*刘小鸣，女，教授，博士，主要从事乳品科学与技术方面的研究，通信作者。

牦牛是生活在海拔3 000～5 000 m的古老牛种，90%以上在我国，其中四川西部- 青藏高原一带数量最多[1]。牦牛乳富含蛋白、脂肪、乳糖，含量远高于普通牛乳，且含有对人体十分有益的共轭亚油酸、必需氨基酸、维生素等[2]。当地蔬菜、水果等物资缺乏，人们从牦牛乳中获取营养，制作出多种传统牦牛乳制品，包括酸乳、酥油、曲拉等[3]，其中牦牛酸乳是牧民家中常见的一种牦牛乳制品。Chen等[4-6]研究显示牦牛酸乳中各种营养物质含量均显著高于普通发酵牛乳，另有研究表明，从牦牛酸乳中分离获得的乳酸菌多具有良好的抗氧化活性[7]，且具备降低胆固醇、胆盐高耐受性的潜力[8]。

虽然牦牛酸乳营养特性优良，但目前产量并不高。中国年产牦牛乳可达4 000万t，但工业生产所消耗的原料乳不及牦牛乳年产量的25%[9]。一方面，目前牦牛乳制品的研发还处于初级阶段，牦牛乳的凝乳特性与普通牛乳的差异显著，牦牛乳蛋白含量高，凝乳慢[10-11]，且凝乳块硬度大[12]，酸度高[13]，而牦牛乳加工企业的设备较为陈旧，工艺不成熟[14]；另一方面，牦牛乳本身有一定的乳膻味，导致其乳制品风味欠佳[15]。因此，文章探讨了分离自牦牛酸乳的保加利亚乳杆菌的发酵特性与酸乳的挥发性风味物质组成，及其在牦牛酸乳中的应用，对能够快速发酵牦牛乳且赋予牦牛酸乳特征风味的发酵剂进行了初步的理论与应用研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

改良MRS培养基(胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、柠檬酸二铵、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、蒸馏水)、氢氧化钠、酚酞，均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。癸酸乙酯，色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。脱脂乳粉购自光明乳业股份有限公司，全脂牦牛乳粉购自西藏高原之宝牦牛乳业股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GR60DA型立式自动压力蒸汽灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司；SW- CJ- 1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Thermo- 994型超低温冰箱、1300- ISQ型气相色谱质谱联用仪(配有电子轰击电离源(EI)及单四极杆检测器)，美国赛默飞世尔科技公司；AW500SG型厌氧工作站，英国依莱泰科公司；HWS- 150型恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司；DZ400/2D型真空包装机，上海尤溪机械设备有限公司；C1000 TouchTM型基因扩增仪，美国Bio-Rad公司；DYCP- 31DN型水平电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离

2016年6月采集中国四川阿坝藏族自治州藏南当地传统牦牛酸乳样品11份，加入体积分数40%无菌甘油，低温运输至实验室，于-80 ℃冰箱中保藏。

提前一天从-80 ℃冰箱中取出酸乳样品，冰上解冻，吸取0.5 mL酸乳样品至4.5 mL无菌生理盐水中稀释10倍，梯度记为10-1，以此类推将梯度稀释至10-6。从每个稀释梯度的菌悬液中吸取100 μL于固体改良MRS培养基上，均匀涂布至粗糙，倒置，于37 ℃厌氧工作站中静置培养48 h左右，取出，划线分离，纯化并培养，记录菌落形态。挑取单菌落于液体改良MRS培养基中，震荡混匀，于37 ℃厌氧工作站中静置培养12～24 h，取菌液离心得菌泥，重悬于等体积终浓度为30%的无菌甘油中保藏。

1.3.2 菌株鉴定

提取菌株DNA与序列扩增：参照Hunt等[16]采用酚- 氯仿法提取菌体DNA。16S rDNA序列扩增体系(25 μL)各组分体积：模板量为1 μL，Taq酶Mix为12.5 μL，27F为0.5 μL，1492R为0.5 μL，ddH2O为10.5 μL。所用引物为上游引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA 20)和下游引物1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 19)。扩增条件：预变性温度为95 ℃保持7 min，变性温度95 ℃保持30 s；退火温度为55 ℃保持30 s；延伸温度为72 ℃保持90 s;循环33次，目标片段长度1 500 bp。0.008 g/mL琼脂糖凝胶电泳进行核酸鉴定有无目标条带，送予华大基因进行鉴定。

目标序列的鉴定： 将拼接好的16S rDNA序列导入NCBI在线平台上的BLAST功能项目区，与数据库进行比对，选取相似度最高的比对结果。

实验所用的9株菌株信息如表1。

1.3.3 脱脂乳发酵乳的制备

从-80 ℃冰箱中取出保菌管，置于冰上解冻，以体积分数2%的比例接入改良MRS培养基中，活化2代，再在脱脂乳中活化至菌株对数末期，调整活菌数在106 CFU/mL。按体积分数2%的比例接入质量分数11%的巴氏杀菌脱脂乳中，从0 h开始每隔2 h取样，平行取出3份样品，冷藏待用。

1.3.4 牦牛乳发酵乳的制备

配置质量分数11%的全脂牦牛乳发酵液，并按体积分数2%的比例接种发酵，待凝乳完成后从发酵培养箱转移至4 ℃冷藏待用，其余同方法1.3.3。

1.3.5 生长速率测定

将每隔2 h取出的发酵乳进行10倍稀释至10-6，涂布计数。

1.3.6 产酸能力测定

将供试菌株在改良MRS培养基中活化3代至对数末期，以2%的比例接种至改良MRS培养基，振荡混匀后置于37 ℃厌氧培养箱生长18 h，从0 h开始每隔2 h取出相同体积的菌液，测定pH值。

另参照GB 5009.239—2016[17]中乳及其他乳制品的酸度测定方法，取出10 mL脱脂乳发酵液，加入20 mL新煮沸冷却至室温的去离子水稀释，滴加2 mL酚酞，混匀后用标定好的0.1 mol/L NaOH滴定至溶液微红色且半小时内不褪色，滴定终止，记录消耗的滴定体积。

1.3.7 凝乳能力测定

随着发酵的进行，从0 h开始每隔2 h观察发酵液的流动性，至发酵液凝固且无乳清析出时，转移发酵乳至4 ℃冷藏24 h，待用。

1.3.8 GC-MS法检测挥发性风味物质

参照Zhang等[18]的方法测定挥发性风味物质，并稍有改动。室温下取6 g酸乳于20 mL的萃取小瓶中，同时加入1 g氯化钠，采用固相微萃取(SPME)方法对各酸乳进行风味成分的提取。自动进样装置将萃取头CAR/PDMS(涂抹厚度为85 μm)插入密封的萃取瓶中，萃取头暴露在样品上部的空气中，50 ℃下萃取30 min。

气谱条件：Rtx-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，进口温度240 ℃，分流比5，柱流速1 mL/min，载气为氦气。程序升温：初始温度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升温至225 ℃，保持5 min。

质谱条件：离子化方式EI，发射能量为70 eV，发射电流为200 μA，检测器电压为1.4 kV，离子源温度250 ℃，接口温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质荷比30～500。化合物检索结果与NIST和Varian 2个标准谱库进行匹配，相似度达到80%以上确认为目的化合物。以2 μL的0.05 mg/mL癸酸乙酯为内标，计算各风味物质的含量。

1.3.9 感官品评

采用GB/T 29605—2013[19]制定了酸乳感官品评的指标[20-21]，组成一支10人感官小组，经培训后进行感官品评与打分。表格采用九分制，1～3分代表强度较弱，4～6分代表强度适中，7～9分代表强度强。

1.4 数据处理与分析

应用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行所有数据的统计分析，数据间的比较采用Tukey模型进行显著性分析，显著性水平为p<0.05；应用GraphPad Prism 5进行散点图的绘制；应用XLSTAT分析软件对挥发性风味物质和感官数据进行主成分分析(PCA)，相关性分析采用偏最小二乘法分析(PLS)。

2 结果与讨论

2.1 基于发酵特性的乳杆菌的筛选

2.1.1 菌株在改良MRS中的产酸能力分析

对9株乳杆菌在改良MRS中的发酵液进行了pH值测定，结果如图1。发酵液的起始pH值为5.51，乳杆菌C1和D-8-S180-1的产酸能力较弱，发酵18 h后pH值在5.2至5.3，其余7株乳杆菌在发酵18 h后发酵液的pH值在4.5～4.7，并趋于稳定。因此8株野生乳杆菌均具备一定的产酸能力。

2.1.2 菌株在脱脂乳中的生长速率分析

对9株乳杆菌在脱脂乳中的生长进行了活菌量的统计，以便于选择数量级高且能够在乳体系中快速生长的乳杆菌，应用于发酵牦牛乳。9株乳杆菌均可在脱脂乳中生长，其中5株保加利亚乳杆菌和2株瑞士乳杆菌发酵脱脂乳6 h时活菌数量可达1×108 ～3×108 CFU/mL，野生菌株D-8-S180-1生长最快，6 h内活菌量增加了近200倍， 2株瑞士乳杆菌发酵脱脂乳时生长缓慢，最高活菌量低于1×108 CFU/mL(见图2)。因此除瑞士乳杆菌D-9-A28和D- 4-A98以外，其余6株野生乳杆菌均具备发酵牦牛乳的潜力。

2.1.3 菌株在脱脂乳中的产酸能力

通过测定菌株发酵脱脂乳时的pH值和滴定酸度可知菌株利用脱脂乳的能力强弱(见图3)。从图3可以看出，5株保加利亚乳杆菌和2株瑞士乳杆菌发酵脱脂乳6 h时酸度可上升至50～70°T，pH值可从6.5下降至4.7～5.2。其余2株瑞士乳杆菌D-9-A28和D- 4-A98的脱脂乳发酵液酸度上升和pH值下降较慢，与2.1.2节结果一致。

2.1.4 菌株在脱脂乳中的凝乳能力分析

观察发酵液的凝乳时间可以快速判断菌株是否具备发酵脱脂乳的能力，一般工业发酵时凝乳时间在4～6 h。除D- 4-A98以外，其余菌株均能够在6 h时凝乳完成，达到发酵终点(见表2)。

2.1.5 主成分分析单菌发酵脱脂乳的挥发性风味组成差异

Cheng[22]论述了酸乳中的挥发性风味物质所对应的气味属性，可知酮类、醛类物质能够赋予酸乳甜味、青草香、果香味、奶油味、花香味等风味，醇类物质使酸乳带有酒味，酯类物质可使酸乳带有各种水果的香味例如菠萝味、苹果味、香蕉味等等，酸类物质会带来酸味、羊膻味、腐臭味等，醚类物质主要会挥发出蒸煮味和硫味等。

选取发酵终点的单菌发酵脱脂乳测定挥发性风味物质，酸乳样品经SPME法萃取后进行GC/MS测定，结果如表3。一共检测出24种挥发性风味物质，包括醛、酮、酯、醚和酸5类化合物，其中酸类7种，酮类8种，醛类5种，酯类2种，醚类2种。对整体风味贡献最大的组分是酸类、酮类、酯类，不同菌株发酵的酸乳样品的风味组成中除壬酸、癸酸外其余风味物质的含量均差异显著(p<0.05)。对照菌株C1含有较高含量的酯类、酸类和醛类化合物，其中w(乙酸乙酯)为223.71 μg/kg，w(酸)为86.33 μg/kg，w(醛)为44.53 μg/kg，酮类化合物含量较低，为7.54 μg/kg。野生保加利亚乳杆菌D-8-S180-1高产乙酸乙酯，6 h可达165.59 μg/kg，能够赋予酸乳较浓的果香味；野生保加利亚乳杆菌D-10-A169产酸类和酮类物质最高，6 h时w(酸)可达195.03 μg/kg，w(酮)为86.14 μg/kg，在带来果香味的同时还会有较重的酸味和刺激味。

“-”表示未凝乳。

对发酵脱脂乳样品的挥发性风味数据做主成分分析(PCA)，结果如图4。不同菌株发酵乳的风味差异显著，按风味物质的组成及含量可分为2大类，一类是包括对照菌株C1在内的5株保加利亚乳杆菌产生的发酵乳，第二类是4株野生瑞士乳杆菌产生的风味特征相似的发酵乳，且两类区别显著。

结合风味化合物的余弦平方值(表4)来看，主成分一所对应的风味化合物主要包括2,3-丁二酮、2-庚酮、乙偶姻、壬酮、乙酸、甲基正壬酮、丁酸、己酸和辛酸，主成分二所对应的风味化合物主要是乙醛、戊酮和戊醛，主成分三对应的风味物质主要是壬酸，主成分四对应的风味物质主要是苯甲醛。

从对发酵乳样品分析而得的因子得分表(表5)来看，主成分一对应的主要发酵乳样品有C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188，主成分二对应的主要发酵乳样品是D-9-A28、D- 4-A98，主成分三对应的样品是D-6-A122，主成分四对应的样品是D-5-A108。因此根据2,3-丁二酮、2-庚酮、乙偶姻、壬酮、乙酸、甲基正壬酮、丁酸、己酸和辛酸的含量高低可区分出样品C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188；根据乙醛、戊酮和戊醛的含量可区分样品D-9-A28、D-4-A98，根据壬酸含量可区分样品D-6-A122，另外根据苯甲醛的含量可区分样品D-5-A108。

不同字母表示同一行数据之间存在显著性差异(p<0.05)。

综上， 由9株实验乳杆菌的发酵筛选实验得知，保加利亚乳杆菌C1、D-8-S180-1、D-2-A49、D-10-A169、D-11-A188和瑞士乳杆菌D-5-A108、D-6-A122能够在乳体系中快速生长并产酸，6 h使脱脂乳凝固，达到发酵终点pH值4.7。经酸乳的挥发性风味测定实验分析得知，保加利亚乳杆菌C1、D-8-S180-1、D-10-A169和瑞士乳杆菌D-5-A108、D-6-A122发酵的酸乳中的挥发性风味特征显著，其中保加利亚乳杆菌C1、D-8-S180-1的酸乳以果香味呈味物质即酯类和醛类最为突出，瑞士乳杆菌D-5-A108、D-6-A122的酸乳以酸味呈味物质、硫味呈味物质较为突出。因此，结合对照菌株C1，选用风味物质存在差异的德氏乳杆菌保加利亚亚种C1、D-8-S180-1、D-10-A169和瑞士乳杆菌D-5-A108、D-6-A122发酵牦牛乳，并进行发酵乳样品的挥发性风味测定与感官品评，以研究发酵牦牛乳的风味特征及不同菌株发酵牦牛乳样品的风味差异。

2.2 乳杆菌发酵牦牛酸乳的特性研究

2.2.1 牦牛酸乳的挥发性风味组成差异分析

牦牛酸乳经4 ℃冷藏1 d后的挥发性风味组成结果如表6，共检测出27种化合物，包括酸类、酮类、醛类、酯类、醚类、醇类的6大类物质，其中酸类物质9种，酮类物质9种，醛类物质5种，酯类物质1种，醚类物质2种，醇类物质1种。对照菌株C1的牦牛酸乳含有495.84 μg/kg的酸类化合物、405.89 μg/kg的酮类化合物、210.36 μg/kg的醛类化合物、5.05 μg/kg醚类化合物、5.92 μg/kg的酯类化合物以及6.18 μg/kg的醇类化合物。野生菌株D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳样品的酸类物质含量与C1相近，酮类物质含量较低， 约为C1样品的62%～73%，醛类、醚类、醇类物质含量均较低，其中菌株D-8-S180-1样品的酯类物质含量最高，为9.82 μg/kg。Imhof等[23]在1995年研究单菌发酵实验时列举了各种发酵菌株的风味组成及其特征，其中保加利亚乳杆菌在38 ℃下经30 h发酵后最高可产6.17 μg/kg的乙酸乙酯。野生菌株D-5-A108、D-6-A122的牦牛酸乳样品的酸类物质含量最高，超过C1样品的2倍，酮类物质含量与C1样品相近，高于D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳样品，另外所含醛类、醚类物质也较高，其中菌株D-6-A122的样品中醛类物质含量最高，为228.42 μg/kg。

2.2.2 牦牛酸乳的感官评价

牦牛酸乳样品的感官评价结果如表7、表8。在气味上，品评员的感官评定词确定为总体气味、甜味、酸味、奶香味、乳脂味、果香味、膻味、硫味、浓厚感以及喜好度；在滋味上，品评员的感官评定词确定为总体滋味、甜味、酸味、涩味、奶香味、果香味、乳脂味、不自然感、膻味、硫味、喜好度。通过比较发现，在气味上，菌株D-8-S180-1发酵的牦牛酸乳的喜好度最高，以果香味最为突出，同时膻味、酸味、乳脂味、硫味较弱；菌株C1、D-10-A169、D-5-A108、D-6-A122发酵的牦牛酸乳在气味的喜好度上的趋势较为相近，其中菌株D-6-A122的样品呈酸味和奶香味最强。在滋味上，菌株D-8-S180-1发酵的牦牛酸乳的喜好度仍保持最高， C1样品喜好度最差，其余三者除酸味以外其他各物质的呈味强度均相近，受品评者喜好的程度优于C1牦牛酸乳，不及D-8-S180-1的牦牛酸乳。

2.2.3 牦牛酸乳的风味组成和感官的相关性分析

基于2.2.1的挥发性风味物质组成和2.2.2的气味感受值，利用偏最小二乘回归方程(PLS)分析两者的相关性，结果如图5。图中有2个相关变量，一是挥发性风味物质组成，二是气味感受值。变量之间的距离越近，说明呈正相关的可能性越大；距离越远，说明呈负相关的可能性越大。2个变量距离轴心的距离代表相关性的显著程度，距离越远，显著性越强。由图5可知，乙醛、辛醛、酯类以及2,3-丁二酮的含量与气味中的果香味、浓厚感及喜好度呈显著正相关，大部分酸类物质、醚类物质以及一部分酮类物质、醛类物质的含量对膻味、乳脂味、硫味、奶香味等也有较显著的贡献。

3株保加利亚乳杆菌发酵的牦牛乳的气味感官特征呈现出2种不同的趋势，2株瑞士乳杆菌发酵的牦牛乳气味感官特征相似，呈现出第3种趋势。2株野生保加利亚乳杆菌D-8-S180-1、D-10-A169的牦牛酸乳的特征风味物质为2,3-丁二酮、辛醛、癸酸辛酯和乙醛，含量均高于其他牦牛酸乳样品，其中2,3-丁二酮、癸酸乙酯、乙醛是酸乳的典型风味物质，能够赋予酸乳果香味[24]。其中保加利亚乳杆菌D-8-S180-1的牦牛酸乳是气味上最受品评员欢迎的样品，从挥发性风味物质组成及含量来看，该样品的w(酸)为366.51 μg/kg，w(酮)为294.54 μg/kg，w(醛)为174.64 μg/ kg，在所有牦牛酸乳样品中均处于中等水平，另外较为突出的是w(酯)为9.82 μg/ kg，远高于其他牦牛酸乳样品，这与该菌株发酵脱脂乳时高产酯类物质的情况保持一致，同时醚类和醇类物质质量比为0，在所有样品中处于最低水平。市售保加利亚乳杆菌C1牦牛酸乳的风味组成明显区别于任何野生菌株的牦牛酸乳的风味，C1牦牛酸乳中丙酮、戊酮、己醛、壬酸等物质含量均最高，其中丙酮具有饲料味、牛膻味、甜味[25]，含量过高风味则不佳，且酯类物质较少，醚类物质较多，导致果香味不突出。2株野生瑞士乳杆菌D-5-A108、D-6-A122的牦牛酸乳以大量酸类、酮类、醚类物质为主体风味物质，酸类物质中乙酸、丁酸、己酸、辛酸含量均在样品中处于最高水平，有研究表明[26-27]，丁酸、己酸、辛酸都是膻味的呈味物质，其中辛酸的俗名为羊脂酸，具有明显的羊膻味，同时醚类物质具有硫味，因此这些物质的含量超出一定范围时，在赋予样品酸香味的同时，还带来令人不愉快的膻味、乳脂味、蒸煮味、硫味，使得酸乳整体风味不佳。

不同字母表示同一行数据之间存在显著性差异(p<0.05)。

不同字母表示同一列数据之间存在显著性差异(p<0.05)。

不同字母表示同一列数据之间存在显著性差异(p<0.05)。

结果表明，无论是脱脂乳体系还是牦牛乳体系，不同菌株发酵而得的脱脂酸乳和牦牛酸乳在挥发性风味物质组成上均保持着显著差异。在发酵过程中牦牛乳的脂肪易受激活因子脂蛋白的诱导被乳脂蛋白脂肪酶(LPL)酯解生成中短链游离脂肪酸，呈现出不洁风味如膻味、蒸煮味、刺激性气味等[27]，而牦牛酸乳中的酯类、醛类物质可贡献出果香味，部分酮类物质可贡献甜味、奶香味；所以，在一定范围内，酯类、醛类和部分酮类物质含量的升高，酸类与醚类物质含量的降低将有助于提高产品的喜好度。

3 结果与讨论

能够发酵脱脂乳且能产生差异显著的挥发性风味的乳杆菌在发酵牦牛乳后，牦牛酸乳之间也呈现出显著的差异性。经过对冷藏1 d后的牦牛酸乳进行感官品评后，发现品评员对牦牛酸乳的喜好度依次受总体强度、不自然感、硫味、酸味、奶香味、果香味、乳脂味、膻味、涩味影响较大，结合挥发性风味物质的测定，可以看出喜好度高的产品含有较高的酯类、醛类物质，其中酯类质量比在9.82 μg/kg左右，醛类物质质量比在174.64 μg/kg左右，而酸类、醚类、醇类物质含量在一定范围内处于较低水平，其中酸类物质质量比在366.51～495.84 μg/kg，醚类物质质量比在5.05 μg/kg及以下，醇类物质质量比在1.42 μg/kg及以下，这种风味组合的牦牛酸乳更受人喜爱。

我国牦牛数量众多，牦牛乳及其乳制品是当地人民极其重要的营养和经济来源，牦牛乳的生产和利用是亟需解决的问题。牦牛乳制品的风味是吸引消费者的首要因素，研究筛选出可应用于发酵牦牛乳并产生特色果香味的野生菌株，将来可在单菌发酵的基础上优化菌株组合和生产工艺，进一步改善牦牛酸乳的品质。

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