DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.012
中图分类号:O657.63;|TS255.7
QuEChERS-UPLC-MS/MS测定果蔬中4种残留抗凝血杀鼠剂
宋薇， 杨柏崇， 赵永彪， 宋桂雪
| 【作者机构】 | 谱尼测试科技股份有限公司 |
| 【分 类 号】 | O657.63;TS255.7 |
| 【基 金】 |
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QuEChERS-UPLC-MS/MS测定果蔬中4种残留抗凝血杀鼠剂
摘 要:采用QuEChERS前处理方法,结合超高效液相色谱-串联质谱技术建立了测定蔬菜、水果中灭鼠灵、杀鼠迷、溴鼠灵、氟鼠酮等4种抗凝血杀鼠剂残留量的方法.于Waters DisQue提取管中,粉碎匀浆的样品由含体积分数1%乙酸的乙腈提取并净化后,UPLC BEH C18液相色谱柱分离,流动相用甲醇和含5mmol/L乙酸铵和体积分数0.1%甲酸的水溶液梯度洗脱,ESI-[M-H]-电离,多反应监测模式,外标法定量.对比在DisQue净化管中分别补加PSA(N-丙基二乙胺键合硅胶)和GCB(石墨化碳黑)填料净化对回收率的影响,结果显示5 mg的GCB可以取得满意的效果.方法中灭鼠灵和杀鼠迷在0.5～100μg/L线性相关,方法检出限为0.25μg/kg,溴鼠灵和氟鼠酮在2～250μg/L线性相关,LOD为1.0μg/kg.在低、中、高三个添加水平的加标回收率为86%～128%,相对标准偏差2.4%～16%.
关键词:抗凝血杀鼠剂;果蔬残留;灭鼠灵;杀鼠迷;溴鼠灵;氟鼠酮
4-羟基香豆素类抗凝血杀鼠剂(4-hydroxyl coumarin anticoagulant rodenticides)是目前国内外常用的一类缓效灭鼠剂[1-2].该类杀鼠剂能在鼠体内竞争性地抑制维生素K,阻碍凝血酶原的合成,从而使其内出血而死亡[3-4].4-羟基香豆素类抗凝血杀鼠剂,如第1代抗凝血杀鼠剂灭鼠灵、杀鼠迷,第2代杀鼠剂溴鼠灵、氟鼠酮、溴敌隆等,都在野外和室内大量使用,有污染到粮食和果蔬的可能性.抗凝血杀鼠剂有相当高的毒性,如溴鼠灵属于高毒,大鼠经口LD50为0.27mg/kg[5].目前,美国登记使用的10种灭鼠剂中有杀鼠灵、氯鼠酮、敌鼠、大隆、溴敌隆、噻鼠灵等6种抗凝血灭鼠剂[2].日本对蔬菜、水果、谷物中的溴鼠灵、杀鼠酮、杀鼠灵分别规定了最大残留限量(maximum residue limits,MRL)0.001mg/kg[6].澳大利亚对溴鼠灵、噻鼠酮、敌鼠、氟鼠酮、灭鼠灵等杀鼠剂也有规定,规定灭鼠剂中作为诱饵,不与农作物、食品或种植作物的土壤接触;对甘蔗、豆类、谷物中溴鼠灵的MRL分别规定为0.5,0.02,0.02 μg/kg[7].我国政府有关部门要求各地加强农药监管,整顿和规范农药市场秩序,严厉打击违法制售禁限用高毒农药行为.国家发展和改革委员会第21号令《产业结构调整指导目录》(2013年修正),发布农药产业政策来限制高毒、高残留以及对环境影响大的农药原药的生产,其中就包括敌鼠钠、敌鼠酮、杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆、溴鼠灵.
杀鼠剂多残留检测常见于人和动物中毒案例中血液、尿液以及其他生物样本中高含量杀鼠剂的测定[8-12],而对植物产品中杀鼠剂残留的研究却较少.宓捷波等采用乙腈提取,碱性氧化铝小柱净化,高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了蔬菜、水果中4种灭鼠剂[13]和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测食品中 11种灭鼠剂的方法[14],但其前处理方法较繁琐,耗用试剂较多,不太适合大批量样品的快速检测.Osman等[15]用丙酮提取,固相萃取小柱净化,气相色谱-质谱检测8种蔬菜的23种农药残留(包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂和杀鼠剂),结果发现杀鼠灵在黄瓜和卷心菜中有检出.常见分析动物样本中杀鼠剂残留的前处理方法有液液萃取[10-12]、QuEChERS[12]等;分析蔬菜、水果中杀鼠剂前处理主要以液液萃取,固相萃取柱富集净化[13-15]等方法;分析手段以 GC-MS[15]、HPLC[9,12]、LC-MS或LC-MS/MS[9-11,13-14]为主.
传统的液液萃取,固相萃取柱富集净化,前处理步骤长、效率低、耗费大量溶剂.2003年Anastassiades等[16]开发了一种农药多残留分析的QuEChERS 法(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe).该方法是基于分散固相萃取(dispersive solid phase extraction,DSPE)进化而来.DSPE方法结合GC-MS 和LC-MS/MS已经广泛应用到蔬菜、水果、粮食等多种食品中农药残留[17-18]、生物碱[19]、真菌毒素残留[19]等物质的检测.针对不同基质和检测项目,研究者推出多种优化方案[20],如改变取样量、提取溶剂、净化材料和浓缩净化液等.根据QuECHERS法检测果蔬中多种农药残留的美国分析化学家组织(AOAC)2007.01方法[21]和欧洲标准化委员会EN 15662:2008方法[22]己被广泛采用.我国 NY/T 1380—2007检测果蔬中51种农药残留的方法也使用了QuEChERS-GC/MS法[23].
随着人们对果蔬的食用安全越来越关注,许多大型连锁超市也提出农产品质量控制体系,加强了对抗凝血杀鼠剂检测,我国暂没有检测果蔬中4-羟基香豆素类抗凝血杀鼠剂的国家标准和行业标准方法.本文选择了4-羟基香豆素类抗凝血灭鼠剂中典型的第1代和第2代杀鼠剂中灭鼠灵、杀鼠迷、溴鼠灵、氟鼠酮等4种杀鼠剂来研究蔬菜、水果中杀鼠剂多残留的检测方法.采用QuEChERS法进行前处理,利用UPLC-MS/MS进行定量检测.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇,乙腈,色谱纯,美国Fisher公司;乙酸铵,色谱纯,日本TCI公司.
杀鼠迷(CAS 5836-29-3),质量分数为98.0%;灭鼠灵(CAS 81-81-2),质量分数为98.0%;溴鼠灵(CAS 56073-10-0),质量分数为96.0%;氟鼠酮,又称氟鼠灵(CAS 90035-08-8),质量分数为98.0%,标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司.
超纯水采用Mill-Q型超纯水机制备,美国Millipore公司.实验用的白菜、黄瓜、苹果、猕猴桃、木瓜等果蔬,均购自于北京某大型超市.
实验中采用DisQue提取管和净化管套装,美国Waters公司;DisQue提取管是50 mL离心管中预装1.5 g无水乙酸钠和6 g无水硫酸镁;净化管是2 m L离心管中预装入150 mg无水硫酸镁和50 mg的氨基吸附剂N-丙基乙二胺键合硅胶(primary secondary amine,PSA);PSA,粉状,天津艾杰尔公司;石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)粉,美国Waters公司.
标准溶液配制是分别称取适量的标准品,甲醇溶解,定容得1 000 mg/L标准贮备液(4℃储存).配置合适浓度的标准中间液,再经甲醇逐级稀释得到相应的标准工作液.基质标准溶液的配制是利用阴性样品用乙腈提取,经离心后的提取液净化后,配制系列基质标准曲线工作溶液.
1.2 仪器与设备
ACQUITY TQD型UPLC-MS/MS(配有ESI源),美国Waters公司;Vertex Genie型涡旋混合器,美国Scientific Industries公司;Mill-Q超纯水器;Philips家用粉碎机.
1.3 提取方法
测试样品去表面明显的土壤和其他杂质,不清洗,粉碎匀浆.取样10.0 g(精确到0.001 g),加入到50mL提取管中,加入含乙酸体积分数1%的乙腈,加盖迅速摇匀,涡旋混匀1 min,于4 000 r/min离心5min;取1.5m L上清液,加入到净化管中,混合震荡涡旋1min.如果需要再加入PSA或GCB吸附剂,则再涡旋混匀1 min,于4 000 r/min离心,取上清液,过0.22μm滤膜,上机待测.外标法定量.
1.4 分析方法
1.4.1 色谱条件
ACQUITY UPLC BEH型C18色谱柱(2.1mm× 100mm,粒径1.7μm).流速0.25mL/min,柱温40℃.流动相A是甲醇,流动相B是含5 mmol/L乙酸铵和含体积分数0.1%甲酸的水溶液.梯度洗脱条件: 0～3.0 min 40%A,3.0～5.5 min 90%A,5.5～ 8.0min 40%A.
1.4.2 MS/MS条件
ESI[M-H]-模式;MRM多反应监测;电喷雾电压3 kV,离子源温度100℃;去溶剂温度400℃.4种杀鼠剂分子量、保留时间、离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1.
表1 4种杀鼠剂分子量、保留时间、离子对、锥孔电压、碰撞能量
Tab.1 Molecular weights,retention times,ion pairs,cone voltages and collision energies of four rodenticides
注:*为定量离子
序号 名称 保留时间/min母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV 1 灭鼠灵 3.37 307.1 161* 250 20 25 2 杀鼠迷 3.61 291.1 141* 93 45 45 45 25 3 溴鼠灵 5.06 521.2 135* 143 45 45 45 40 4 氟鼠酮 4.63 541.3 161* 289 65 65 60 60 45 40
2 结果与分析
分析步骤与BS EN 15662:2008[22]检测蔬菜水果中的农药残留步骤相同,区别在于所用的是Dis-Que提取管和净化管.QuEChERS法要求蔬菜、水果中的水分含量一般应大于80%,否则需要加入适量的水,使水分含量在80%～90%左右.而实验中蔬菜、水果的含水量都大于85%,满足要求.
2.1 色谱条件和质谱条件的优化
使用UPLC-MS/MS分析速度快、灵敏度高,已作为分析痕量农药残留的首选.电喷雾正、负离子检测方式下,都能同时检测到该4种待测物,但在负离子模式下,基线噪声低、信噪比高,故选择ESI源负离子MRM模式进行监测.根据液质定性分析规则,确证应选择1个母离子,2个定性离子.我们选择2对分子离子峰,设定合适的峰保留时间,并确保色谱峰的采样点数在20个点,从而得到较好的定量重复性.优化后的质谱参数见表1.由于较高比例的甲醇流动相直接梯度洗脱效果不佳,4种杀鼠剂分离度差,因此在梯度洗脱初期保持5mmol/L乙酸胺-甲醇(60∶40,V/V)流动相冲洗约3 min,确保目标物在液相柱上获得吸附保留,然后再用高比例的甲醇一次梯度洗脱,获得满意的分离效果.
2.2 样品前处理方法
由于4种杀鼠剂都较难溶于水,在非极性溶剂苯、正己烷等溶解度低,在丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯等极性较强有机溶剂中溶解度好.实验发现丙酮和乙酸乙酯提取时,提取液中的色素等杂质较多,造成的基质效应高,而乙腈的极性接近甲醇,且采用乙腈提取回收率高,也适用于液相色谱质谱系统.用商品化的提取管和净化管处理样品效率高、试剂用量少、环保,最后选用QuEChERS法.
2.3 基质标准曲线
蔬菜、水果含色素较多,如叶绿素、叶黄素、花青素、类胡萝卜素等,会造成较强的基质效应.利用QuEChERS法前处理后,发现有基质增强效应.分别实验了白菜和黄瓜样品中3个浓度梯度加标回收,平行测定3次.加标回收率多在96%～140%,个别的达144%～164%,相对标准偏差也多超过10%.降低基质效应常用的方法是配制基质标准曲线,我们实验用空白基质做标准曲线,测定了白菜的加标回收,回收率明显下降.4种目标物的加标回收率分别为76.7%,96.7%,121%和101%,R2在0.990～0.995之间,但对含叶绿素较多的黄瓜样品,空白基质曲线的效果并不理想.分析原因,主要是含有PSA的净化管净化不充分.
2.4 石墨化碳黑对基质效应的影响
PSA是氨基吸附剂,属一种弱阴离子交换吸附剂,能通过氢键去除脂肪酸、糖类及其他基质共萃取物[24].净化管中PSA可净化提取液,但单一的PSA填料对色素的去除能力较弱.GCB是一种经过高温处理的碳黑材料,表面有光滑、无孔的石墨晶型结构,GCB对含有芳香环、结构具有一定对称性和平面的农药分子吸附力最强,对叶绿素、叶黄素、番茄红素和胡萝卜素等极性强的色素都有很强的吸附[25],而 C18硅胶粉去除色素的效果不如 GCB. C18柱除色素的效果不如Carb柱,不过C18可以除去极性样液中的非极性杂质.
对于像黄瓜这种含叶绿素高的样品,发现只用净化管自带的PSA,效果不理想,除溴鼠酮外,灭鼠灵、杀鼠迷、溴鼠灵,回收率达139%～166%.分别实验了补加PSA和GCB来去除色素、降低基质效应,结果见图1.首先,实验增加PSA用量对加标回收的影响.原净化管中含PSA 50mg,再增加PSA的用量,发现随着PSA的量从50 mg增加到106 mg, PSA对灭鼠灵、杀鼠迷、溴鼠灵、氟鼠酮都有强烈的吸附,有的回收率降低到50%以下.然后,又实验了补加GCB对加标回收率的影响.向净化管中加入3mg和5 mg GCB,充分振荡后,提取液颜色有明显的降低,且对4种杀鼠剂的回收率影响不大,回收率在88%～121%之间.而加入10mg GCB时,回收率有所降低,尤其GCB对溴鼠灵的吸附较大,回收率从88%降低到了56%.因此,对于2 mL的净化管,加入5 mg的GCB就可以有效去除色素,降低基质效应.如果有的样品脱色效果不好,可适量增加GCB用量,但不应过多.
图1 PSA和GCB的用量对净化黄瓜基质的影响
Fig.1 Influences of PSA and GCB amounts on the spiked recoveries on cucumbers
2.5 方法的检出限
配制4种杀鼠剂的标准溶液,采用5个不同浓度绘制标准曲线,见表2.由于灭鼠灵、杀鼠迷的仪器响应比溴鼠灵、氟鼠酮高,因此配制标准工作溶液时,后两者的浓度配置为前两者的5倍.经计算,灭鼠灵、杀鼠迷的仪器检出限(instrumental detection limits, IDLs)可达0.15μg/L,在0.5～100μg/L成线性,溴鼠灵、氟鼠酮IDL 0.5μg/L,在2～250μg/L成线性.
表2 4种杀鼠剂线性回归方程
Tab.2 Linear regression equations of four rodenticides
目标物 线性回归方程线性范围μg/L R2LOD μg/kg LOQ μg/kg灭鼠灵 y=53.11x +5.26 0.5～100 0.996 0.25 0.83杀鼠迷 y=48.14x+1.14 0.5～100 0.995 0.25 0.83溴鼠灵 y=9.13x+4.96 2～250 0.997 1.0 3.3氟鼠酮 y=27.82x +6.99 2～250 0.995 1.0 3.3
用阴性黄瓜测试方法精密度,灭鼠灵、杀鼠迷加标浓度都为10μg/L,溴鼠灵、氟鼠酮加标浓度都为50μg/L,平行测定8次,计算峰面积的标准偏差为3.9%～7.1%.以定量离子信噪比(S/N)=3倍的响应值作为方法检出限(limit of detection,LOD),灭鼠灵、杀鼠迷LOD皆为0.25μg/kg,溴鼠灵、氟鼠酮LOD皆为1.0μg/kg.以定量离子S/N=10的响应值来计算方法定量限(limit of quantitation,LOQ). MRM标准溶液质量色谱图、样品加标的总离子流图、样品加标的MRM质量色谱图见图2和图3.
2.6 加标回收率
通过以上的条件优化,利用QuEChERS法,净化管中补加5 mg GCB,分别实验了阴性白菜、黄瓜样品中4种杀鼠剂的3个浓度梯度进行加标回收:灭鼠灵、杀鼠迷加标浓度分别为1,5,10μg/L,溴鼠灵和氟鼠酮加标浓度分别为2,25,50μg/L,以各自的定量离子对进行外标法定量.结果见表3.白菜和黄瓜中加标回收率在 86% ～128%, RSD(n=6)2.4%～16%.
对某些含色素较低的样品,净化管净化后,可以用空白试样配制基质曲线可以降低基质效应[26-27].对某些含色素较高,且配制基质标准曲线也难以达到要求的样品,可以考虑在净化管中补加GCB来加强净化.
3 结 论
采用QuEChERS法提取、净化,并结合UPLCMS/MS技术建立了蔬菜、水果中灭鼠灵、杀鼠迷、溴鼠灵和氟鼠酮等4种4-羟基香豆素类抗凝血杀鼠剂残留量的方法.QuEChERS法方法简便,极大提高了工作效率,适合于大批量样品的快速检测.仪器分析采用UPLC-MS/MS,运行时间快,只有5～6min.该方法对灭鼠灵、杀鼠迷 LOD均为0.25μg/kg, LOQ为0.83μg/kg,溴鼠灵、氟鼠酮LOD均为1.0 μg/kg,LOQ为3.3μg/kg.
图2 4种杀鼠剂标准溶液MRM质谱
Fig.2 MRM mass spectra of four rodenticides standards
图3 黄瓜加标样品的MRM图及总离子流图TIC
Fig.3 MRM mass spectra and TIC of cucumber with spiked standards
表3 4种杀鼠剂在白菜和黄瓜中的加标回收率
Tab.3 Spiked recoveries of four rodenticides in Chinese cabbage and cucumber
注:n=6
目标物 加标浓度/ (μg·L-1黄瓜测定值/(μg·L-1) 回收率/% RSD/% 测定值/(μg·L-1) 回收率白菜) /% RSD/% 1.20 120 18.1 1.04 104 2.4灭鼠灵 5 5.70 114 7.4 5.9 118 3.8 10 12.3 123 11.3 12.5 125 3.4 1 1.13 113 13.1 1.24 124 16.1杀鼠迷 5 5.06 101 4.3 6.4 128 11.3 10 11.9 119 13.7 12.2 122 12.0 1 5.40 108 14.5 5.4 108 6.5溴鼠灵 25 26.8 107 17.0 28.6 114 11.7 50 63.2 126 15.8 48.3 96.6 6.7 5 4.30 86.0 12.9 5.5 110 8.3氟鼠酮 25 31.9 128 16.9 32 128 7.6 5 50 49.6 99.2 3.6 55.1 110 14.0
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Determ ination of Four Anticoagulant Rodenticides Residues in Vegetables and Fruits using QuEChERS-UPLC-MS/MS
Abstract:Using the QuEChERS pretretment,a method was established to detectwarfarin,coumatetralyl,brodifacoum,and flocoumafen in vegetables and fruits with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Grounded and homogenized samples were extracted using acetonnitrile containing 1%(V/V)glacial acetic acid in Waters DisQue tubes and cleaned up. Components in the supernatantwere separated by an UPLC BEH C18 column and eluted bymethanol and 5mmol/L ammonium acetate and 0.1%(V/V)formic acid solution with gradient elution.Analysis was accomplished by ESI-[M-H]-with a multiple reaction monitor(MRM)mode and external standard quantification.In order to eliminate matrix effect,DisQue purification tubes with additional PSA and GCB,were tested and discussed.The results showed that5mg GCB had good effects.Moreover,warfarin and coumatetralyl were in a linear corelation with the range of 0.5-100μg/L and the detection of limits(LOD)was0.25μg/kg.Brodifacoum and flocoumafen were in a linear correaltion with the range of2-250μg/L and the LOD was1.0μg/kg.Spiked recoveries at low,medium,and high concentration levelswere in the range of 86%-128%with RSD of 2.4%-16%.
Key words:anticoagulant rodenticides;residues in vegetables and fruits;marfarin;coumatetralyl;brodifacoum;flocoumafen
(责任编辑:李 宁)
中图分类号:TS207.3
文献标志码:A
doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.012
文章编号:2095-6002(2014)03-0065-07
引用格式：宋 薇,杨柏崇,赵永彪,等.QuEChERS-UPLC-MS/MS测定果蔬中4种残留抗凝血杀鼠剂.食品科学技术学报, 2014,32(3):65-71. SONGWei,YANG Baichong,ZHAO Yongbiao,et al.Determination of four anticoagulant rodenticides residues in vegetables and fruits using QuEChERS-UPLC-MS/MS.Journal of Food Science and Technology,2014,32(3):65-71.
收稿日期:2013-09-20
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