纤维素是由β-D-葡萄糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，一般含有3 000～10 000个葡萄糖残基。通常将能水解裂纤维素的β-1,4-糖苷键的酶称为纤维素酶。纤维素酶按其催化作用特点分为三类：内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切-β-1,4-D-葡聚糖酶(EC 3.4.1.91)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。内切-β-1,4-D-葡聚糖酶也称为内切葡聚糖酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶，在纤维素的内部无定形位点随机切割β-1,4-糖苷键，产生各种长度的低聚糖；外切-β-1,4-葡聚糖酶也称外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、1,4-β-纤维二糖水解酶，水解纤维素或纤维四糖的β-1,4-糖苷键，从非还原性末端依次切下纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶也称龙胆二糖酶、纤维二糖酶、苦杏仁酶，可以将纤维二糖等纤维寡糖末端非还原端的β-D-葡萄糖残基水解，释放β-D-葡萄糖[1]。若将纤维素降解成最终产物β-D-葡萄糖，至少需要3种纤维素酶的共同作用。内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区，通过外切葡聚糖酶将其水解成纤维二糖和三糖，最后通过β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成β-D-葡萄糖。纤维二糖是内切酶和外切酶的抑制剂，通过加入β-葡萄糖苷酶可以有效降低抑制作用，提高纤维素降解率。

本研究克隆了巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii) CAU904 GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因并在大肠杆菌中表达，研究了重组β-葡萄糖苷酶(PbBglu3)的酶学性质，进一步解析了其晶体结构，初步阐明了其催化机制，希望为后续该酶的理性设计提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

ExTaq DNA Polymerase、PrimeSTAR HS DNA polymerase、限制性内切酶、低分子量标准蛋白质、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase(RNase H-)，购自TaKaRa公司；T4 DNA ligase，购自NEB公司；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒，购自北京博迈德公司；高纯质粒小量制备试剂盒，购自北京天根生化公司；Ni-IDA agarose，购自GE公司；薄层层析Gel Plate F254，购自Merck公司；大麦β-葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、桦木木聚糖、微晶纤维素、CMC、pNP-β-Xylopyranoside、pNP-α-Galactopyranoside、pNP-β-Galactopyranoside、pNP-β-Glucopyranoside、 pNP-α- Glucopyranoside，购自Sigma公司；纤维寡糖、昆布寡糖，购自Megazyme公司；结晶筛选试剂盒，购自Hampton公司。

巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904为本实验室筛选保藏；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)，购自北京博迈德公司；pET-28a(+)，购自Novagen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养和基因组DNA的提取

斜面培养基上活化的单菌落接入液体培养基，45 ℃摇瓶培养3 d，离心收集适量菌体(12 000 r/min，3 min)。基因组DNA 的提取采用CTAB法。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶基因克隆

根据巴伦葛兹类芽孢杆菌基因组(NZ_KE159654.1)中β-葡萄糖苷酶基因序列和表达载体pET-28a(+)的多克隆位点，设计正向引物BgluF：5’-TGACTGCTAGCATGAGCAAATCGATGTTAGGTG TT-3’(下划线处为NheⅠ酶切位点)；反向引物BgluR：5’-TGACTCTCGAGTTAAA TAAACTCGATCCACTCAATCTCC-3’ (下划线处为XhoⅠ酶切位点)。以基因组DNA为模板，PCR条件为94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s ；72 ℃ 3 min，34个循环后72 ℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。将目的片段连接至pMD-19T载体，热激转化E.coli DH5α，筛选阳性菌落，提取T/A克隆质粒，经酶切鉴定后，测序验证。将测序正确的重组质粒用NheⅠ和XhoⅠ酶切后，回收目的片段，连接至pET-28a(+)载体，转化E. coli BL21，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板筛选阳性转化子。

1.2.3 PbBglu3的诱导表达及纯化

挑取阳性转化子于10 mL LB(含50 μg/mL卡那霉素)培养基中，37 ℃振荡培养至对数生长期。以体积分数1%的接种量转接到300 mL相同培养基中，37 ℃振荡培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导培养20 h后，离心收集菌体。菌体用20 mL的缓冲液A(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)悬浮，超声破碎(200 W，破碎3 s，间歇4 s，破碎90次)3个循环。将破碎后的菌体离心(10 000 r/min，10 min)，收集上清液，即粗酶液。

PbBglu3采用Ni-IDA亲和层析进行纯化，将粗酶液以0.5 mL/min流速上样于经过缓冲液A预平衡的Ni-IDA层析柱。用缓冲液A以1 mL/min洗涤柱子至流穿液OD280小于0.05时，用缓冲液B液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH值8.0)进行洗脱，SDS-PAGE检测蛋白质纯度。

1.2.4 酶活力和蛋白浓度测定

酶活力测定：75 μL 15 mmol/L底物pNPG(蒸馏水配制)，加150 μL MOPS(morpholino propanesulfonic acid)(pH值6.5～8.0)缓冲液(50 mmol/L，pH值7.5)，50 ℃预热4 min后，加入25 μL适当稀释的酶液，50 ℃反应10 min，加750 μL的饱和硼酸钠溶液终止反应，冷却后测定OD405。

1个酶活力单位(U)定义：在实验条件下，每分钟生成的1 μmol pNP所需要的酶量。

蛋白含量的测定采用Lowry法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。

1.2.5 PbBglu3的最适pH值和pH值稳定性测定

最适pH值测定：50 ℃条件下，在pH值4.0～10.5的不同缓冲体系中测定酶活力。缓冲体系分别为Citrate(pH值4.0～6.0)、Acetate(pH值4.0～4.5)、Bis-Tris(bis-(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl) methane)(pH值5.5～7.5)、MOPS、HEPES(z-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)(pH值6.5～8.5)、Tris-HCl(pH值7.0～9.0)、CHES(N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid)(pH值8～10.5)，以酶活力最高点为100%。pH值稳定性测定是用不同缓冲体系将纯酶稀释适当倍数，50 ℃保温30 min，冰水浴中冷却30 min后， 按照标准方法测定残余酶活力，以未经处理的酶液为对照，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比。

1.2.6 PbBglu3的最适温度及温度稳定性测定

最适温度的测定是以50 mmol/L，pH值7.5 MOPS缓冲液将PbBglu3稀释适当倍数后，分别在不同温度下(30～80 ℃)测定酶活力，以酶活力最高点为100%。温度稳定性的测定是用同样的缓冲液将PbBglu3稀释适当倍数后，分别置于不同温度下处理30 min，冰水浴冷却30 min后，按照标准方法测定残余酶活力，以未经处理的酶液为对照，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比。

1.2.7 PbBglu3底物特异性测定

PbBglu3的底物特异性测定是以pNP-糖苷(pNP-α-D-galactoopyranoside、pNP-β-D-galactoopyranoside、 pNP-α-D-glucopyranoside、pNP-β-D-glucopyranoside、pNP-β-D-xylopyranoside)、低聚糖及糖苷类化合物(纤维寡糖、昆布寡糖、龙胆二糖、槐糖、乳糖、苦杏仁苷和水杨苷)和聚糖(桦木木聚糖、昆布多糖、地衣多糖、大麦葡聚糖、几丁质、羧甲基纤维素钠和结晶纤维素)为反应底物测定酶活力。酶活力测定方法为225 μL 5 mmol/L pNP-糖苷类底物，或10 mg/mL低聚糖及糖苷类化合物底物，或10 mg/mL聚糖类底物(均用50 mmol/L，pH值7.5 MOPS缓冲液配制)，50 ℃预热4 min后，加入25 μL适当稀释的酶液，50 ℃反应10 min，加750 μL的饱和硼酸钠溶液终止反应，冷却后分别测定OD410、葡萄糖(使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定)和还原糖(采用DNS法)。对于纤维二糖、龙胆二糖、昆布二糖和槐糖等二糖，1个酶活力单位(U)为，在测定条件下每分钟生成的2 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.8 PbBglu3的水解特性测定

采用TLC(薄层层析法)对PbBglu3水解纤维寡糖、昆布寡糖和昆布多糖生成的水解产物进行分析。在10 mg/mL水解底物 (用50 mmol/L，pH值7.5 MOPS缓冲液配制)中加入5 U/mL的PbBglu3，50 ℃反应2 h，定时取样，沸水浴煮沸5 min，终止反应。冷却后离心取上清液分析水解情况，展层剂为正丁醇∶水∶乙酸，三者体积比为2∶1∶1；显色剂为甲醇∶硫酸，体积比为95∶5。

1.2.9 PbBglu3的晶体筛选及结构解析

PbBglu3结晶初筛质量浓度为18 mg/mL，缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH值8.0。结晶试剂盒为Hampton Research公司的Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG/IonTM和SaltRxTM以及北京博亚结晶公司的BCR。采用坐滴气相扩散法进行结晶条件筛选和优化。

于上海同步辐射光源生物大分子线站收集X-射线衍射数据，使用HKL2000软件对数据进行前期处理。以Thermotoga neapolitana来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶TnBgl3B(PDB：2X40)为模板[2]，利用Phenix软件包进行分子置换[3]，得到PbBglu3初始结构。经Phenix.autobuilding重建，多轮COOT[4]手工调整与Phenix.Refine精修完善后获得最终的结构模型。

2 结果与讨论

2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达结果分析

利用引物BgluF和BgluR，扩增得到一条2 799 bp的片段。该基因编码932个氨基酸，预测无信号肽序列及理论分子量和等电点分别为102.2 kDa和5.02。经NCBI BLAST比对分析，该酶的氨基酸序列与来源于坎氏弧菌(Vibrio campbellii)的GH3家族β-葡萄糖苷酶(AJK27091.1)相似性最高，为59%。结构域分析显示，该PbBglu3含有GH3家族的特征结构域、一个FnⅢ型纤连蛋白结构域和一个CBM6结构域。

将该基因插入到pET-28a(+)载体NheⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达载体pET28-PbBglu3。重组载体转化入E. coil BL21(DE3)进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE检测能够可溶性表达。

2.2 PbBglu3的纯化结果分析

粗酶液经亲和层析得到电泳级纯酶，PbBglu3纯化结果见表1。由表1可知，PbBglu3纯化了15.9倍，回收率为57%，比酶活力为119.6 U/mg。该酶的比酶活力高于来源于Aspergillus ochraceus MTCC 1810[5] (4.60 U/mg)、Aspergillus terreus[6] (42.37 U/mg)、Aspergillus fumigatus Z5[7] (101.7 U/mg)和Myceliophthora thermophila[8] (97.7 U/mg)的β-葡萄糖苷酶的比酶活力，但低于来源于Thermotoga naphthophila RUK-10[9] (2 851.7 U/mg)、Talaromyces leycettanus JCM 12802[10] (905 U/mg)、Penicillium purpurogenum KJS506[11] (857 U/mg)和Neurospora crassa[12] (143.27 U/mg)的β-葡萄糖苷酶的比酶活力。

表1 PbBglu3纯化结果

Tab.1 Purification summary of PbBglu3

纯化步骤总酶活力/Um(总蛋白)/mg比酶活力/(U·mg-1)纯化倍数回收率/%粗酶液1373.8182.87.51100Ni-IDA789.46.6119.615.957

2.3 pH值对PbBglu3酶活力和稳定性的影响

pH值对PbBglu3的酶活力和稳定性影响结果见图1。图1(a)中，PbBglu3的最适pH值为7.5，在pH值4.5～9.0范围内处理30 min，可以保持80%以上的酶活力(图1(b))，表现出良好的pH值稳定性。大多β-葡萄糖苷酶的最适pH值偏酸性，而本研究中β-葡萄糖苷酶与Paenibacillus sp. C7 [13]和Bacillus sp.[14]的β-葡萄糖苷酶特性相似，具有偏碱性的最适pH值。这一特性使其在洗涤剂、化妆品和酿酒等行业中具有潜在应用价值。

柠檬酸缓冲液(●)，乙酸缓冲液(×)，Bis-Tris缓冲液(◆)，MOPS缓冲液(▲)，Tris-HCl 缓冲液(□)，HEPES缓冲液(■)，CHES缓冲液(△)。
图1 pH值与PbBglu3的酶活力及稳定性的关系
Fig.1 Effect of pH on activity and stability of PbBglu3

2.4 温度对PbBglu3酶活力和稳定性的影响

温度对PbBglu3酶活力和稳定性影响结果见图2。图2(a)中，PbBglu3的最适温度为50 ℃。在温度不高于50 ℃条件下均很稳定，残余酶活在95%以上，当温度高于50 ℃时酶活力迅速下降(图2(b))。大多β-葡萄糖苷酶的最适温度和温度稳定性普遍在40～100 ℃。该酶的最适温度与来源于Mucor circinelloides NBRC 4572的β-葡萄糖苷酶(50 ℃)一致[15]，但是显著低于Thermofilum pendens β-葡萄糖苷酶(90 ℃)[16]。PbBglu3的最适温度处于中等水平，温度稳定性并不突出。

2.5 PbBglu3的底物特异性分析

PbBglu3底物特异性分析结果见表2。表2表明，对于pNP糖苷类底物，PbBglu3对pNP-β-D-glucopyranoside表现出很高的活性，同时对pNP-β-D-xylopyranoside有较弱的水解活性，但对pNP-α-D-glucopyranoside、pNP-α-D-galactopyranoside和pNP-β-D-galactopyranoside没有水解活性。对于低聚糖及糖苷类化合物底物，该酶对纤维二糖(β-1,4-糖苷键连接)、纤维三糖(β-1,4-糖苷键连接)、纤维四糖(β-1,4-糖苷键连接)、昆布二糖(β-1,3-糖苷键连接)、昆布三糖(β-1,3-糖苷键连接)、龙胆二糖(β-1,6-糖苷键连接)、槐糖(β-1,2-糖苷键连接)、苦杏仁苷(β-1,6-糖苷键连接)和水杨苷(β-1,4-糖苷键连接)均具有活性，但没有乳糖水解活性。对于聚糖类底物，该酶对昆布多糖、大麦葡聚糖和地衣多糖均具有一定的水解活性，对木聚糖、几丁质、羧甲基纤维素钠和结晶纤维素没有水解活性。大麦葡聚糖是由纤维三糖或纤维四糖通过β-1,3-糖苷键连接成的分支多糖，地衣多糖是由纤维三糖分子以β-1,3-糖苷键连接成的直链多糖，而昆布多糖则是通过β-1,3和β-1,6-糖苷键连接形成的分支多糖。由此可知，PbBglu3能够作用于β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6等多种糖苷键，因此PbBglu3属于第三类底物特异性较宽的β-葡萄糖苷酶。

图2 温度与PbBglu3的酶活力及稳定性的关系
Fig.2 Effect of temperature on activity and stability of PbBglu3

表2 PbBglu3的底物特异性

Tab.2 Substrate specificity of PbBglu3

底物比酶活力/(U·mg-1)相对酶活力/%糖苷类化合物pNP-β-D-glucopyranoside119.6100pNP-α-D-glucopyranosideNDNDpNP-β-D-galactopyranosideNDNDpNP-α-D-galactopyranosideNDNDpNP-β-D-xylopyranoside2.31.9糖苷和低聚糖Cellobiose(纤维二糖)8.87.6Cellotriose(纤维三糖)9.07.7Cellotetraose(纤维四糖)21.918.9Laminaribiose(昆布二糖)3.93.3Laminaritriose(昆布三糖)16.213.9Gentiobiose(龙胆二糖)10.510.5Sophorose(槐糖)4.64.0Amygdalin(苦杏仁苷)7.46.2Salicin(水杨苷)6.85.7Lactose(乳糖)NDND聚糖Laminarin(昆布多糖)8.06.9Barley glucan(大麦葡聚糖)4.74.0Lechnin(地衣多糖)4.84.0Xylan(木聚糖)NDNDChitin(几丁质)NDNDCarboxymethylcellulose sodium(羧甲基纤维素钠)NDNDAvicel(结晶纤维素)NDND

2.6 PbBglu3的水解特性分析

PbBglu3水解特性分析结果见图3。图3表明，PbBglu3对纤维寡糖(聚合度2- 4)、昆布寡糖(聚合度2- 4)、地衣多糖、大麦葡聚糖和昆布多糖的最终产物都是葡萄糖。PbBglu3水解多糖的过程中只有单糖生成，说明其具有外切β-1,3-葡聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。

M：标准；G：葡萄糖；G2：纤维二糖；G3：纤维三糖；G4：纤维四糖；L2：昆布二糖；L3：昆布三糖；L4：昆布四糖。
图3 PbBglu3水解产物分析
Fig.3 TLC analysis of hydrolysis products by PbBglu3

2.7 PbBglu3的晶体结构分析

图4 PbBglu3的总体结构、结构域分析及其比较
Fig.4 Analysis of overal structure and structure domain of PbBglu3, and structure comparison with other β-glucosidase

PbBglu3晶体结构解析结果见图4。PbBglu3晶体空间群为P212121，衍射数据最终分辨率为1.73 Å。 PbBglu3的总体结构如图4(a)。图4(a)中，每个不对称单元(ASU)中含有一个蛋白分子，呈现GH3家族典型的多结构域结构，类似 (α/β)5的三明治结构域、FnⅢ结构域、(β/α)8折叠桶结构域和CBM6结构域。该酶的结合位点位于折叠桶结构域和三明治结构域的中间，其催化氨基酸E168和D747分别位于这两个结构域。该酶形成一个催化口袋(图4(b))，能够特异性地结合糖链的非还原端。与GH3家族的另一个结构已经解析的β-葡萄糖苷酶TnBgl3B[2]不同的是，该酶的(β/α)8折叠桶结构域被移到了C端，紧接着CBM6结构域(图4(c))。该CBM6结构域的存在对底物的结合具有一定的影响，它们的空间相对位置依然保守，只是形成了一段较大的linker，由两个反向平行的β-折叠卷构成(图4(d))。相对于其他β-葡萄糖苷酶较短的linker，该酶在此对应区域具有较大的柔性，有利于酶催化过程中(α/β)5的三明治结构域和FnⅢ结构域之间发生移动，使酶能够与底物更好结合在一起。分析发现，芳香氨基酸残基Trp748侧链提供-1位结合位点，Trp749提供+1位结合位点，Trp131提供+2位结合位点，这些位点的存在形成了一个小的口袋和疏水环境，不利于转糖苷反应的进行，这在结构上也解释了PbBglu3转糖苷作用弱的原因。

3 结 论

从巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904中克隆表达得到一个GH3家族β-葡萄糖苷酶(PbBglu3)，该酶与来源于Vibrio campbellii GH3家族β-葡萄糖苷酶的同源性最高，为59%。PbBglu3的最适pH值为7.5，最适温度为50 ℃。该酶具有较宽的底物特异性范围，能够水解β-1,2、β-1,3、β-1,4、β-1,6-糖苷键等多种类型糖苷键。PbBglu3还能够水解昆布多糖、大麦β-葡聚糖和地衣多糖，产物均为β-D-葡萄糖。通过X-射线晶体衍射法解析了PbBglu3的晶体结构，结构信息显示其含有4个结构域，同时解释了该酶转糖苷作用弱的结构基础。

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Expression, Biochemical Characterization and Structure Resolution of β-Glucosidase from Paenibacillus barengoltzii

HUANG Ping, WU Shiwang, JIANG Zhengqiang, YANG Shaoqing*

(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract： A β-glucosidase gene from Paenibacillus barengoltzii CAU904 was cloned and heterologously expressed in E. coli. The recombinant enzyme was purified and biochemically characterized, and its crystal structure was further resolved. The enzyme had the highest activity at 50 ℃ and pH 7.5. It exhibited broad substrate specificity on various substrates, including laminarin, barley β-glucan, lichenan, et al. (containing β-1,2,β-1,3,β-1,4 and β-1,6 linkages). Crystal structure analysis revealed that the enzyme exhibited typical glycoside hydrolyase family 3 enzymes, having multiple domain structures. The catalytic packet of the enzyme was composed by a (α/β)5 sandwich domain and a (β/α)8 folding barrel domain linked by a loop region. The side chain aromatic amino acids Trp748 and Trp749 were functioned as -1 and +1 binding site, respectively, while Trp131 was functioned as +2 site. These aromatic amino acids formed a narrow pocked and a hydrophobic environment, which could diminish its transglycosylation activity.

Keywords： Paenibacillus barengoltzii; β-glucosidase; heterologous expression; biochemical characterization; crystal structure

中图分类号： TS201.3; Q814

文献标志码：A

收稿日期： 2018-12-28

基金项目： 国家自然科学基金面上项目(31571774)。

第一作者： 黄 平，男，博士研究生，研究方向为酶晶体结构。

*通信作者： 杨绍青，男，教授，博士，主要从事食品酶的发掘、特性、结构解析及分子改造等方面的研究。

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.01.004

文章编号：2095-6002(2019)01-0020-08

引用格式：黄平，吴世旺，江正强，等. 巴伦葛兹类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的表达、酶学性质及结构解析[J]. 食品科学技术学报，2019,37(1):20-27.HUANG Ping, WU Shiwang, JIANG Zhengqiang, et al. Expression, biochemical characterization and structure resolution of β-glucosidase from Paenibacillus barengoltzii[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019,37(1):20-27.

(责任编辑：叶红波)