厌氧发酵产甲烷受多种因素的影响，微量元素、发酵温度、有机负荷、污泥浓度是其中主要的4个因素。微量元素会作为辅酶、辅基、辅因子的成分在微生物的酶系统中对产甲烷阶段起调控作用[1-2]。Ni、Co、Fe是所需的重要微量元素，Ni是产甲烷菌细胞中F430的唯一金属成分[3]；Co是酶F420的金属成分，促进微生物细胞的生物合成和产甲烷过程，激活厌氧发酵过程中关键酶F420的活性[4]；Fe不仅参与厌氧微生物体内细胞色素、细胞氧化酶的合成，而且是胞内氧化还原反应的电子载体[5]。温度是影响微生物生长代谢以及酶活性的重要因素，理论上来说温度在10～60 ℃，沼气池均能正常发酵产气[6-10]。有机负荷是厌氧发酵的重要影响因素，沼气和甲烷产量随着有机负荷的增加而增加[11-12]。此外，反应体系中的污泥浓度也是影响厌氧发酵的关键因素，接种污泥的数量、活性和性质很大程度上影响着启动速度甚至反应器运行的成败[13]。

近年来，我国大豆深加工产业发展迅速，相应地产生了大量的高浓度有机废水，该废水具有易腐败、有机物浓度高、氮磷含量高等特点[14]；此外该废水可生化性好，适于采用厌氧生物处理。现阶段大豆废水研究主要侧重于反应器形式、COD的去除[15-17]，缺少对该废水厌氧处理过程中甲烷产量的报道，而产甲烷量是困扰大豆废水厌氧发酵技术中的关键问题。本研究以大豆废水为研究对象，研究在厌氧发酵处理过程中提高甲烷产量的优化工艺条件，期望在去除污染物的同时回收更多的能量，创造更高的经济效益。

1 材料与方法

1.1 实验材料

接种颗粒污泥：取自山东省潍坊市昌乐县某公司IC反应器中的颗粒污泥，静置去除上清液，4 ℃保存备用。污泥呈亮黑色，近球形或椭球形，粒径主要分布在0.45～2.00 mm，污泥挥发性悬浮物(VSS)约75 g/L、总固体(TS)约107 g/L，总固体占污泥样品13.20%，灰分占总固体34.40%，性能良好。

废水模拟：通过实验室模拟代替实际工程废水。使用豆浆机将称量、泡好的大豆打碎，充分溶解在水中，用150目尼龙砂过滤，取其过滤液作实验用水。

1.2 主要仪器

GC7900型气相色谱仪，上海天美科学仪器有限公司；5B- 1型COD快速分析仪，上海连华科技公司；雷磁pHs- 25型数显pH计，上海重逢科学仪器有限公司；GC9790型气相色谱仪，浙江福立分析仪器股份有限公司；DHG- 9075A型电热鼓风干燥箱，上海雷韵试验仪器制造有限公司。

1.3 实验装置

实验装置(如图1)是由500 mL的厌氧发酵瓶，1 L的集气瓶和500 mL的量筒组成。每个发酵瓶在装入400 mL不同的反应物质后，均要充氮气以维持发酵瓶内的厌氧环境，分别放入恒温振荡水浴器中，调节不同的温度和相同的转速。发酵瓶中产生的气体经过玻璃导管进入充满饱和食盐水的集气瓶，排出的食盐水体积通过量筒计量即为沼气产量。

1—取样口； 2—振荡水浴器； 3—发酵瓶； 4—集气瓶； 5—量筒。
图1 实验装置图
Fig.1 Diagram of experimental device

1.4 实验方法

1)正交试验。采用L9(34)正交表，选定微量元素(Fe、Co、Ni)、发酵温度、有机负荷和污泥浓度为考察因素，进行4因素3水平正交试验。以甲烷的产量为评价指标，且不考虑因素之间的交互作用，因素水平见表1。

微量元素Fe、Co、Ni的加入量均使反应体系中浓度控制在1 mg/L；有机负荷是通过高浓度废水按照一定的稀释比获得，实测的COD浓度依次为7 600、4 300、3 170 mg/L；通过接种不同体积的颗粒污泥控制污泥浓度；发酵温度通过调节不同水浴锅的温度来实现，温度变化在±1 ℃。

表1 正交试验因素水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

水平A BCDρ(微量元素)/(mg·L-1)t(发酵)/℃有机负荷/(kg COD· m-3·d-1)污泥浓度/(g VSS·L-1)1 Fe(1)351.5211.252 Co(1)400.8620.633 Ni(1)450.6330.00

2)工艺条件优化实验。通过正交试验分析，得出较适宜条件组合，与正交试验9组实验条件组合对比。如果分析所得的优化组合是9组实验中的某一组条件，则不需要再进行验证优化。

1.5 测定指标

1)沼气产量测定：采用排饱和食盐水方法记录不同条件下的沼气产量。

2)甲烷含量测定：采用气相色谱法。色谱柱：TDX-01碳分子筛填充柱(2 m×3 mm)，检测器：热导检测器(TCD)，载气：高纯N2，流速30 mL/min，色谱条件：进样口温度150 ℃，检测器温度150 ℃，柱温：80 ℃，柱前压：0.3 MPa，每次进样量：1 mL。

3)SCOD值测定：采用COD快速分析仪测定。

4)VSS、TS测定:采用重量法测定。

5)pH值测定：采用pHs-25型数显pH计测定。

6)总挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFAs)组分和含量测定：采用气相色谱法测定。色谱条件：色谱柱采用KB-Wax 30 m×0.25 mm×0.25 mm毛细管柱，氢火焰离子化检测器(FID)，分流比20∶1。载气为高纯氮气，柱前压0.3 MPa。进样口和检测器温度分别为200、260 ℃，进样量1 μL。柱温采用程序升温，初始温度80 ℃，保留2 min，以升温速率20 ℃/min，逐渐升到120 ℃，再以10 ℃/min逐渐升到190 ℃，保留2 min。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

根据实验设计安排，记录9组实验的沼气产量，每隔0.5 d记录一次，反应进行一周左右，当日产气量接近零、SCOD值变化趋于稳定，可认为发酵反应结束。

2.1.1 VFAs、pH值动态分析

甲烷产量与VFA、pH值的变化有着密切的关系。VFAs是厌氧消化过程中有机质水解酸化的主要产物，同时也是产甲烷菌所利用底物，因此常常作为评价水解酸化和产甲烷是否平衡的重要指标[18]。pH值是影响酶活性的重要因素，微生物又直接受到酶活性的影响[19]，而pH值波动主要受到VFAs浓度、CO2的分压和总碱度的影响。研究中考察了9组实验的VFAs含量变化，结果如图2。由图2可以看出，不同反应条件的VFAs含量(以SCOD计)变化趋势相似，均是先迅速增加后降低并慢慢趋于稳定。在反应开始0.5 d后，9组VFAs都达到了最高值，一方面是因为反应初始废水中的大分子有机物为水解菌及产酸菌提供丰富的营养物质，其代谢能力较强；另一方面也可能是因为污泥表面带负电荷，而本实验所用大豆废水偏碱性(pH=8.87)负电荷较多，会使胞外聚合物解析出来，从而加速蛋白质水解产酸。

图2 发酵过程中9组实验的VFAs含量变化
Fig.2 Changes of VFAs content in 9 groups of
experiments during fermentation

考察了发酵过程中9组日甲烷产量变化，结果如图3。由图3可知，随着反应的进行，大豆蛋白的水解产酸能力逐渐减弱，产甲烷菌的代谢能力增强，VFAs被迅速利用，1 d后9组反应的日甲烷产量均达到峰值，之后产气量下降，直至反应结束。

图3 发酵过程中9组实验的日甲烷产量变化
Fig.3 Changes in daily production of methane in 9 groups of experiments during fermentation

从9组反应中挑出一组累积产气量最大的进行VFAs的组分、pH值变化分析，以第4组反应为例。考察了第4组VFAs、VFAs组分(乙酸、丙酸、丁酸)以及pH值变化，结果如图4。由图4可以看出，乙酸含量先增加后降低，之后趋于稳定，和VFAs变化一致，且乙酸始终在VFAs组分中占比最大，丙酸含量始终最低，且有逐渐降低的趋势，这说明系统中的环境适合产甲烷菌的生长。运行1 d后，达到最低点，此时VFAs为175.77 mg/L，乙酸占62.72%，丙酸占15.34%，反应器向着有利于产甲烷方向稳定运行。在整个反应过程中VFAs基本在300 mg/L以下，没有造成系统VFAs积累，这说明成熟厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌活性比较强, 酸性末端产物能被产甲烷菌及时有效分解。

图4 第4组VFAs、VFAs组分以及pH值变化
Fig.4 Changes of group 4 VFAs, VFAs
composition and pH

第4组反应器内pH值先迅速降低后缓慢升高，最后逐步达到相对稳定，与VFAs变化趋势类似。在反应进行的0.5 d后，大分子有机物被大量分解，产酸量上升，pH值降至6.75。随着反应器中VFAs、氢气被利用以及过程中还产生一定数量的碱度，使得pH值升高并稳定在7.00～7.30，说明此阶段水解酸化与产甲烷过程处在一个平衡状态，该组累积甲烷产量明显高于其他几组。

2.1.2 甲烷产量分析

正交试验数据记录结果见表2，以甲烷产量为目标，采用极差法对实验结果进行分析，见表3。

表2 正交试验结果

Tab.2 Results of orthogonal experiment

实验号A微量元素Bt(发酵)/℃C有机负荷/(kg COD·m-3·d-1)D污泥浓度/(g VSS·L-1)V(CH4)/mLρ(SCOD)/(mg·L-1)1 Fe351.5211.25614343.02 Fe400.8620.63551227.03 Fe450.6330.00584354.54 Co401.5230.00843222.05 Co450.8611.25692178.06 Co350.6320.6341199.77Ni451.5220.63567427.58 Ni350.8630.00503165.09 Ni400.6311.25253196.0

Fe、Co、Ni的质量浓度均为1 mg/L。

表3 以甲烷产量为目标的正交试验极差分析

Tab.3 Range analysis of orthogonal experiments with methane production as target

实验号ABCDK1582.78509.33674.58519.59K2648.55549.05581.94509.85K3441.34614.28416.14643.23极差R207.21104.96258.44123.64

K1，K2及K3均为平均值。

分析表3、表4，得出结论：

1)由表3中极差的大小可以直观判断出各因素对甲烷产量影响的主次顺序为：有机负荷(C)、微量元素(A)、污泥浓度(D)、温度(B)。

2)由于本次正交试验的正交设计时空列没有设置，选择4因素中偏差平方和最小者为误差列，方差分析见表4。由表4可知，4个因素的偏差平方和中，温度这一项的偏差平方和明显偏小，所以选用温度的偏差平方和作为误差平方和，温度的偏差平方和对应的自由度为误差平方和的自由度。

表4 累积甲烷产量的方差分析

Tab.4 Cumulative variance analysis of methane production

方差来源偏差平方和自由度F比F临界值显著性微量元素67264.6323.9929.000温度16849.0621.0009.000有机负荷102862.0726.1059.000污泥浓度33173.6621.9699.000误差16849.062

由表4可知，F比均小于F0.10，有90%的把握，说明4种因素水平的改变对甲烷产量的影响无显著差异，但是，有机负荷与另外3种因素相比，其影响的显著性较为突出。

3)大豆废水厌氧发酵产甲烷的因素优化工艺条件组合为A2B3C1D3，即Co 1 mg/L、发酵温度45 ℃、有机负荷1.52 kg COD/(m3·d)、接种污泥浓度30.00 g VSS/L。

2.2 工艺优化结果分析

正交试验结果表明，优化条件组合为A2B3C1D3，与9组实验中产甲烷量最大的第4组条件组合并非一致，故需进行优化实验。实验分两组进行，一组条件组合为：Co 1 mg/L，发酵温度40 ℃，有机负荷1.52 kg COD/(m3·d)，接种污泥浓度30.00 g VSS/L，记为甲组；另一组为：Co 1 mg/L，发酵温度45 ℃，有机负荷1.52 kg COD/(m3·d)，接种污泥浓度30.00 g VSS/L，记为乙组。

考察了日甲烷产量、甲烷含量变化，结果如图5。由图5可知，反应初始乙组甲烷产量明显高于甲组，甲、乙组的沼气产量在第1天均达到最高点，分别为0.44、0.58 L/d。这是由于接种污泥中的微生物群落结构稳定，乙组温度较高，进一步增强了产甲烷菌等有益微生物的活性，处理效率提高，另外温度的升高可以杀灭寄生虫和大肠杆菌等[20-21]。随着反应的进行(2 d后)，有机物被大量消耗，出现营养相对缺乏而导致生存竞争。甲、乙两组微生物的代谢能力均会降低，但甲组的稍慢，所以会出现第3、4、5 d日甲烷产量超过乙组的现象。甲、乙组的沼气产量在第7天达到最低点，分别为0.012、0.032 L/d，此时可认为反应器内的大豆废水已接近不再产沼气。

由图5可知，甲、乙两组沼气中的甲烷含量变化趋势基本相似，都是先增加后降低，2 d后含量变化趋于稳定值。发酵初始，甲、乙两组甲烷含量均增加，1 d后到达最高点，分别为82.82%、84.12%。乙组相对甲组甲烷含量有小幅提升，是因为有机物充足，温度越高，有机物分解越快，所获得的甲烷含量也越高[22]。随着蛋白质的水解，产甲烷菌大量增殖，彼此会有相互竞争；另一方面，有机物的水解产酸以及体系中产生的CO2溶解产酸均会对产甲烷菌产生抑制。

图5 甲、乙两组日CH4产量、CH4含量变化
Fig.5 Changes of dailymethane production and methane
contents in two groups

由于接种的IC反应器中成熟的颗粒污泥是中温发酵型微生物，当发酵温度在35～45 ℃时产甲烷菌的活性高，故最终甲烷含量可以稳定在70%以上。如果继续升高温度，进行高温发酵将不再是优化条件，因为高温发酵产生杂质气体比较多，一方面阻碍了发酵反应的正常运行；另一方面高温代谢产生的副产物，如氨气、硫化氢等的积累对产甲烷菌有一定的毒害作用[23]，在一定程度上抑制了微生物的代谢生长，从而影响了甲烷产量。

整个反应周期，乙组累积甲烷产量970 mL，比优化前提升了15.10%，累积甲烷产率达344.49 mL/(g SCOD)，比优化前(293 mL/(g COD))提高了17.56%，略低于理论甲烷产率350 mL/(g COD)。Zhu等[24]利用ABR反应器处理大豆废水，将其产气情况换算后得到甲烷产率在165.4～226.33mL/(g SCOD)，与其相比有较大提升；此外实验的SCOD去除率达到了84.00%，故乙组为大豆废水厌氧发酵的优化工艺条件组合。

3 结 论

1)通过4因素3水平正交试验对大豆废水厌氧发酵的影响因素进行分析，实验结果表明，其主次顺序为：有机负荷、微量元素、污泥浓度、温度。

2)依据正交试验结果对实验的工艺条件进行优化，在组合Co 1 mg/L、发酵温度45 ℃、有机负荷1.52 kg COD/(m3·d)、接种污泥浓度30.00 g VSS/L的条件下，最大累积甲烷产率为344.49 mL/(g SCOD)，相比未优化条件组合提高17.56%，甲烷含量最高为84.12%，SCOD去除率可达84.00%。

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Parameter Optimization of Methanogenesis of Soybean Wastewater

TANG Renshi, ZHANG Yanping*, CAI Xiaoyang, WANG Xin

(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract： In order to improve the methane production in the process of soybean wastewater degradation, effects of the trace elements,fermentation temperature, organic loading rate, and sludge concentration on the amount of methane produced by anaerobic fermentation of soybean wastewater were studied by the orthogonal experiment. Meanwhile, the effecting order of the factors and optimal technological conditions were confirmed. The results showed that the factors which had the greatest influence on the methane production were organic loading rate, followed by the addition of trace elements and sludge concentration, and the fermentation temperature had the least effect. The optimized combination of technological conditions was as follows: 1 mg/L Co, fermentation temperature 45 ℃, organic loading rate 1.52 kg COD/(m3·d), and the sludge concentration was 30.00 g VSS/L. Under this condition, the cumulative methane production was up to 970 mL, which was increased about 15.10%. While the cumulative methane yield, the methane content in the biogas,and the removal rate of soluble chemical oxygen demand (SCOD) were 344.49 mL/(g SCOD), 84.12%, and 84.00%, respectively.

Keywords： soybean wastewater； anaerobic fermentation； methane production; organic degradation; process optimization

中图分类号： TS210.9

文献标志码：A

收稿日期： 2018-04-19

基金项目： “十二五”国家科技支撑计划项目( 2014BAC28B01)；北京工商大学学科建设与研究生教育专项项目(2017XWYJS019)。

作者简介：

唐仁士，男，硕士研究生，研究方向为污水厌氧发酵产沼气；

*张艳萍，女，副教授，博士，主要从事水污染控制理论与应用方面的研究，通信作者。

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.05.015

文章编号：2095-6002(2018)05-0099-07

引用格式：唐仁士， 张艳萍， 蔡晓阳， 等. 大豆废水厌氧发酵产甲烷工艺条件优化[J]. 食品科学技术学报，2018,36(5):99-105.

TANG Renshi, ZHANG Yanping, CAI Xiaoyang, et al. Parameter optimization of methanogenesis of soybean wastewater[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,36(5):99-105.

(责任编辑：叶红波)