy. At the same time as the technical summary, the correlation between the internal metabolism of the transformed organism and the external conditions was analyzed, and the forward trend of malic acid biotransformation was proposed. The forward trend was simultaneous of saccharification and fermentation processes to improve transformation efficiency, improving and enhancing cell tolerances and fermentation adaptabilities, promoting co-fermentation of five-carbon sugars and six-carbon sugars, decreasing greenhouse effect and controlling energy balance. This review was expected to provide meaningful insight to the development of the malic acid bio-refinery industry.

Keywords： malic acid; biomass sugars; sour agents; valued chemicals; bio-refinery

中图分类号： TS201.2； TS201.3

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.02.001

文章编号：2095-6002(2019)02-0001-09

引用格式：姜绍通，李兴江.苹果酸生物炼制研究进展[J]. 食品科学技术学报，2019,37(2):1-9.

JIANG Shaotong, LI Xingjiang. Progress for bio-refinery of malic acid[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019,37(2):1-9.

收稿日期： 2018-11-29

基金项目： 国家重点研发计划项目(2018YFD0400404；2018YFD0400601)。

第一作者： 姜绍通，男，教授，博士生导师，主要从事农产品精深加工及其资源综合利用方面的研究。

*通信作者： 李兴江，男，教授，博士，主要从事发酵食品应用研究。

(责任编辑：叶红波)