壳聚糖固定化风味蛋白酶的制备及其酶学特性

师广波1，马艳芳1，郑明刚2，孙中涛1，*

（1.山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271018；2.国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室，山东青岛 266000）

摘 要：研究了球形交联壳聚糖固定化风味蛋白酶的制备工艺及其酶学特性。以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用共价交联法制备固定化风味蛋白酶的较适条件为ω（壳聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交联时间6 h，载体中ω（酶）=40 mg/g，于35℃、pH值5.5条件下固定化反应10 h。固定化后，风味蛋白酶较适反应温度从50℃提高至70℃，较适pH值从7.0 提高至8.0，且可在更宽温度与pH值范围内保持较高的酶活力。固定化风味蛋白酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性，可反复多次使用，适宜于在工业生产中推广应用。

关键词：风味蛋白酶；固定化；球形交联壳聚糖；酶学特性

风味蛋白酶是由米曲霉发酵产生，再经固液分离、超滤浓缩和喷雾干燥等工序精制而成的一种蛋白酶制剂，除具有内切酶活性外，还具有外切蛋白酶的活性，可作用于肽链C端或N端的疏水性氨基酸形成的肽键，使其水解成游离氨基酸［1-3］。在食品工业中，风味蛋白酶广泛应用于各种动植物蛋白质的水解，具有提高水解产物的水解度和游离氨基酸含量、减轻或脱除苦味、增强和改善风味的作用［4-7］。例如，Benjakul等［8］用风味蛋白酶水解美国白对虾，不仅提高了水解物的产量，而且改善水解液的风味；Tsou等［9］利用风味蛋白酶水解大豆分离蛋白，不仅提高了水解度，而且减轻了大豆肽的苦味；谢章斌等［10］采用风味蛋白酶对鹅肝酱中的蛋白质进行可控水解，显著降低了鹅肝酱的腥味和异味；张根生等［11］利用风味蛋白酶水解脱脂碎肉粉，水解度高达30.13%，游离氨基酸含量显著提高，改善了产品风味。

目前，国内外对风味蛋白酶的研究与应用主要集中于游离态的风味蛋白酶，而对其固定化技术与固定化酶的应用研究较少。风味蛋白酶价格较高，采用游离态的风味蛋白酶对动植物蛋白进行水解时，酶与底物分离困难，不能重复利用，且酶促反应的进程不易控制，这限制了风味蛋白酶在食品工业中的应用［12］。与游离酶相比，固定化酶稳定性好、酶促反应过程的可控性高，生产工艺相对简单，酶与底物容易分离，可重复利用，节约生产成本［13-14］。因此，采用适宜的载体对风味蛋白酶进行固定化，改善其应用特性，降低应用成本，可以拓展风味蛋白酶在食品工业中的应用范围。本实验采用壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，对风味蛋白酶进行固定化，并对其酶学特性进行了研究，旨在为固定化风味蛋白酶在食品工业中的规模化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

壳聚糖（脱乙酰度≥90.0%）、福林试剂，北京索莱宝科技有限公司；Flavourzyme500MG型粉末状风味蛋白酶，诺维信生物技术有限公司；戊二醛（w=25%水溶液），中国医药（集团）上海化学试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

DHZ-D型恒温振荡器，苏州培英实验设备有限公司；PHSJ-4A型pH计，上海雷磁仪器厂；Spectrumlab S22型可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；JA1003型电子天平，上海恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固定化风味蛋白酶制备条件的优化

称取一定质量的壳聚糖，加入一定体积ω（乙酸）=2%水溶液，搅拌至呈透明胶液状，用注射器逐滴注入ω（NaOH）=3%的水溶液中，固化2 h，倾去NaOH溶液，用蒸馏水将壳聚糖球状载体洗至中性，再以ω（戊二醛）=0.5%的水溶液于室温下交联6 h，然后用蒸馏水洗去戊二醛残液，即制得交联壳聚糖球载体［15］；向载体中加入风味蛋白酶溶液，于4℃固定12 h，再用蒸馏水洗掉未被固定的酶分子，抽干，置于4℃冰箱中保存备用。采用单因素实验设计，依次采用不同质量分数的壳聚糖和NaOH溶液制备载体，评测其形状与机械强度，以确定较佳壳聚糖和NaOH质量分数。戊二醛质量分数和交联反应时间是影响载体活化程度的重要因素，将固化好的壳聚糖载体分别加入到不同质量分数的戊二醛溶液中（ω=0.1%～2%），于常温下交联反应2～12 h，然后评测其对风味蛋白酶的固定化能力，以确定较佳戊二醛质量分数和交联反应时间。给酶量、固定化反应时间、温度、pH值是影响活化后的壳聚糖载体对风味蛋白酶固定化能力的重要因素，依次采用单因素实验设计对载体中酶的质量分数（20～80 mg/g）、固定化反应时间（2～12 h）、温度（5～55℃）和pH值（pH值3.5～8.5）进行优化，以确定固定化反应的较佳条件。

1.3.2 固定化风味蛋白酶的酶学性质

以酪蛋白为底物，分别于不同温度和pH值下测定固定化风味蛋白酶的酶活力，以确定固定化风味蛋白酶的较佳酶促反应温度与pH值。将固定化酶置于室温下（25℃），每隔5 d取样并测定其酶活力，以评价其储存稳定性；连续多次用固定化酶于55℃水解大豆分离蛋白，每次水解时间3 h，水解完毕，滤出固定化酶，用蒸馏水冲洗干净，然后测定残留酶活力，以评价其操作稳定性。

1.3.3 固定化风味蛋白酶活力的测定

采用福林酚法（GB/T 23527—2009）。在40℃、pH值7.5的条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位，以U表示。相对酶活力以各组实验的较高酶活力为100%进行折算.

2 结果与分析

2.1 风味蛋白酶较佳固定化条件的优化

2.1.1 壳聚糖和NaOH质量分数的影响

随机取10粒壳聚糖载体夹在两盖玻片中间，在盖玻片上放置适量砝码挤压载体，观察载体有无变形破裂，以此来表示载体的机械强度。制备壳聚糖载体时，壳聚糖与NaOH质量分数对载体的成型性和机械强度的影响如表1。

表1 壳聚糖与NaOH质量分数对壳聚糖载体形状与机械强度的影响
Tab.1 Effects of chitosan and NaOH concentrations on shape and mechanical strength of chitosan carrier

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壳聚糖质量分数主要影响载体的成型性和机械强度，壳聚糖质量分数较低时，载体的成型性和机械强度较差。增加壳聚糖质量分数可以提高成球性能和机械强度，但壳聚糖质量分数过高时，向NaOH中滴加时有拖尾现象，所形成的载体呈蝌蚪状。

NaOH质量分数主要影响载体的固化速度，NaOH质量分数较低时，载体固化速度慢，在重力的作用下发生形变，呈扁球状或椭球状，如图1。

图1 不规则形状的壳聚糖载体
Fig.1 Irregular shape chitosan carriers

当ω（壳聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%时，所形成的壳聚糖载体呈规则球形，机械强度大，再增加壳聚糖质量分数，会出现拖尾现象，而再增加NaOH质量分数，对载体的形状和机械强度的影响不再明显。因此选择ω（壳聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%为较佳浓度。

2.1.2 戊二醛质量分数和载体活化时间的影响

交联剂戊二醛的质量分数与壳聚糖载体的活化时间影响载体上活性基团数量，从而影响其固定化能力。戊二醛质量分数与活化时间对载体固定化能力的影响结果如图2。

图2 戊二醛质量分数与活化时间对固定风味蛋白化酶相对活力的影响
Fig.2 Effects of glutaraldehyde concentration and activation time on relative activity of immobilized flavourzyme

图3 载体中酶的质量分数对固定化酶活力的影响
Fig.3 Effect of enzyme dosage on relative activity of immobilized flavourzyme

ω（戊二醛）=0.5%时，固定化酶的活力较大，再增大戊二醛的质量分数，酶活力反而下降。其原因是戊二醛质量分数较小时，壳聚糖载体上的活性基团数量少，固定化能力低；但戊二醛质量分数过高时，壳聚糖分子上的氨基与戊二醛发生分子内或分子间交联，导致载体与酶的结合能力降低。随着活化时间的延长，载体偶联的戊二醛数量增加，固定化能力增强，并在第6 h时达到较大值，此时，偶联反应已经平衡，再增加活化时间，载体上偶联的戊二醛数量不再增加。

2.1.3 载体中酶的质量分数对固定化酶活力的影响

载体中酶的质量分数对固定化酶活力的影响如图3。

由图3知，固定化酶活力随着载体中酶的质量分数的增加而逐渐增大，并在载体中酶的质量分数为40 mg/g载体时达到较大值，此后，再增加载体中酶的质量分数，固定化酶活力的变化趋于平缓并有不同程度的下降。其原因是载体上的活性基团数量是一定的，当活性位点被酶分子全部占据后，再增加载体中酶的质量分数，被固定的酶分子数量不再增加，且过多的酶分子会在载体网格内聚集，产生空间位阻，影响酶与底物的正常结合，另一方面也会对固定化蛋白酶有一定的水解作用，从而导致固定化酶活力下降［16］。

2.1.4 固定化反应时间的影响

固定化时间对固定化酶活力的影响如图4。

图4 固定化反应时间对固定化酶活力的影响
Fig.4 Effect of immobilization reaction time on relative activity of immobilized flavourzyme

随着固定化反应时间的增加，固定化酶活力逐渐增大，并在10 h时达到较大值，再延长反应时间，固定化酶活力不再增加。因此，较佳固定化反应时间为10 h。

2.1.5 固定化反应温度和pH值的影响

固定化反应温度和pH值对固定化酶活力的影响如图5。温度较低时，壳聚糖载体上的醛基与酶蛋白上的氨基反应速度慢，被固定化的酶分子少，固定化酶活力较低。提高固定化反应的温度，可以提高固定化酶活力，并在35℃时达到较大值。再提高反应温度，固定化酶活力反而下降，其原因是温度较高时，酶蛋白的稳定性差，容易变性失活。固定化反应的pH值对固定化酶活力的影响如图5b，pH值的变化对固定化酶活力影响很大，其原因是反应体系的pH值直接影响壳聚糖载体和酶蛋白的解离状态，从而影响载体与酶蛋白的结合量。pH 5.5是固定化反应的较佳pH值，此时固定化酶活力较大。

图5 固定化温度与pH值对固定化酶活性的影响
Fig.5 Effects of temperature and pH on relative activity of immobilized flavourzyme

2.2 固定化风味蛋白酶的特性

2.2.1 较适反应温度与pH值

风味蛋白酶固定化后，较适反应温度与pH值发生了变化，如图6。

图6 固定化风味蛋白酶的较适温度与pH值
Fig.6 Optimum temperature and pH of immobilized flavourzyme

游离酶与固定化酶在50～70℃范围内，均有较高的酶活性，但游离酶的较适反应温度为50℃，固定化酶的较适反应温度为70℃。酶固定化后较适反应温度升高的原因是酶分子与载体结合后，热稳定性提高，热变性失活速率下降。风味蛋白酶固定化后，较适pH值向偏碱的方向移动。游离酶在pH值7.0时酶活力较高，且较适pH值范围较窄；而固定化酶在pH值8.0时酶活力较高，且在pH值7.5～9.0的范围内均能保持较高的酶活力。

2.2.2 固定化酶的储存稳定性与操作稳定性

与游离蛋白酶相比，固定化风味蛋白酶具有较好的储存稳定性与操作稳定性，如图7。

游离酶储存10 d后酶活力损失95%以上，而固定化酶储存10 d后，酶活力仅损失30%，储存30 d后酶活力仍残留51.9%。风味蛋白酶固定化后可以反复多次使用，并表现出较好的操作稳定性。重复使用5次，酶活力仅损失16%，重复使用11次，残留酶活力仍为56.7%；同时，球形载体仍保持较好的韧性，未见有破碎或变形现象。良好的储存与操作稳定性，有利于固定化风味蛋白酶在食品工业中的推广与应用，可以延长使用时间、增加使用次数，降低生产成本。

图7 固定化风味蛋白酶的储存稳定性与操作稳定性
Fig.7 Storage and operational stability of immobilized flavourzyme

3 结 论

可用于制备固定化酶的载体很多，但壳聚糖载体由于化学性质稳定，机械强度高、比表面积较大、孔隙率高、内扩散阻力小，被认为是较有工业应用潜力的固定化酶载体［17］。以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用共价交联法制备固定化风味蛋白酶的较适条件为ω（壳聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交联时间6 h，载体中酶的质量分数40 mg/g载体，于35℃、pH 5.5条件下固定化反应10 h。固定化后，风味蛋白酶较适反应温度从50℃提高至70℃，较适pH值从7.0提高至8.0，且可保持较高酶活力的温度与pH值范围均有所扩大。

固定化风味蛋白酶保持了游离酶的高效、专一及温和的酶催化特性，具有良好的储存稳定性和操作稳定性，可反复多次使用，分离回收容易，使用效率高；酶反应过程可以控制，大大简化了生产工艺，适宜于在工业生产中推广应用。

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Preparation and Properties of Immobilized Flavourzyme on Globular Cross-linked Chitosan

SHI Guangbo1，MA Yanfang1，ZHENG Minggang2，SUN Zhongtao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique of State Oceanic Administration，Qingdao 266000，China）

Abstract:The preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan，with glutaraldehyde as crosslinking agent，were investigated.The optimal concentration of chitosan，NaOH and glutaraldehyde was 2.5%，3%，and 0.5%，respectively，and the optimal crosslinking time was 6 h.The optimal flavourzyme dosage was 40 mg/g carrier，and the optimal immobilizing reaction temperature，pH，and time was 35℃，pH 5.5，and 10h，respectively.After immobilized，the optimal reaction temperature of flavourzyme was improved from 50℃to 70℃，and the optimal pH value was improved from 7.0 to 8.0.Moreover，the ranges of temperature and pH for keeping the higher enzyme activity had been extended.The stability of storage and operation of the immobilized flavourzyme was good enough to be reused for many times，which suggested that the immobilized flavourzyme was suitable for the wide applications in industry.

Key words:flavourzyme；immobilization；globular cross-linked chitosan；enzymatic properties

（责任编辑:李 宁）

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.006

文章编号：2095-6002（2015）04-0027-06

引用格式：师广波，马艳芳，郑明刚，等.壳聚糖固定化风味蛋白酶的制备及其酶学特性［J］.食品科学技术学报，2015，33（4）:27-32.

SHI Guangbo，MA Yanfang，ZHENG Minggang，et al.Preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:27-32.

收稿日期:2014-09-21

基金项目:国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金资助项目（MBSMAT-2014-05）。作者简介:师广波，男，硕士研究生，研究方向为发酵工程与酶工程；

*孙中涛，男，副教授，博士，主要从事发酵工程与酶工程方面的研究。

通信作者。