表面活性剂存在下两相体系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯

钱俊青，李尚谦，仲 翔，郭 辉

（浙江工业大学药学院，浙江杭州 310032）

摘 要：为提高假丝酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的催化效率，采用两相体系中加入表面活性剂形成胶束溶液，然后优化假丝酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯工艺条件。研究表明，与不加表面活性剂的对照组相比，表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵存在的实验组，反应的酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性均有明显提升。假丝酵母脂肪酶在该体系中催化合成蔗糖-6-乙酯的优化工艺条件为：反应介质为仲丁醇/水，其中水质量分数为60%，表面活性剂的浓度为10 mmol/L，乙酸乙烯酯与蔗糖物质的量比为3∶1，反应pH值9，温度35℃，反应时间4 h。在此反应条件下，得到蔗糖乙酯酯化率为71.2%，其中蔗糖-6-乙酯选择性为56.4%。

关键词：表面活性剂；脂肪酶；酯化；蔗糖-6-乙酯

蔗糖-6-乙酯是合成三氯蔗糖的关键中间体［1-3］。三氯蔗糖是目前国内外市场需求量快速增长的功能性甜味剂，具有甜度高、无能量、味质好、安全性高等优点，是肥胖症、心血管病和糖尿病患者理想的辅助治疗产品，应用前景广阔［4-6］。蔗糖有八个羟基，每个羟基都能被亲电试剂酰化，产生不同取代位置、不同取代度的蔗糖酯，因此，如何选择性高效合成蔗糖酯是国内外研究的难点。目前合成蔗糖酯常用化学法和酶法，化学法易于工业化生产，但由于蔗糖的8个羟基反应活性相近，所以酯化反应作用位点较难控制［7-8］，要得到特定位点酯化的单一产物往往比较困难，需要冗长的保护和去保护步骤；此外，化学合成中多种有毒试剂的使用在一定程度上降低了产品的食品安全性。这些弊端促使较多的学者将研究重点转向酶法合成蔗糖酯。酶法合成可利用蔗糖直接酯化的方法，具有合成路线短，操作简单，反应条件温和等优点，而良好的区域选择性更是酶催化合成的特色，因此酶法合成越来越被广泛地研究和应用［9-11］。

已有文献表明，在含水体系中可以进行酯化反应，而且通常反应在短时间内可以达到较大的酯化率［12-14］。由于蔗糖在水中的溶解度明显高于有机溶剂，可显著提高反应底物浓度，提高反应效率，因此，含水两相体系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯具有良好的应用前景。据文献报道，表面活性剂可以大大增加两相体系中两相间的合成反应速率，减少副反应的发生，增加目标化合物的选择性［15-17］。表面活性剂在其浓度超过临界胶束浓度（CMC）后会形成胶束，对有机相中的物质起到水相增溶作用，可扩大两相界面间接触，同时还受到局部浓集效应、静电效应、极性效应等影响，能够有效促进合成反应在两相中的进行。本研究是采用水与有机溶剂两相体系中加入表面活性剂形成胶束溶液，以假丝酵母脂肪酶进行催化反应，探索了假丝酵母脂肪酶在该体系中催化合成蔗糖-6-乙酯的工艺过程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔗糖及所有有机溶剂均为国产分析纯；假丝酵母脂肪酶（candida rugosa lipase，CRL）（10 000 U/g），购于北京高瑞森科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；Alltech 3300型蒸发光检测仪（ELSD），美国格雷斯公司；TH2-82A型恒温水浴振荡器，金坛市江南仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 蔗糖-6-乙酯合成方法

将4 mmol蔗糖、0.1 g酶、12 mmol乙酸乙烯酯、0.1 mmol表面活性剂、6 mL蒸馏水、4 mL醇类溶剂置于50 mL具塞三角瓶中，放入恒温摇床，180 r/min振荡。35℃条件下反应5 h，每隔一定时间用6 mol/L NaOH调节反应液至初始pH值。

1.3.2 产物分析方法

采用高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLCELSD）对产物进行分析。反应结束后，沸水浴5 min使得脂肪酶失活，其中反应液中的有机溶剂基本可挥发除去，将剩余的反应液定容至100 mL，膜过滤后进行高效液相分析，每组做3个平行实验。色谱条件:ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相:去离子水，流速0.8 mL/min，柱温30℃，进样量5 μL。蒸发光检测器温度85℃，氮气流速1.5 L/min。记录色谱图，计算酯化率和蔗糖-6-乙酯的选择性，见式（1）、式（2）。

2 结果与分析

2.1 表面活性剂种类对反应的影响

表面活性剂的分子结构和极性是影响两相体系胶束催化的重要因素。实验组中分别加入阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、十二烷基硫酸钠（SDS），非离子表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（Tween-80）、失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span-80），以及不加表面活性剂的空白对照样品，观察在两相体系中表面活性剂种类对蔗糖-6-乙酯合成的影响。实验结果如表1。

表1 不同表面活性剂种类对合成蔗糖-6乙酯反应的影响
Tab.1 Influences of different type of surfactants on synthesis of sucrose-6-acetate%

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由表1可知，加入阳离子表面活性剂CTAB，酯化率比空白对照提高许多，原因一是因形成的胶束产生了反应界面扩大效应，使反应物之间接触概率大增；二是因在偏碱性催化酯交换反应中，阳离子表面活性剂形成的胶束的正电荷能使反应中间体（带负电荷）易于形成。同理，由于阴离子表面活性剂形成的胶束所带的负电荷不利于反应中间体的形成，其酯化率比空白组有所下降。非离子表面活性剂形成的胶束不带电，对中间体产生无影响，所得到的酯化率比空白组略有提高。同时，我们观察到加入表面活性剂CTAB的实验组具有较高的蔗糖-6-乙酯选择性，因此，表面活性剂选择为CTAB。

2.2 两相体系中有机溶剂对反应的影响

在反应的水和有机溶剂两相体系中，由于有机溶剂极性的差异，使其与底物形成不同空间取向的结合，从而使酶与底物形成不同的活性中间态而影响产物的生成。本实验选取了无毒性的醇类有机溶剂作为反应介质，实验结果如表2。

由表2可知，选择仲丁醇-水两相体系作为反应介质，合成蔗糖-6-乙酯时具有较高的酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性，这可能与仲丁醇的刚性结构有关。因此选取仲丁醇作为反应体系中的有机溶剂。

2.3 两相体系中水质量分数对反应的影响

水质量分数是两相体系中合成蔗糖酯的一个重要因素。相比于有机溶剂，蔗糖在水中具有非常好的溶解性，增加水质量分数可以提高反应体系的传质，但水的存在也会引起反应底物乙酸乙烯酯和产物蔗糖-6-乙酯的水解。因此考察了水质量分数对酶催化合成蔗糖-6-乙酯的影响，实验结果如图1。

表2 有机溶剂对合成蔗糖-6-乙酯反应的影响
Tab.2 Influences of organic solvents on synthesis of sucrose-6-acetate%

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图1 水质量分数对合成蔗糖-6-乙酯的影响
Fig.1 Influences of water content on synthesis of sucrose-6-acetate

由图1可知，随着体系中水质量分数的增加，反应产物酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性均有所提高，在水质量分数为60%时，酯化率达到最大；超过60%后，酯化率显著下降，蔗糖-6-乙酯选择性也有所下降。故体系中水质量分数确定为60%。

2.4 底物物质的量比对反应的影响

乙酸乙烯酯是较为活泼的酰基供体。在蔗糖转酯化反应中，若乙酸乙烯酯的量超过一定的范围，会继续与产物蔗糖单酯发生反应，生成蔗糖多酯。因此乙酸乙烯酯的加入量会对反应产生重要的影响，选择不同底物物质的量比（乙酸乙烯酯/蔗糖），考察其对蔗糖-6-乙酯合成的影响，实验结果如图2。

由图2可知，随着乙酸乙烯酯与蔗糖物质的量比的增加，酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性同时升高，当物质的量比超过3时，蔗糖-6-乙酯选择性开始下降，其原因是蔗糖分子上其他位羟基接触到乙酸乙烯酯活性中间体的机会增加，影响选择性，且过多的乙酸乙烯酯水解不利于对体系pH值的控制，也影响酯化率。因此实验中采取底物物质的量比为3∶1。

2.5 体系pH值对反应的影响

pH值对酶的活性具有极为显著的影响，通常酶只有在一定的pH值范围内才能表现出活性。选用6 mol/L NaOH将去离子水的pH值调成一定梯度，考察体系pH值对蔗糖-6-乙酯合成的影响，实验结果如图3。

图2 底物物质的量比对蔗糖乙酯合成的影响
Fig.2 Influences of molar ratio of substrates on synthesis of sucrose-6-acetate

图3 反应pH值对蔗糖-6-乙酯合成的影响
Fig.3 Influences of pH on synthesis of sucrose-6-acetate

由图3可知，体系pH值对蔗糖-6-乙酯的合成影响较大。当pH值低于7时，即在偏酸性环境时，酯化率很低，然后随着pH值的增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性都不断上升。当pH值达到9.0时，酯化率和蔗糖6-乙酯选择性同时达到最大，此后又随着pH值的进一步增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性都出现较快下降。其原因是pH值过低或过高，都会使生成的蔗糖酯更易发生水解，并会使脂肪酶失活。

2.6 温度对反应的影响

在酶催化反应中，温度的改变直接影响着酶的催化活性。温度过低时，酶催化活性较低，催化速率较慢；当温度过高时，酶可能因为结构发生改变而失活。选择不同的反应温度，研究不同温度条件下蔗糖-6-乙酯的合成情况，实验结果如图4。

图4 反应温度对酯化率的影响
Fig.4 Influences of reaction temperature on synthesis of sucrose-6-acetate

由图4可知，随着温度的升高，酶的活性上升，当温度达到35℃时，酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性都达到最大。而后再升高温度，酶活性开始下降，酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性也随之下降。故选择35℃为本反应体系中的最适反应温度。

2.7 时间对反应的影响

在两相体系中加入表面活性剂形成胶束反应体系，可以显著地增加两相间反应物的反应速率。因此，对不同时间酯化率以及蔗糖-6-乙酯选择性的变化情况加以考察，实验结果如图5。

图5 反应时间对酯化率的影响
Fig.5 Influences of reaction time on synthesis of sucrose-6-acetate

由图5可知，当反应达到4 h时，酯化率达到71.2%，蔗糖-6-乙酸酯选择性为56.4%。随着反应继续，酯化率的变化不再明显，这表明在本反应体系中比传统有机溶剂中合成蔗糖酯的反应速率要快许多。4 h后蔗糖-6-乙酯选择性下降较为明显，其原因是生成的蔗糖单酯已转化为蔗糖多酯，导致蔗糖-6-乙酯选择性下降。

3 结 语

探索了表面活性剂存在下，在水-仲丁醇两相体系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的反应。发现加入表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）后，脂肪酶在胶束体系中催化合成蔗糖-6-乙酯较双水相体系的酯化率和蔗糖-6-乙酯选择性均有较大提升。经实验优化的反应工艺条件为:反应介质为仲丁醇/水，其中水质量分数为60%，乙酸乙烯酯与蔗糖物质的量比为3∶1，反应pH值9.0，温度35℃，反应时间4 h。在此反应条件下，得到蔗糖乙酯酯化率为71.2%，其中蔗糖-6-乙酯选择性为56.4%。本研究的反应体系以及工艺优化条件可为酶法催化合成蔗糖-6-乙酯提供实验依据，为进一步开发利用甜味剂三氯蔗糖提供理论指导。

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Enzymatic Synthesis of Sucrose-6-Acetate in Two-Phase Medium with Surfactant

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，GUO Hui（School of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Abstract:In order to increase the yield of sucrose-6-acetate which is catalysed by candida rugosa lipase，the method of this paper was that the surfactant was added into the two-phase system to formate the micelles，then use the candida rugosa lipase as catalyst to synthesis sucrose-6-acetate.The results showed that compared with the control group，the esterification rate and sucrose-6-acetate rate significantly increased in surfactant cetyltrimethyl ammonium bromide group.The optimum conditions as followed:reaction medium is butanol/H2O，content of water is 60%，the concentration of surfactant is 10 mmol/L，n（vinyl acetate）∶n（sucrose）is 3∶1，pH 9，reaction at 35℃for 4 h.The sucrose acetate esterification rate is 71.2%，the selectivity of sucrose-6-acetate is 56.4%.

Key words:surfactant；lipase；esterification；sucrose-6-acetate

（责任编辑:叶红波）

中图分类号：TS202；Q814.9

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.005

文章编号：2095-6002（2015）04-0022-05

引用格式：钱俊青，李尚谦，仲翔，等.表面活性剂存在下两相体系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯［J］.食品科学技术学报，2015，33（4）:22-26.

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，et al.Enzymatic synthesis of sucrose-6-acetate in two-phase medium with sur factant［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:22-26.

收稿日期:2015-05-19

作者简介:钱俊青，男，教授，博士生导师，主要从事食品酶法加工方面的研究。