*王建昌，男，高级兽医师，博士，主要从事食源性微生物、动物疫病分子生物学方面的研究，通信作者。

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是革兰氏阳性兼性厌氧菌，是食品污染常见的致病菌之一[1]，具有代谢通路多样化、营养需求低的特点[2-3]。人体感染后临床症状有恶心、呕吐、腹痛以及腹泻等[4]，食物中毒的发病率高达60%～100%[5]。探索简便、快速、高灵敏性的检测方法是该菌研究的重点。

蜡样芽胞杆菌传统的检测方法操作过程繁琐，检测周期长，需要经验丰富的操作人员。张志鸿等[6]建立real-time PCR方法检测食品中的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌，周巍等[7]通过环介导等温扩增技术(LAMP)对酸乳中的蜡样芽胞杆菌进行检测，贾雅菁等[8]在LAMP反应体系中加入荧光染料，实现了对蜡样芽胞杆菌的定性荧光监测；但上述方法都不能满足简单、快速的检测特点。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amp-lification, RPA)因其操作简单、反应快速、不需要昂贵的设备等优势，在医疗诊断、转基因食品和动物疫病检测中受到广泛关注[9]。RPA技术主要依赖于重组酶、单链结合蛋白和具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下(25～42 ℃)进行，而实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification，real-time RPA)技术将RPA基础反应与荧光探针结合，具备了实时监测扩增进程的优势，灵敏度和特异性也进一步提高，已被广泛运用于细菌、病毒及寄生虫的检测[10]。但截至目前利用该方法检测蜡样芽胞杆菌的研究未见报道。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)、营养肉汤，购自北京陆桥技术股份有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；Premix Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司；RAA试剂盒(荧光型)，购自浙江泰晶生物科技有限公司。

Genie Ⅲ型等温扩增荧光检测系统，英国OptiGene公司；ABI7500型实时荧光PCR仪，美国ABI公司；NanoDrop 2000C型超微量分光光度计，美国Thermo Scientific公司。

1.2 实验菌株

实验所用的菌株见表1。

表1 实验菌株

Tab.1 Bacterial strains used in study

序号菌种名称来源real⁃timeRPA检测结果1蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)CICC63301+2蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC14579+3蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)本实验室分离+4蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)本实验室分离+5地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)本实验室分离-6球形芽胞杆菌(Bacillussphaericus)本实验室分离-7栗褐芽胞杆菌(Bacillusbadius)本实验室分离-8解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)本实验室分离-9枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)本实验室分离-10福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)CICC21678-11宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)CICC21679-12痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)CMCC51105-13鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)CICC21680-14单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19114-15金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC21600-16鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella)CICC22956-17空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC33291-18大肠埃希氏菌O157：H7(EscherichiacoliO157：H7)CICC21530-19阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)ATCC29544-20副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)CICC21617-21乙型溶血性链球菌(Streptococcushemolytic⁃β)CMCC10373-22肺炎克雷伯(Klebsiellapneumonia)本实验室分离-23粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)本实验室分离-24恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)本实验室分离-25弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)本实验室分离-26溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)本实验室分离-27绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)本实验室分离-28阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)本实验室分离-

+，阳性；-，阴性。

1.3 细菌基因组DNA的提取

将蜡样芽胞杆菌(CICC63301)纯培养菌接种于10 mL营养肉汤中，37 ℃培养16 h。取1 mL菌液10 000 r/min离心1 min，弃上清液，将菌体沉淀按照细菌DNA提取试剂盒方法提取细菌基因组DNA，立即使用或-20 ℃保存备用。同时使用NanoDrop 2000C型超微量分光光度计测定核酸浓度。

1.4 引物探针设计

参考GenBank中蜡样芽胞杆菌16S RNA基因序列(登录号：KY224970.1)，选择保守区域，设计real-time RPA引物及exo探针，目的片段大小为297 bp。用于蜡样芽胞杆菌检测的real-time PCR引物及探针参照文献[11]中相关序列(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 实验所用引物及探针

Tab.2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCR

方法引物名称序列(5′⁃3′)长度/bpreal⁃timeRPARPA⁃FATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGRPA⁃RCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCA297exoprobeCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGC(FAM⁃dT)(THF)AAG(BHQ1⁃dT)TAACGCATTAAGC⁃C3spacerPCR⁃FGCGGCGTGCCTAATACATGCreal⁃timePCRPCR⁃RCTCAGGTCGGCTACGCATCG269PCR⁃probeFAM⁃TCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGC⁃BHQ1

1.5 Real-time RPA方法的建立

使用RAA试剂盒(荧光型)配制单个反应体系，其中10 μmol/L的RPA-F和RPA-R各2 μL(终浓度0.4 μmol/L)，10 μmol/L exo probe 0.6 μL(终浓度0.12 μmol/L)，A buffer 12.5 μL，模板1 μL，ddH2O 29.4 μL。将上述47.5 μL溶液混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5 μL B buffer(280 mmol/L MgAc)，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中39 ℃反应20 min。

1.6 Real-time PCR方法

用于蜡样芽胞杆菌检测的real-time PCR反应按照文献[10]进行，反应体系为25 μL。其中Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L PCR-F和PCR-R各1.5 μL(终浓度0.6 μmol/L)，5 μmol/L PCR-probe 1 μL(终浓度0.2 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 7.5 μL。将上述体系充分混匀后放入ABI 7500型实时荧光PCR仪中，反应程序设置为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，60 ℃延伸 35 s，35个循环，60 ℃收集荧光信号。

1.7 特异性和灵敏性实验

以表1中所示菌株的基因组DNA作为模板进行real-time RPA反应，确定是否出现特异性扩增曲线。将蜡样芽胞杆菌基因组DNA使用ddH2O进行10倍梯度稀释，以不同稀释度的DNA作为模板进行real-time RPA反应，确定该方法的灵敏性。同时与已建立的real-time PCR方法的灵敏性进行比较。

1.8 人工污染样品检测

蜡样芽胞杆菌(CICC63301)经过纯培养后，用生理盐水稀释至浓度约为1.1麦氏浊度，进行10倍梯度稀释。将不同稀释度的菌液1 mL分别添加到25 g大米饭样品中(样品预先按照GB 4789.14—2014检测，未检出蜡样芽胞杆菌)，再添加到225 mL PBS中，用拍击式均质器连续均质1～2 min，分别取1 mL模拟样品，采用稀释平板法，测定其活菌添加范围为1.5×102～1.5×107 CFU/g，同时从中各取1 mL模拟样品参照1.3进行细菌DNA的提取，取1 μL作为模板进行检测。

2 实验结果

2.1 特异性实验分析

对蜡样芽胞杆菌和其他细菌基因组DNA(浓度均为100 ng/μL)作为模板进行real-time RPA检测，结果表明仅蜡样芽胞杆菌呈现典型的扩增曲线，为阳性结果，而其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌细菌均未出现扩增曲线(表1)。表明该方法具有良好的特异性。

2.2 灵敏性实验分析

将浓度为100 ng/μL的蜡样芽胞杆菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，连续稀释8个梯度后，取每个梯度的核酸进行real-time RPA和real-time PCR检测，结果表明，real-time RPA的检测限为1.0×10-3 ng/μL(图1a)，同real-time PCR方法检测限一致(图1b)。

1) 1.0×102, 2) 1.0×101, 3) 1.0×100, 4) 1.0×10-1, 5) 1.0×10-2, 6) 1.0×10-3, 7) 1.0×10-4, 8) 1.0×10-5；单位ng/μL。
图1 蜡样芽胞杆菌灵敏性实验结果
Fig.1 Sensitivity of real-time RPA and real-time PCR for Bacillus cereus

2.3 人工污染样品的检测分析

人工污染蜡样芽胞杆菌的大米饭的检测结果表明，当污染量≥1.5×104 CFU/g时，real-time RPA即可检出大米饭中蜡样芽胞杆菌，所需要时间仅为6～13 min；当污染量≥1.5×105 CFU/g，real-time PCR方可检出大米饭中蜡样芽胞杆菌，所需时间在30 min以上(Ct值为20～31)。结果说明，在检测人工污染样品时real-time RPA的灵敏性高于real-time PCR，同时前者所需时间明显少于后者(表3)。

表3 蜡样芽胞杆菌人工污染样品检测结果

Tab.3 Bacillus cereus detection results of artificial contamination samples

污染量/(CFU·g-1)t(增菌)/ht(real⁃timeRPA)/minCt(real⁃timePCR)15×1070575202915×1060798264915×10501112309415×10401220—15×1030——15×1020——

—:未检出。

3 讨论与结论

研究选取蜡样芽胞杆菌的16S RNA基因保守序列设计特异性引物和探针，建立了食品中蜡样芽胞杆菌的real-time RPA快速检测方法，即39 ℃恒温反应20 min实现对蜡样芽胞杆菌的有效扩增。方法特异性良好，灵敏性可达到1.0×10-3 ng/μL，与real-time PCR检测方法一致。对人工污染的大米饭，real-time RPA在反应时间上明显少于real-time PCR方法。该方法操作简单、反应快速，为食品中蜡样芽胞杆菌污染的现场快速检测提供了一种新的检测方法。

目前已报道的蜡样芽胞杆菌检测方法有分离培养法、普通PCR、多重PCR、荧光PCR、LAMP及基因芯片等[12-14]，但是分离培养法和基因芯片技术操作繁琐，检测时间相对较长；PCR技术不仅对环境要求高，而且需要昂贵的PCR仪器和熟练的技术人员。上述方法在突发食物中毒等公共卫生事件中的应用有诸多不便[15-16]。研究建立的real-time RPA方法与real-time PCR相比，具有操作简便、反应时间短的优点，同时使用的OptiGene Ⅲ等温扩增荧光检测系统紧凑小巧，轻便耐用，仅为1.75 kg左右，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可实现便携式的致病菌现场快速检测。虽然LAMP和real-time RPA均属于等温检测方法，但LAMP反应温度较高(>60 ℃)，反应时间一般在45～60 min[7]，并且实验设计复杂，需要设计4～6条引物；而real-time RPA扩增在常温下(25～42 ℃)即可实现，且一般在20 min内即可完成，实验设计简单，仅需要2条引物和1条探针，并且RPA试剂为冻干粉形式，可实现常温下运输，从而为蜡样芽胞杆菌的现场快速检测提供了有价值的参考方法。

研究中real-time RPA方法的建立，结合细菌核酸的快速提取，可以达到现场快速检测的目的，为食品加工质量控制及食源性疫病等公共卫生事件中蜡样芽胞杆菌的检测提供了可借鉴的技术手段。

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