灵芝(Ganoderma lucidum)是我国一种重要的药用真菌，具有很高的药用价值，素有“仙草、瑞草”之美誉，作为民间药方延年益寿和滋补身体已经有上千年历史。灵芝含有多糖、核苷、三萜化合物、生物碱、不饱和脂肪酸、甾醇、有机锗等活性成分[1-2]。灵芝多糖是灵芝中主要的生物活性成分，具有抗肿瘤[3-4]、免疫调节[5]、抗氧化[6]等多种药理活性，因此灵芝多糖是灵芝研究的一个热点。

灵芝子实体多糖属于胞内多糖，存在于细胞壁或细胞间质中，而灵芝子实体的细胞壁是由纤维素、半纤维素和木质素组成的致密结构，导致灵芝多糖不易从细胞内提取出来。利用多糖易溶于热水、稀酸、稀碱等极性溶液的特性，目前提取灵芝多糖的方法主要有热水浸提法[7]、超声协助水提法[8]、微波提取法[9]、酶法[10]、微波辅助超声提取法[11]等。热水浸提法提取多糖是工业生产常用的方法，但提取时间长、能耗大、得率低、活性差，限制了灵芝产业的发展。超声协助水提法以超声波的高频振荡及其产生的“空穴效应”破坏细胞结构，有利于多糖从细胞内溶出；酶法提取是以酶来降解细胞壁，使得胞内多糖溶出，可提高灵芝多糖的得率；微波提取法是通过微波破坏细胞壁和细胞膜的结构，从而使胞内多糖快速溶出[12]，但这些方法因成本高，在工业上难以大规模的应用。高压热水法是利用高压对细胞的破碎作用，有利于热水从胞内溶出多糖，此提法方法简单可行、适用性强，可用于大批量的工业生产[13]。

由于高温高压的提取强度会对多糖的结构和活性产生影响，且抗氧化性是灵芝多糖的主要药理活性之一，因此，本文通过正交试验对高压热水提取灵芝多糖的工艺进行了优化，并分析提取工艺对其抗氧化活性的影响，期望获得的结果能为灵芝的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝子实体超微粉由安徽黄山云乐灵芝有限公司提供。

葡萄糖、蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、正丁醇、氯仿等试剂均为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅，日本SANYO公司；AL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；CR22GⅡ型高速冷冻离心机，日本日立公司；CR22GⅡ型超滤设备，美国Pall公司；FD-1A-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 还原糖的检测

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[14]。以葡萄糖质量浓度(x，mg/mL)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，对其进行线性回归后得到方程y=1.404 2x-0.017 7，该方程的相关系数为0.999 2，葡萄糖浓度的线性检测范围为0.10～0.70 mg/mL。还原糖的质量浓度计算见式(1)。

ω(还原糖)

(1)

式(1)中ρ为根据葡萄糖标准曲线计算得到待测提取液中葡萄糖质量浓度，mg/mL；V为灵芝多糖提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为灵芝子实体超微粉质量，g。

1.3.2 多糖的检测

采用蒽酮-硫酸法[15]。以葡萄糖质量浓度(x，mg/mL)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，对其进行线性回归后得到方程y=5.420 6x-0.077 3，该方程的相关系数为0.999 1，葡萄糖浓度的线性检测范围为0.04～0.18 mg/mL。总糖的质量浓度和多糖的提取率计算分别见式(2)和(3)。

ω(总糖)

(2)

ω(多糖)=[ω(总糖)-ω(还原糖)]×0.9×100%。

(3)

式(2)和(3)中，0.9为葡萄糖换算成葡聚糖校正系数，其他参数同1.3.1节。

1.3.3 DPPH自由基清除率的测定

根据文献[16]，称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL待测液，加入 2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混合均匀，室温放置30 min后，于波长525 nm处测吸光度(Ai)。以2 mL待测液和2 mL无水乙醇混合作为对照组(Aj)，另外2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液和2 mL无水乙醇混合后测吸光值(Ac)。DPPH自由基清除率计算见式(4)。

DPPH清除率

(4)

1.4 高压热水提取灵芝多糖工艺优化

1.4.1 单因素实验

精确称取灵芝子实体超微粉末 1.00 g，以蒸馏水为提取溶剂，分别研究提取温度(110、115、120、125、130 ℃)、料液比 (即灵芝子实体超微粉质量与提取溶剂体积的比例)(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)、提取时间(20、30、40、50、60 min)对灵芝总糖含量、还原糖含量和DPPH自由基清除率的影响。每组实验重复3次，取平均值。

1.4.2 正交试验

根据单因素实验结果，用L9(34)设计正交试验研究提取温度、提取时间、料液比对灵芝多糖提取的影响，对灵芝多糖高压热水提取工艺进行优化。每组实验重复3次，取平均值。

1.4.3 提取次数对灵芝多糖提取率影响的研究

根据正交试验优化确定的工艺，提取灵芝多糖。高压热水灵芝多糖提取液经5 000 r/min离心20 min，测定上清液中的总糖和还原糖含量。取弃去上清液后的固体多次重复提取，测定上清液中的总糖和还原糖含量。

1.5 灵芝多糖的纯化

称取50.00 g灵芝子实体超微粉，在较佳高压热水提取条件下提取多糖，5 000 r/min离心20 min后收集上清液，经过3 000 Da膜超滤浓缩后，向溶液中加入其体积1/3的Sevag试剂(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)混合震荡后静置30 min，离心(4 000 r/min，5 min)，除去有机层及水层和有机层交界处的变性蛋白质，重复多次至无蛋白质产生。除蛋白后的多糖，冷冻干燥保存，测定DPPH自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 提取温度对灵芝多糖提取的影响

以料液比1∶50 g/mL、提取时间为30 min，考察110、115、120、125和130 ℃的提取温度对灵芝多糖提取的影响，结果见图1。

图1 提取温度对灵芝多糖提取的影响
Fig.1 Effect of temperature on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由图1可以看出，随着提取温度的升高，灵芝多糖提取液中总糖含量和还原糖含量不断增加，对DPPH自由基清除率不断下降，当温度达到125 ℃时，总糖含量的增加不显著，而还原糖含量显著增加。这说明随着温度的升高，有助于多糖从细胞中的溶出，但高温也导致多糖发生降解，其抗氧化活性也降低了。因此，选择125 ℃作为较佳提取温度。

2.2 料液比对灵芝多糖提取的影响

以提取温度120 ℃、提取时间为30 min，考察1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70 g/mL的料液比对灵芝多糖提取的影响，结果见图2。

图2 料液比对灵芝多糖提取的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由图2可以得知，在料液比为1∶30～1∶50 g/mL时，灵芝多糖提取液中总糖含量和对DPPH自由基清除率随提取用水量的增加而增大；当料液比为1∶50 g/mL时，总糖的含量和灵芝多糖提取液对DPPH自由基清除作用达到最大。而当继续增加提取用水量时，总糖含量反而有着缓慢下降。这可能的原因是，在1∶50 g/mL的料液比时，灵芝多糖的浸出已比较充分，继续增加提取用水，含量没有多大的变化，反而增加了升温的时间。此外，提取用水的增加会增加其他组分(如蛋白质)的溶出，对于多糖的溶解可能存在一定影响。同时，在不同的料液比下，灵芝多糖提取液中还原糖含量变化不明显，说明料液比对灵芝多糖的降解影响不显著。因此，选择1∶50g/mL作为灵芝多糖提取的较佳料液比。

2.3 提取时间对灵芝多糖提取的影响

以料液比1∶50 g/mL、提取温度120 ℃，考察20、30、40、50和60 min的提取时间对灵芝多糖提取的影响，结果见图3。

图3 提取时间对灵芝多糖提取的影响
Fig.3 Effect of time on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由图3可以看出，在20～60 min内，灵芝多糖提取液中还原糖含量随着时间的增加不断升高，呈线性增长；而总糖含量的增长在30 min后趋于平缓。这可能是因为高压热水提取灵芝多糖是一个固液非均相的提取过程，需要一定的时间才能使多糖从固体内部传递到液体，因此总糖含量随时间的增加而增大；而在30 min后，固液体中多糖达到平衡，继续增加提取时间对总糖含量的影响较小，但时间的延长存在多糖的分解。同时，在20～40 min内，灵芝多糖提取液对DPPH自由基清除率不断增加，而在40 min后，灵芝多糖提取液对DPPH自由基清除作用不断下降。因此，选择30 min作为较佳的提取时间。

2.4 正交试验

在单因素实验结果的基础上，选用L9(34)正交表，对高压热水提取灵芝多糖提取工艺进行正交试验优化，实验结果和分析结果见表1。

表1 正交试验设计及结果

Tab.1 Orthogonal design and results

实验号A提取温度/℃B料液比/(g·mL-1)C提取时间/minω(多糖)/%11201∶4020289±008221201∶5030423±005131201∶6040409±007241251∶4030402±002951251∶5040451±003861251∶6020384±001571301∶4040365±003181301∶5020388±005491301∶6030409±0110k1374352354k2412421411k3387401408R039069058

从表1中极差分析结果可以看出，3个因素对灵芝多糖提取率的影响由大到小依次为料液比(B)、提取时间(C)和提取温度(A)。在实验设计范围内，优化得到高压热水提取灵芝多糖的较佳条件为A2B2C2，即提取温度为125 ℃、料液比1∶50 g/mL、提取时间30 min。该组合没有在正交试验的9个组合中出现，验证实验结果表明，在此条件下高压热水提取灵芝多糖的提取率为4.54%。相比较常压热水(在料液比1∶50 g/mL、提取温度95 ℃、提取时间30 min条件下，多糖的提取率为3.01%)来说，高压热水提取灵芝多糖的提取率提高了50%以上。

2.5 提取次数对灵芝多糖提取的影响

以提取温度为125 ℃、料液比1∶50 g/mL、提取时间30 min，考察高压热水提取次数对灵芝多糖提取的影响，结果见表2。

从表2可以看出，随着抽提次数的增加，多糖的提取率越来越低，第一次提取的多糖占4次提取多糖总量的53.47%，2次提取的多糖含量可达6.78%，占总提取量的80%以上，3次提取的多糖占总提取量的93%以上，因此可见在高压热水条件下，灵芝子实体多糖提取只需提取 2～3 次，即可提取出绝大部分多糖。

表2 提取次数对灵芝多糖提取率的影响

Tab.2 Effect of extraction frequencies on yield of polysaccharides from Ganoderma lucidum

提取次数ω(总糖)/%ω(还原糖)/%ω(多糖)/%1631±0072126±0021454±00312324±0041053±0014224±00223159±0017042±0006114±00054084±0012021±0005057±0004

2.6 灵芝多糖对DPPH自由基清除率的影响

灵芝多糖对DPPH自由基的清除作用如图4。

图4 灵芝多糖对DPPH·消除率的影响
Fig.4 Effect of polysaccharides from Ganoderma lucidum on scavenging activity of DPPH radicals

由图4可知，灵芝多糖具有清除DPPH自由基的能力，而且清除能力随多糖浓度的增加逐渐增强，表明灵芝多糖对DPPH自由基的清除率与多糖含量存在量效关系。

3 结 论

灵芝子实体细胞的细胞壁具有细胞壁是由纤维素、半纤维素和木质素组成的致密结构，通过高压热水提取，可以提高水对细胞穿透力和细胞破坏力，能有效加快多糖的释放。以灵芝子实体超微粉为原料，研究了在高压热水条件下提取温度、时间和料液比对灵芝多糖的提取以及提取液对DPPH自由基清除率的影响。结果显示，在一定范围内，灵芝多糖提取率随着提取温度升高、时间增加和料液比增大而增大，但高温高压也会促进灵芝多糖分解，影响其对DPPH自由基清除作用。通过正交试验优化，得到灵芝多糖高压热水提取优化条件为料液比1∶50g/mL、提取温度125 ℃、提取时间为30 min，在此条件下，一次高压热水提取灵芝多糖提取率达到4.54%，相较于常压热水提取法来说，多糖提取率显著提高。抗氧化实验结果表明，灵芝多糖对 DPPH 自由基有一定的清除能力，且与多糖质量浓度存在一定的量效关系。

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