DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.03.007
中图分类号:TS207.3
利用理化参数鉴别掺假蜂蜜
岳锦萍1， 高寒1， 王丹丹1， 李强2， 任虹1
| 【作者机构】 | 1北京工商大学食品学院/北京市食品风味化学重点实验室/食品添加剂与配料北京市高等学校工程中心/食品质量与安全北京实验室； 2陆军勤务学院训练基地 |
| 【分 类 号】 | TS207.3 |
| 【基 金】 | 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA09Z411) 北京市教委面上项目(SQKM201610011005) |
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利用理化参数鉴别掺假蜂蜜
摘 要： 利用几种理化参数快速、准确鉴别蜂蜜与糖浆。以北方地区常见的17种蜂蜜和10种糖浆为研究对象，通过理化参数(水分、多酚、黄酮含量、pH值、蛋白质含量及分子质量范围、单糖含量比等)分析蜂蜜和糖浆的异同。为了提高果糖和葡萄糖的分辨率，采用氨基色谱柱，在流动相的选择上进行了优化。结果显示，pH值、多酚含量、黄酮含量无明显区别。水分含量、单糖含量比、蛋白质含量及其分子质量范围有区别：1)蜂蜜、糖浆的w(水)范围分别为15.13%～19.88%、 22.13%～28.50%；2)蜂蜜、糖浆的果糖与葡萄糖质量分数比分别为0.95～1.50、 0.13～2.80；3)蜂蜜中w(蛋白质)范围为1.12～5.09 μg/g，分子质量范围为45.0～116.0 kDa，糖浆中不含蛋白质。将蛋白质含量测定与蛋白质分子质量测定相结合，增强了通过蛋白质鉴别真假蜂蜜的说服力。水分含量、果糖与葡萄糖质量分数比、蛋白质含量及分子质量可作为掺假鉴别的指标，为蜂蜜的掺假鉴别提供理论依据。
关键词： 蜂蜜； 糖浆； 理化指标； 掺假； 真伪鉴别
蜂蜜作为一种营养价值高的天然甜味物质，近年来国内外市场需求量大增，蜂蜜供不应求，价格大幅上涨，一些不法分子开始制造、兜售假蜂蜜[1-3]。目前市场上主要的掺假方式是向蜂蜜中添加糖浆如高果糖浆、大米糖浆等[3]。蜂蜜掺假现象严重，已成为社会关注的焦点[4-5]。
目前，国内外真假蜂蜜检测技术有差示扫描量热(DSC)法、核磁共振(NMR)法、色谱光谱法等[6-8]。陈梅兰等[9]利用官能团保留指数法鉴别掺淀粉糖浆的假蜂蜜，结果显示，掺假蜂蜜及部分市售蜂蜜样品均出现相同的官能团保留指数值，而纯蜂蜜样品不存在此现象。赵杰文等[10]利用荧光光谱法对掺大米糖浆的蜂蜜进行鉴别，利用PCA进行数据分析，从而实现蜂蜜的鉴别。Megherbi等[11]采用高效离子交换色谱- 脉冲安培检测器检测掺假蜂蜜，对玉米糖浆的最低检出限为1%。但是，这些方法大多利用单一指标进行检测，耗时多、设备贵。如何简单、快速地综合区分蜂蜜与糖浆是目前蜂蜜真伪鉴别的主要任务。
文章检测了我国北方地区常见的17种蜂蜜和10种糖浆的理化参数，使用主成分分析法对数据进行处理，建立了简单、快速、准确、综合的蜂蜜掺假鉴别方法。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
17种蜂蜜和10种糖浆由同仁堂蜂业有限公司提供，见表1。
表1 蜂蜜和糖浆样品
Tab.1 Varieties of honey and syrup
序号品种1同仁堂椴树蜂蜜2同仁堂益母草蜂蜜3同仁堂枇杷蜂蜜4同仁堂荆条蜂蜜5同仁堂枣花蜂蜜6同仁堂五味子蜂蜜7同仁堂洋槐蜂蜜8同仁堂党参蜂蜜9同仁堂黄芪蜂蜜10同仁堂枸杞蜂蜜11河南林州洋槐蜂蜜12河南新乡洋槐蜂蜜13河南辉县荆条蜂蜜14新疆向日葵蜂蜜序号品种15新疆油菜花蜂蜜16新疆薰衣草蜂蜜17山西山远枣花蜂蜜18糖浆S131017-119糖浆S131017-320糖浆S131017-521糖浆S131017-722糖浆A201519523糖浆A201519624糖浆A201519725糖浆A201519826糖浆A201519927江西南昌糖浆
1.2 实验试剂
无水乙醇、乙腈、芦丁、盐酸、乙酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、牛血清蛋白、考马斯亮蓝、没食子酸，均为分析纯。
1.3 实验仪器
RE- 5205型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司； BIO- RAD型蛋白质电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；TD5A型离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；754PC型紫外分光光度计，上海菁华科技仪器公司。
2 实验方法
2.1 葡萄糖、果糖和蔗糖含量测定
2.1.1 色谱条件
Waters NH2氨基色谱柱：4.6 mm×250 mm,5.0 μm。流动相:A为乙腈(体积分数0.4%乙酸),B为超纯水(体积分数0.4%乙酸)。流速0.5 mL/min，柱温45 ℃，检测温度35 ℃，进样量5 μL。
2.1.2 标准溶液的配制
配制17 mg/mL的葡萄糖标准溶液，20 mg/mL的果糖和蔗糖标准溶液。分别从3种标准溶液中吸取200 μL，配置成混合标准液。
2.2 蛋白质含量及分子质量的测定
标准曲线绘制[12]：分别吸取1 mg/mL牛血清蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08 mL和0.10 mL于6支试管中，各加水至0.10 mL，再加入5 mL考马斯亮蓝G- 250溶液，室温放置2 min，在595 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
样品蛋白质含量测定：样品1.0 g溶于2.0 mL蒸馏水，准确吸取样品溶液0.1 mL，按上述步骤测定。
样品蛋白质分子质量测定：参照张龙翔等[13]的方法,将样品与0.1 mol/L pH值8.0的Tris-HCl缓冲液按1∶4比例混合均匀，加入质量分数85%的硫酸铵，在冰箱保鲜室中放置8 h左右，离心(18 000r/min，10 min)，弃上清液，再用0.1 mol/L pH值8.0的Tris缓冲液溶解沉淀，置于4 ℃备用。
2.3 多酚含量的测定
标准曲线绘制[14]：吸取100 μg/mL没食子酸标准溶液0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL后，分别加入150 μL稀释10倍的福林酚试剂，震荡均匀后再加入2.2 mL 0.02 g/mL Na2CO3 溶液，最后定容至2.5 mL。置于暗室30 min后在720 nm波长下测量吸光度。重复测定3次，绘制标准曲线。
样品多酚含量测定：配置质量浓度为0.1 g/mL的样品溶液，按上述步骤测定。
2.4 黄酮含量的测定
标准曲线绘制[15]：配置质量浓度为0.4 mg/mL芦丁标准溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL芦丁标准溶液于6个玻璃小瓶中。加入0.3 mL 0.05g/mL NaNO2溶液，混匀静置5 min后加入0.3 mL 0.1 g/mL AlCl3溶液，静置6 min，加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液，定容至4.0 mL。在510 nm波长下测定其吸光度。重复测定3次，绘制标准曲线。
样品黄酮含量测定：配置质量浓度为0.5 g/mL的样品溶液，按上述步骤测定。
2.5 水分含量的测定
采用真空干燥法[16]测定水分含量。
2.6 pH值的测定
称取10 g样品于洁净的玻璃烧杯中，用75 mL蒸馏水溶解样品，待仪器读数稳定后记录读数。重复测定3次。
2.7 主成分分析
使用SPSS statistics 19进行数据分析。
3 结果与分析
3.1 葡萄糖、果糖和蔗糖含量分析
图1 标准品和样品液相色谱图
Fig.1 HPLC spectra of standard product, chestnut honey and syrups S131017-1
葡萄糖、果糖和蔗糖是蜂蜜中的主要物质，三者的含量是蜂蜜品质的重要指标[17]。但由于葡萄糖、果糖是同分异构体，二者的分辨率低，优化色谱条件后，分离度得到提高。果糖标准品的保留时间为11.711 min，葡萄糖标准品的保留时间为12.769 min，蔗糖标准品的保留时间为18.218 min(见图1a)。由于样品数量较多，选取同仁堂荆条蜂蜜和糖浆S131017-1的HPLC图谱为蜂蜜和糖浆样品的代表(见图1b、图1c)。
蜂蜜样品中葡萄糖、果糖、蔗糖的质量分数分别在34.0%～51.0%、46.0%～55.0%、 2.6%～5.0%，果糖与葡萄糖质量分数比范围为0.95～1.50。糖浆样品中葡萄糖、果糖的质量分数范围分别为9.0%～49.0%、 0～73.0%，不含蔗糖；果糖与葡萄糖质量分数比范围为0.13～2.80。与文献[18]相比，大大提高了果糖和葡萄糖的分离度。因此，可以将葡萄糖、果糖和蔗糖的含量及相对含量作为区分蜂蜜和糖浆的指标。
3.2 蛋白质含量及分子质量分析
蜂蜜中的蛋白质主要来源于蜜蜂分泌产生的各种消化酶、代谢酶，小部分来自花蜜或花粉，蜂蜜中的蛋白质受蜜蜂种类、蜜源植物、地理环境等因素的影响[19-21]。实验中，蛋白质含量标准曲线方程为y=6.128 6x+0.008 6，R2=0.996 8。蜂蜜样品中蛋白质质量比范围为1.12～5.09 μg/g，如图2(样品编号顺序见表1)，糖浆样品中不含蛋白质。
图2 蜂蜜样品中的蛋白质含量
Fig.2 Protein content of honey samples
蜂蜜样品电泳后出现了1～4条带，蛋白质分子质量范围在45.0～116.0 kDa；糖浆样品电泳后没有出现条带(见图3)。蜂蜜的蛋白质分子质量主要集中在50 kDa附近。不同蜂蜜的蛋白质种类及组成存在较大的差异：枣花蜂蜜的蛋白质种类最多，主要由4条蛋白质谱带构成；枇杷蜂蜜蛋白质种类最少，只有1条蛋白条带。由于蜂蜜中蛋白质的含量及类型取决于蜂蜜源产地和花的种类，因此，蛋白质电泳实验所得到的蛋白质分子质量范围及蛋白质种类可以作为区分蜂蜜和糖浆的指标之一。
3.3 多酚含量分析
多酚类物质具有抗氧化活性，是蜂蜜中的主要功效成分。标准曲线方程为y=0.130 1x+0.011 8，R2=0.998 8。蜂蜜样品中多酚质量比范围为16.14～32.47 μg/g，糖浆A2015196、糖浆A2015197、糖浆A2015198、糖浆A2015199、江西南昌糖浆中不含多酚类物质，其余糖浆样品中多酚质量比在5.03～15.11 μg/g (见图4)。蜂蜜样品中多酚含量高于糖浆的多酚含量，因此根据多酚含量可区分出大多数蜂蜜和糖浆。
图3 样品电泳图
Fig.3 Sample electrophoresis chart
3.4 黄酮含量分析
蜂蜜中的黄酮类物质主要来自蜜源植物的花蜜、花粉或蜂胶。不同种类蜂蜜中的黄酮类化合物种类和含量差别很大，黄酮类物质具有极好的抗氧化、抗菌等功效[22]。标准曲线方程为y=0.007 7x+0.007 3，R2=0.999。蜂蜜样品中黄酮质量比范围在32.4～174.4 μg/g，糖浆样品中黄酮质量比范围在15.2～89.3 μg/g(见图5)。蜂蜜样品中黄酮含量高于糖浆的黄酮含量，依据黄酮含量可区分出大部分蜂蜜和糖浆。
图4 蜂蜜和糖浆样品的多酚含量
Fig.4 Phenol content of honey and syrup
图5 蜂蜜和糖浆样品中的黄酮含量 Fig.5 Flavonoid content of honey and syrup
3.5 水分含量分析
蜂蜜中的含水量对于蜂蜜的品质、物理特性有重要作用。蜂蜜样品的ω(水)范围在15.13%～19.88%，糖浆样品的ω(水)范围在22.13%～28.50%(见图6)，糖浆含水量均高于蜂蜜含水量。这与文献报道一致[23]，在蜂蜜的后熟阶段，蜂蜜中的含水量会降低，纯蜂蜜的ω(水)不应超过25%，否则会导致微生物的生长，但也不应低于14%。
图6 蜂蜜和糖浆样品的水分含量
Fig.6 Water contents of honey and syrup
3.6 pH值分析
蜂蜜的酸性与其所含的矿物元素和酸性物质有关[24-25]。实验中，所有检测样品都呈酸性，范围在3.77～5.65，如图7。蜂蜜样品的pH值范围在3.78～5.50，大多数蜂蜜样品的pH值在3.78～4.12，只有椴树蜂蜜(pH值4.50)、益母草蜂蜜(pH值4.63)、枣花蜂蜜(pH值4.74)高于4.50。糖浆的pH值范围在3.77～5.65，大多数糖浆的pH值在4.30～5.65，只有糖浆S131017-5(pH值3.77)、糖浆A2015195(pH值3.90)的pH值低于4.00。
图7 蜂蜜和糖浆样品pH值
Fig.7 pH value of honey and syrup
3.7 主成分分析结果
对27个样品(17个蜂蜜、10个糖浆)的理化指标进行主成分分析，结果如图8。前2个主成分蛋白质含量(PC1)、果糖相对含量(PC2)的累积贡献率占89.543%，其中PC1、PC2的方差贡献率分别为70.839%、18.704%。由主成分得分图，可以看出蜂蜜和糖浆样品已完全区分开。通过理化指标鉴别法可以区分出大多数蜂蜜和糖浆，此方法为真假蜂蜜的鉴别提供了理论依据。
图8 主成分分析
Fig.8 Principle component analysis
4 结 论
实验对蜂蜜和糖浆的理化指标进行了测定，包括水分、酚类、糖、蛋白质等，并结合化学计量学分析对数据进行处理。主成分综合得分显示,蛋白质含量、果糖相对含量对蜂蜜真假鉴别的影响最大。文章采用HPLC方法分析蜂蜜中单糖组成及含量，在色谱柱、流动相的选择上进行优化，提高了果糖和葡萄糖的分离度。同时，采用比色法测定蜂蜜中的抗氧化活性物质——多酚类和黄酮类，并将蛋白质含量与蛋白质分子质量分析相结合，使分析蛋白质鉴别真假蜂蜜的方法更完善。多种理化指标综合分析是鉴别真假蜂蜜的主要方法，为进一步验证蜂蜜真伪提供了科学依据，在蜂蜜质量监督、产品检验方面有广阔的应用前景。
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Identification of Adulterated Honey Based on Physical and Chemical Parameters
Abstract： The purpose of this study was to quickly and accurately identify honey and syrup using physical and chemical parameters. Using 17 kinds of honey and 10 kinds of syrup from the northern area as materials, the physical and chemical parameters, such as water content, protein content, molecular weight range, and monosaccharide content ratio, were used to analyze the similarities. In order to improve the resolution of fructose and glucose, an aminopropyl column was applied in this study. The results showed that pH value, polyphenol content, and flavones content were not different. The water contents of 17 kinds of honey were 15.13%-19.88% while the water contents of 10 kinds of syrup were 22.13%-28.50%. The ratios of fructose and glucose of different honey samples and syrup samples were 0.95-1.50 and 0.13-2.80. The protein contents of honey samples were 1.12-5.09 μg/g and the molecular weight range was 45.0-116.0 kDa. However, the syrup did not have protein. The combination of protein content determination and protein molecular weight assays enhance the persuasiveness of identifying true and false honey through proteins. The moisture content, relative content of fructose/glucose, protein content and molecular weight of protein can be used as indicators of adulteration, and provide the theoretical basis for the identification of honey adulteration.
Keywords： honey; syrup; physical and chemical indexes; adulteration; authenticity identification
(责任编辑：张逸群)
doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.03.007
文章编号：2095-6002(2018)03-0048-08
引用格式：岳锦萍，高寒，王丹丹，等. 利用理化参数鉴别掺假蜂蜜[J]. 食品科学技术学报，2018,36(3):48-55.
YUE Jinping, GAO Han, WANG Dandan, et al. Identification of adulterated honey based on physical and chemical para-meters[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,36(3):48-55.
中图分类号： TS207.2
文献标志码：A
收稿日期： 2017-11-02
基金项目： 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA09Z411)；北京市教委面上项目(SQKM201610011005)。
*任 虹，女，副教授，博士，主要从事食品生物技术方面的研究，
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