专家论坛专栏
编者按：酱油和醋是两种食用历史悠久的传统发酵调味品。不仅在中国，酱油和醋在世界上很多国家和地区都有食用习惯，且由于各地资源不同，酱油和醋的品种与口味也各有差异、各具特色。随着现代食品科技的发展、人们生活质量的提高，发酵调味品的研发在重视口味的基础上，也更加重视消费者日益提高的营养需求。本期栏目特邀专家对酱油和醋的风味与功能性成分研究进行系统阐述，希望为我国发酵调味品产业的基础研究、新产品开发提供有益借鉴。
(栏目策划：李 宁)
酱油是一种传统的发酵调味品，其起源可追溯到我国周朝时期，距今已有2 000多年的历史，是我国及东南亚各国饮食文化的重要代表[1]。近年来，欧美等国家的酱油消费量也逐年增加，酱油已成为世界性的大宗调味品，年产量约为1 000多万t。酱油主要以大豆、豆粕等植物蛋白为原料，辅以面粉或小麦粉等淀粉质原料，在一定盐浓度条件下，利用微生物(如霉菌、酵母菌、细菌、乳酸菌等)的发酵作用，水解原料生成多种氨基酸、肽、有机酸、糖醇和糖类物质，并以此为基础，经过复杂的生物化学变化，形成具有特殊色泽、香气、滋味和状态的调味液[1-2]。
作为调味品，酱油的风味是其品质组成的重要指标，更是影响消费者嗜好性选择的关键因素。酱油中香气物质的贡献可分为以下几个维度，如酸香、醇香、麦芽香、花果香、焦糖香、烟熏香、烘烤香和蔬菜类香(或烤土豆香)等，不同香型的化合物以一定比例组合形成了酱油浓郁的酱香和酯香[2-3]。在滋味上，酱油具有酸、甜、苦、咸、鲜和浓厚味的综合味感，其中咸、鲜味较为突出[4]。酱油的风味复杂而平衡，其中挥发性成分和非挥发性成分是构成酱油独特风味的物质基础，如何全面地解析这些成分和确定关键风味化合物并对其进行有效的调控一直是调味品行业的研究热点。而在“健康中国2030”规划纲要的引领下，人们对食品的营养与健康也提出了更高的要求。有研究表明，除具有独特的风味外，酱油还富含功能活性物质，具有一定的生理功能，如抗氧化[5-6]、抗癌[7-8]、降血压[9]和提高免疫力[10]等。
本文依据风味和生理功能属性，分别总结了酱油中检出的香气、滋味以及功能性化合物，并系统阐述了风味研究方法的进展，探讨了研究中存在的问题，并对今后的研究方向提出建议。
早期酱油风味研究多以传统感官描述结合基础理化指标为主，但随着精密仪器和相关检测技术的发展，分析风味物质的能力得到了显著提升，进一步带动了风味研究的数据信息化，包括定量感官分析、气(液)相及质谱技术的应用等；近年来，精密仪器与感官分析的有机结合，更是推动了关键风味活性化合物的鉴定，其中代表性的研究体系是分子感官组学，包括GC-O/MS、重组缺失实验等技术，帮助科研工作者从庞大的数据系统中关注到具有代表性的风味化合物，明确风味调控的核心目标。
香气物质的分析主要分为感官分析和挥发性物质分析两个部分，挥发性化合物的分析则包括了提取、分离、鉴定、定量以及关键香气物质的分析，见图1。
图1 酱油风味物质的检测技术
Fig.1 Detection technology of flavor substances in soy sauce
根据GB 2717—2018《食品安全国家标准 酱油》的规定，优质酱油的香气描述为浓郁的酱香及酯香。因此，早期的感官评估多以酱香、酯香强度来进行评价。现阶段定量描述分析(quantitative descriptive analysis，QDA)技术[11-12]在研究中使用更为广泛，酱油常用的香气标度为酸香、醇香、麦芽香、花香、果香、焦糖香、烟熏香、烘烤香和烤土豆香等[2-3,12]。QDA方法执行期间，需要感官人员提前熟悉每个香气特征对应标准品的香气，如4-乙基愈创木酚(烟熏香)、4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或4-羟基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF，焦糖香)，然后对样品的特征香气强度进行评估。QDA适用于样品间差异细节的挖掘，以及感官与气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)数据的结合分析，但该方法对感官人员要求相对较高，需要经过一定时长的训练。
挥发性化合物的提取是香气检测的重要前提，酱油香气的提取方法主要包括液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、同时蒸馏萃取(simultaneous distillation and extraction，SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)、溶剂辅助蒸馏萃取(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)和大孔树脂吸附等[2-3,13-14]。本研究团队对比了LLE、SDE、SPME 3种方法对酱油香气分析的影响[2]，发现LLE适用于半挥发性化合物的分析，特别是对呋喃酮和酸类物质萃取效率较高；SDE分析结果中醛类物质含量较高，其提取过程需要保持样品沸腾，高温促使了酱油中的氨基酸、肽与糖类物质的热反应，生成大量的Strecker醛类化合物等[15]，导致分析结果与酱油真实的挥发性物质组成差异较大，因此SDE并不适合于酱油这一类具有较高氨基酸和糖类物质的食品。无溶剂萃取技术SPME近年来使用越来越广泛[12,16]。该方法无需有机溶剂，上样操作简单，能有效地萃取挥发性化合物。但有两点局限，一是由于目标化合物在样品、顶空和萃取头中处于三相平衡状态，其绝对定量的准确度容易受到竞争性吸附及基质效应影响；二是SPME法不适于低挥发性化合物的分析，比如酱油中的3-羟基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮(sotolone)等；为了改善SPME的局限性，新开发的SPME-Arrow萃取技术[17]，可有效改善萃取头对低挥发性化合物的提取效率，值得在酱油中进行应用尝试。此外，SAFE[3]采用高真空、液氮冷凝，可以避免SDE的热效应，较好地还原样品的实际香气特征，同时避免一些难挥发性成分进入GC-MS影响分离效果。然而，SAFE提取过程涉及液氮和真空装置，实验成本高、设备操作相对烦琐，对于酱油样品来说，因其体系以水为主，难挥发性杂质如油脂等含量相对较低，常规LLE法也可基本满足分析测定。整体而言，不同的方法提取效果和针对的物质各有差异，实验过程应根据分析的目标不同择优选用方法，采用不同方法结合来全面分析酱油的香气化合物也是一个较为实用的策略，如采用SPME法和LLE法结合等。
挥发性化合物分离和鉴定技术中，最常用的是气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)。在分离上，近年来多维气相色谱(GC×GC)的应用使得检出化合物的数量大大提高，如酱油中可分离的挥发性化合物从百来种增加到400余种[18]。而在定性技术上，可以分为气相色谱检测器(氢火焰离子检测器FID、氮磷检测器NPD、火焰光度检测器FPD、硫化学发光检测器SCD)，离子迁移谱，及质谱等，其中质谱根据质量分析器类型的不同，又可分为低分辨质谱(单四极杆、三重四极杆、离子阱)和高分辨质谱(如静电场轨道阱质谱Orbitrap-MS、飞行时间质谱TOF-MS)。风味定性一般需要考虑质谱库匹配程度、保留指数(RI)和标准品，通过GC-O嗅闻技术的研究一般还需要核对物质的香气特征。关于酱油风味物质的系统研究，最早的SCI发表于1961年，日本Yokotsuka[19]对日式酱油风味物质进行研究，认为愈创木酚化合物是烹调酱油的特色风味成分。到了80年代，Nunomura等[20-22]利用GC-MS技术从日本酱油酸、中、碱性组分中分离鉴定出93、142及35种挥发性化合物。随后的40年间，酱油的风味研究得到了迅速的发展，特别是中国研究技术手段的升级带来了传统发酵行业的理论研究的热潮。笔者曾对已报道文献进行统计，有近1 038种化合物在酱油中检出。结合气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(gas chromatography-orbitrap/mass spectrometry)，更是有助于GC-MS/O中未知香气活性化合物的分析，如贡献甜香的大马酮[23]。
气相色谱-质谱/嗅闻仪联用技术(GC-MS/olfactory,GC-MS/O)的发展使得关键香气活性化合物的检测成为可能。该技术将GC流出物分成两部分，一半进入质谱检测器分析结构，另一半进入嗅闻口，以感官人员的鼻子作为检测器，感官人员描述嗅闻到的化合物的香气强度和特点[23]。GC-MS/O方法包括香气提取稀释分析(aroma extraction distillation analysis,AEDA)、频次检测法和直接强度法，其中AEDA应用最为常见[24-25]。从2004年开始，至今为止共有近9个团队对中国、日本、韩国、泰国各种代表性工艺的酱油产品进行了深入分析，分别检出了11～94种香气活性化合物[3,13,15,18,25-33]。
酱油中挥发性化合物的种类和数量繁多，已检出的1 038种挥发性化合物[2]主要可分为酸类、醇类、醛类、酮类、酚类、酯类、吡嗪类、呋喃(酮)类、吡喃(酮)类、吡咯类、吡啶类、含硫化合物及含氮化合物等13大类，其具体的数量分布见图2。由图2可知，酯类和醇类是检出数量较多的类别。
图2 酱油中不同种类的挥发性化合物的数量
Fig.2 Number of different kinds of volatile compounds in soy sauce
从2004年开始，韩国的Beak等[26]首次采用固相微萃取-气相色谱-嗅闻联用(SPME-GC-O)对酱油中关键香气活性化合物进行了分析，描述了11种化合物的香气特征。迄今为止，研究者们[3,13,15,18,25-33]采用GC-MS/O技术共在酱油中鉴定出了202种香气活性化合物，根据其检出频次(≥1次和≥5次)的不同，分别做了统计总结，见图3。由图3可知，醇类、醛类、酯类、呋喃(酮)类、酮类是检出关键香气活性化合物较多(≥25个)的化合物类别。但202个化合物中没有一种物质可以完全被描述为“酱油香”或“酱香”，可见酱油的香气是由多种物质按一定比例组成的复杂香气组合。
图3 酱油中不同种类香气活性化合物的数量
Fig.3 Number of different kinds of aroma-active compounds in soy sauce
表1及图4重点列举了酱油中高频检出(≥5次)的31种香气活性化合物及其香气描述词、强度和检出频次。根据香气描述词大致可归纳为酸醇香、麦芽香、花香、果香、焦糖香、烟熏香、烘烤香和蔬菜类香8种香型。
图4 酱油中的关键风味化合物
Fig.4 Key flavor compounds in soy sauce
表1 酱油中检出频次大于等于5的香气活性化合物
Tab.1 Aroma-active compounds with detection frequency greater than or equal to 5 times in soy sauce
序号中文名称英文名称香气描述及频率香气强度a(0～5分)检出频次b(n=14)酸香和醇香1乙酸aceticacid酸味100%,醋味25%2.782乙醇ethanol醇味100%,溶剂味33%2.9632-甲基丁酸2-methylbutanoicacid奶酪味75%,酸臭汗味63%2.1843-甲基丁酸3-methylbutanoicacid奶酪味64%,酸臭汗味64%2.311均值2.58麦芽香52-甲基-1-丁醇2-methyl-1-butanol麦芽香100%2.1663-甲基-1-丁醇3-methyl-1-butanol麦芽香80%,酸败味20%2.81072-甲基丙醛2-methylpropanal麦芽香100%,坚果香50%2.4682-甲基丁醛2-methylbutanal麦芽香91%,杏仁香36%2.91193-甲基丁醛3-methylbutanal麦芽香91%,杏仁香36%2.511均值2.69花香10苯乙醇2-phenylethanol花香58%,甜香33%,蜂蜜香25%4.01211苯乙醛benzeneacetaldehyde蜂蜜香82%,花香55%3.211均值3.612果香12乳酸乙酯ethyl2-hydroxypropanoate果香80%,饼干味33%,甜香33%2.76132-甲基丁酸乙酯ethyl2-methylbutanoate果香80%2.4514乙酸乙酯ethylacetate果香66%,刺激味33%2.1615异丁酸乙酯ethyl2-methylpropanoate果香100%2.47均值2.46焦糖香163-羟基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮3-hydroxy-4,5-dimethyl-2(5H)-furanone(so-tolone)调味料100%,焦糖80%4.55174-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone(HDMF)焦糖香100%,甜香57%2.87184-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、4-羟基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanone、4-hydroxy-2-methyl-5-ethyl-3(2H)-furanone(HEMF)焦糖香92%,甜香38%3.613193-羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮(麦芽酚)3-hydroxy-2-methyl-4H-pyran-4-one(Maltol)焦糖香91%,甜香45%2.611均值3.49烟熏香202,6-二甲氧基苯酚2,6-dimethoxyphenol烟熏香50%,焦香33%,辛辣味33%2.6621愈创木酚2-methoxyphenol焦香82%,烟熏香55%3.311224-乙烯基愈创木酚4-vinyl-2-methoxyphenol辛辣味64%,焦香45%,烟熏香36%3.311234-乙基愈创木酚4-ethyl-2-methoxyphenol烟熏83%,焦香培根味33%,培根味33%3.412均值3.110烘烤香242,6-二甲基吡嗪2,6-dimethylpyrazine烘烤坚果香66%,坚果香33%2.76252,3,5-三甲基吡嗪2,3,5-trimethylpyrazine焦香38%,烘烤香25%,巧克力香25%2.38262-乙酰基吡咯2-acetylpyrrole烘烤香40%,巧克力香40%3.3527糠醛furfural烘烤香40%,杏仁香40%,坚果香40%2.65均值2.76蔬菜类香281-辛烯-3-醇1-octen-3-ol蘑菇香100%2.6829二甲基三硫dimethyltrisulfide煮熟的洋葱味78%,硫黄味33%3.09303-甲硫基丙醇3-(methylthio)propanol烤土豆香67%,生土豆香22%2.69313-甲硫基丙醛3-(methylthio)propanal烤土豆香100%4.212均值3.110
a:对14篇关于酱油GC-O分析的文献[3,13,15,18,25-33]进行的分析，对每篇文献中该物质香气强度或稀释因子值(FD)进行0～5分标准化计算处理，计算得到的香气强度均值。b:在14篇关于酱油GC-O分析的文献[3,13,15,18,25-33]中，该物质被鉴定为酱油香气活性化合物的次数。
1.2.1 酸香和醇香物质
酱油中的酸香主要由低分子量的挥发性酸构成，如乙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸。酸类物质能使发酵环境的pH值下降，为酵母的生长和发育提供酸性环境，同时，可与醇类发生酯化反应形成酯类化合物，对香气和口感起着重要作用。酱油中乙酸含量较高，一般可达到1～10 mg/L，但其阈值相对较高(22 mg/L)[2-3]；相比之下，2/3-甲基丁酸的含量需要在发酵过程中有所控制，过高会产生“汗味”“臭袜子味”等异味，影响酱油品质。
乙醇是酱油醇类中含量最高的挥发性化合物，一般含量为3 000～10 000 mg/L[1,3]。日式酱油的醇香显著强于中式酱油，这与其发酵工艺中酵母的代谢密切相关，部分产品还有添加乙醇，以提高酱油的防腐性能[1]。
1.2.2 麦芽香物质
2/3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醛和2/3-甲基丁醛是酱油“麦芽香”的重要来源，该类物质与氨基酸的代谢关系密切，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，这一类氨基酸前体的广泛存在，使得它们在多种食品中都具有香气活性，如大豆酱[34]、黑巧克力等。
1.2.3 花香和果香物质
在花香特征上，苯乙醇和苯乙醛是主要的贡献者，具有“花香”“甜香”和“蜂蜜香”，与苯丙氨酸的代谢相关，两者在酱油中平均香气强度达到3.6，检出频次超过80%，是酱油中重要的香气物质，也在很多食品(如奶酪、面包和红酒)中被鉴定为关键香气活性化合物[35]，同时也是花朵芬芳的重要来源。
酱油中果香与乙酯类化合物密切相关，主要包括乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯和异丁酸乙酯，特别是异丁酸乙酯，具有特征的苹果香味，带给酱油浓郁而柔和的特征[1]，但在低分辨MS的鉴定中异丁酸乙酯容易被前一个物质覆盖，利用高分辨质谱结合解卷积可以有效鉴定该物质[23]。在日式酱油中乙酯类化合物的含量相对中式酱油更高[31]，约为中式酱油的4～5倍，使得日式酱油具有较为浓郁的果香，这与酵母的代谢活动有关。
1.2.4 焦糖香物质
由表1可知，焦糖香化合物平均香气强度为3.4分，平均检出频次达到64%，是酱油重要的香气特征之一，其物质基础是HEMF、HDMF、麦芽酚和sotolone等，这些化合物的分子结构特征均是环酮分子中含有烯醇化的结构单元[2]。焦糖香气物质中，检出频次最高的物质为HEMF，俗称酱油酮，在GC-MS检测时，这个物质一般能检出2个同分异构体，包括4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和4-羟基-5-乙基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮，典型离子碎片为142 m/z。本研究团队曾调查了27种商业酱油的香气活性化合物，HEMF在酱油的所有香气活性化合物中，平均OAV值排第二，最高可达到2 163[36]。此外，sotolone的检出频次为焦糖香化合物中最低，但其平均香气强度排名第一，这可能与其挥发特性及检测方法的选用有关，该物质除贡献焦糖香外，还常被描述为调味品香[2-3]。
1.2.5 烟熏香物质
烟熏香化合物检出频次达到71%，2,6-二甲氧基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚(4-EG)和4-乙烯基愈创木酚这4种甲氧基酚类化合物是最主要的贡献者，常被描述为“烟熏”“焦香”及“培根”等[3,12]。该类化合物检出最多的4-乙基愈创木酚具有强烈的烟熏香和培根香，是日韩酱油香气的重要贡献化合物。
1.2.6 烘烤香物质
贡献烘烤香的物质主要是吡嗪类化合物，常检出的有2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，吡嗪类化合物是含有1,4-二氮杂苯母环的一类化合物的总称，经常在坚果、芝麻和花生等焙烤食品中发现，贡献着烘烤香和坚果香[2-3]。该类物质在酱油中具有中等香气强度(2.7分)，检出频次较低。这与酱油中常检出的几类吡嗪类化合物阈值较高是有关系的，前期对商业酱油的研究中发现其OAV值都小于1[36]。
1.2.7 蔬菜香物质
蔬菜香型包括“蘑菇香”“煮熟的洋葱味”和“烤土豆味”等，具有较高的香气强度(3.1分)，且检出频次达到68%。1-辛烯-3-醇具有类似蘑菇的香气，也被称之为蘑菇醇。二甲基三硫除了贡献“煮熟的洋葱味”，还贡献“硫黄味”。“烤土豆味”有两个典型的化合物，即3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇，而3-甲硫基丙醛是酱油[3]和豆酱[34]等发酵豆制品中常见的香气活性化合物。二甲基三硫、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇是酱油中最常检出的含硫化合物，虽然含量不高，但具有较低的阈值[2]，故具有较强的香气贡献。
酱油的滋味具有五味调和、咸鲜突出的特点，其基本研究思路与香气类似，也包括感官和非挥发性物质分析两个部分(图1)。感官分析一般采用人来评价酱油的滋味特点，但其盐浓度常高达16%～18%，感官分析难度较高。近年来，电子舌技术也被引入到酱油滋味的研究中，通过驯化建立模型，可以用来辅助酱油调配工作[37]。同时，随着分离和检测技术的发展，非挥发性物质的鉴定种类也与日俱增，关注对象从乳酸、谷氨酸等，逐渐扩展到了糖类、氨基酸、肽和美拉德反应产物等，代谢组学思想的引入更是为传统发酵行业的科学发展注入了新力量。
采用HPLC和氨基酸分析仪，一般能从酱油中检测到15～18种氨基酸[4,38-39]和7～10种糖类物质。随后，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、LC-MS、UPLC-MS/MS、GC-MS衍生化等组学技术的发展和应用，进一步揭秘了酱油的物质基础。笔者和团队成员曾优化并采用以上几种技术研究酱油的小分子代谢物质，并结合文献报道，总结发现，NMR和GC-MS衍生化适合于初级代谢产物(糖、糖醇、有机酸等)的检测，而LC-MS和UPLC-MS/MS相对更适合次级代谢产物和肽类物质的分析，也包括一系列氨基酸和肽的衍生物。Kamal等[40]和林涵玉[41]采用 NMR 技术分别从酱油中检测到 18、24种非挥发性化合物，而GC-MS结合衍生化法[42-43]，可鉴定出50～100种化合物，包括糖、氨基酸、糖醇、有机酸、核苷酸等；UPLC-MS/MS技术的应用，将物质鉴定数量更是提高到了155～427种[44-46]。
关键滋味化合物的分析也随着分子感官科学的不断革新有了新的进展，主要包括以下几方面的技术。QDA表征酱油酸甜苦咸鲜以及浓厚六个维度的滋味强度，为分析滋味物质基础打下了良好的基础。此外，滋味稀释分析(TDA)[47]是一种基于凝胶色谱、HPLC分离，并通过感官分析连续稀释级分，以在食品复杂的混合物中鉴定出最强烈的滋味化合物的技术，它的应用是食品关键滋味活性化合物分析的里程碑[48]。本团队采用该方法从酱油中鉴定得到了15条鲜味肽[49-50]，然而该类方法工作量大，研究周期相对较长。此外，重组、缺失实验也被应用到红酒[51]和绿茶[52]上，用于鉴定其关键滋味化合物，而酱油中非挥发性化合物的种类和数量众多，如何将这一些技术更好地应用于酱油值得关注。
对已发表的文献总结发现，在酱油中共检测到230种非挥发性化合物，包括90种肽、49种有机酸、27种氨基酸及其衍生物、28种糖、11种糖醇、6种生物胺、4种核苷酸和16种其他类化合物，结果见图5，这些物质分别构成了酱油的酸、甜、苦、咸、鲜和浓厚味。
图5 酱油中不同种类非挥发性化合物的数量
Fig.5 Number of different types of non-volatile compounds in soy sauce
2.2.1 酸味物质
酱油的酸味主要贡献者是种类繁多的有机酸，包括挥发性和非挥发性的。非挥发性有机酸主要有乳酸、琥珀酸、酒石酸和柠檬酸等[41]。有机酸可以调和酱油的风味，如乳酸可以赋予酱油圆润绵长的口感，在酱油风味中能够缓解咸味[1]，而Kong等[53]发现，乳酸和焦谷氨酸能够平衡中式酱油的滋味。
2.2.2 甜味物质
酱油甜味的主要来源是糖类物质，如葡萄糖、半乳糖和果糖等单糖[54]，他们来自原料营养物质的水解，此外，也有在调配过程中加入的蔗糖。早期采用HPLC等分离鉴定酱油中的糖类，而GC-MS衍生化法的应用，可从酱油中鉴定出14～23种糖和糖醇类化合物[41,55]，糖醇类化合物的滋味贡献早期报道较少，如赤藓糖醇、半乳糖醇、木糖醇和核糖醇等，值得进一步探讨。
除糖与糖醇类以外，还有一类弱疏水性的氨基酸化合物为酱油贡献甜味，如丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸等，其中丙氨酸具有较强的甜味，在中式和日式酱油中其浓度分别为丙氨酸呈味阈值(60 mg/100 mL)的2.9倍和6.2倍[4]。
2.2.3 苦味物质
氨基酸的滋味与其侧链密切相关，当氨基酸具有强疏水性时，大多数具有苦味，如组氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。除此之外，还有多酚和部分的肽呈苦味，如崔春等[56]在2019年报道的酱油中16条小肽(分子质量<1 000 Da，富含疏水性氨基酸)。本研究团队认为这些苦味物质及其衍生物在适宜的浓度范围内，可能对酱油的浓厚味感具有积极的影响。
2.2.4 咸味物质
高浓度的NaCl(12%～18%)是酱油咸味特征的来源，是酱油中除水以外含量最高的化合物。在发酵过程中，高浓度的盐能够抑制有害微生物的生长，从而保证了酱油的风味和品质。近年来，减盐酱油的开发也成为热潮，如何在发酵过程采用控温、微生物添加等技术来保证减盐酱油的风味品质和安全生产是近年来的研究热点。
2.2.5 鲜味物质
酱油鲜味是其最重要的滋味特征，鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸一直是关注的重点，主要来源于蛋白质的分解，也有部分来源于调配阶段所加入的鲜味剂——谷氨酸钠。这也是酱油品质指标氨基酸态氮所反映的内涵之一。此外，部分有机酸也具有增鲜作用，如琥珀酸[1]。
然而，以上单体物质的重组体系与酱油的鲜味轮廓仍有一定差距，随着分离和鉴定技术的发展，研究人员逐渐发现，食品中肽组分具有呈鲜或增强鲜味感知的能力。据Tamura等[57]发表于1989年的一份研究报告，从牛肉汤中分离鉴定得到一条呈鲜味的八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala，在pH值6.5时其鲜味强度与谷氨酸钠相当，然而后期Van Wassenaar等[58]和Hau[59]报道的结果与之有所矛盾。这些报道拉开了呈味肽研究的序幕，2004年，Lioe等[38]研究了酱油中的呈味肽段，发现<500 Da的酱油组分鲜味最强。代谢组学技术的发展解决了肽段结构的解析难题，Yamamoto等[43]通过数学模型分析了酱油中237个二肽与滋味之间的相关性，得到5条与鲜味高度相关的二肽。本团队也采用不同的分离技术从酱油中分离出了鲜味肽，并分别鉴定了5条和10条鲜味肽结构[49-50]。
酱油的鲜味研究并不止步于此，还有更多的鲜味及鲜味增强物质在不断地被发现。2014年，Shiga等[45]在酱油中发现了一种美拉德反应产物N-(1-deoxyfructos-1-yl)glutamic acid(Fru-Glu)，其鲜味强度高于对应浓度的谷氨酸。此外，Fru-pGlu、Fru-Val、pGlu-Gln、pGlu-Val、Lac-Glu、Lac-Leu等一系列氨基酸衍生物的新发现为酱油研究打开了新方向，部分物质已经被验证具有鲜味增强作用[44,60-61]。由此可见，酱油鲜味的秘密还未完全解开，仍值得深入探索。
2.2.6 浓厚味物质
酸甜苦咸鲜五种基本滋味无法全面概括酱油的滋味特征。Ueda等[62]在1990提出了一种新的滋味属性 “kokumi”(浓厚味)，是一种绵延感、饱满感和厚重感的综合味感，他们的研究表明：大蒜水提取物中的含硫化合物，特别是谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)能够增强 kokumi 味。2013年，Kuroda等[46]首次证实酱油中存在γ-Glu-Val-Gly，说明酱油的kokumi味可能与其肽及相关衍生物关系密切。
风味物质的组成及其之间的相互作用共同决定了酱油的风味效果。近些年来，研究人员关注到酱油的香气对滋味感知也有影响。Onuma等[63]和Chokumnoyporn等[64]研究发现将酱油香气添加到NaCl溶液和食品体系中可以增强其咸味感知。为了进一步探明互作的物质基础，本团队采用气相色谱-嗅闻/与滋味相关(GC-O/AT)技术明确了酱油中与咸/鲜味相关的香气化合物，发现香气与滋味特征存在一致性，并且3-甲硫基丙醛具有最强的增咸和增鲜作用[33]。酱油的滋味与滋味之间也存在交互作用。Imamura等[65]研究发现酱油中一种多糖能够抑制鲜味回味，Kim等[66]在韩国酱油中分离得到的F05鲜味活性组分，能够掩蔽部分苦味。未来，食品的风味交互作用仍有大量的空白区域值得深入探索。
酱油中富含诸如类黑精、呋喃类化合物、异黄酮类化合物、大豆多肽等生理活性物质，使得酱油在起到调味作用的同时也具有较好的功能特性，如抗氧化、抗癌、降血压、降尿酸、抗过敏、抗血小板产生、抗白内障等，其中前3种活性物质的功能研究较为深入，甚至在临床中已有应用。现将研究中发现的酱油生理活性物质及功能特性归纳于表2。
表2 酱油生理活性物质及功能研究总结
Tab.2 Summary of researches on physiological active substances and their functions in soy sauce
活性成分功能分离技术分析方法参考文献麦芽酚抗氧化作用柱层析色谱分离技术ABTS法[67]类黑精抗氧化作用凝胶过滤层析法ABTS法[67]HEMF,HDMF和HMF抗氧化作用-动物实验[68]Leu-Leu-Pro-His-His多肽抗氧化作用反相高效液相色谱法硫氰酸铁法[69]Try,Met,His,Lys和Trp抗氧化作用高效液相色谱法DPPH法[70]儿茶酚,大豆苷元,flazin和perlolyrin抗癌作用柱层析色谱分离技术细胞实验[7]HEMF,HDMF和HMF抗癌作用-动物实验[8]异黄酮抗癌作用反相高效液相色谱法动物实验[71]大豆多肽降血压作用-动物实验[72-73]烟酰胺降血压作用高效液相色谱法动物实验[9]flazin,邻苯二酚、染料木素及3,4-二羟基肉桂酸乙酯降尿酸作用柱层析色谱分离技术XOD抑制率测定[74]细胞壁上多糖物质抗过敏作用透析动物实验及透明质酸酶抑制作用测定[10]HEMF,HDMF和HMF抗白内障作用-动物实验[75]1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline(MTBC)及1-methyl-β-carboline(MBC)抗血小板产生高效液相色谱法动物实验[76]-促进胃液分泌-动物实验[77]NaCl、乙醇、pH、防腐剂和温度的共同作用杀菌作用-动物实验[78]酱油多糖降血脂作用透析动物实验及胰脂肪酶抑制作用测定[79]
通过体内与体外实验验证，酱油是一种极为有效的抗氧化剂[6,80]，新加坡国立大学的研究人员发现酱油相对于咖喱酱、料酒等多种亚洲调味料，其抗氧化活性具有明显优势，特别是老抽，约为红酒抗氧化活力的10倍左右。这与Li等[5]的研究结果相符，通过对41种市售酱油的基本成分和抗氧化活性分析，也发现老抽具有最高的抗氧化活性，PLS回归分析表明酱油的抗氧化活性与褐变指数密切相关；Wang等[67]发现麦芽酚和类黑精等含碳水化合物的色素是酱油具有高抗氧化能力的主要原因。
此外，大豆异黄酮的抗氧化活性也常常被关注，其可作用于氧自由基和脂过氧化物以预防动脉粥样硬化等疾病[81]。Kinoshita等[71]利用HPLC从发酵酱油中分离得到了3种异黄酮衍生物，鉴定为大豆素、染料木素与8-羟基染料木素的衍生物；本团队采用UPLC-MS/MS揭示了15种大豆异黄酮在酱油制曲和酱醪发酵全过程的变化规律，发现随着发酵的进行，大豆异黄酮从苷类异黄酮逐渐转化为高活性的苷元类黄酮以及羟基异黄酮，且在发酵过程中，羟基大豆苷元的抗氧化活力贡献约为大豆苷元的100～500倍，属于“少量关键”的功能性物质。Kataoka等[68]的实验表明HEMF、HDMF、HMF这类呋喃酮类化合物具有抗氧化作用，且发现HEMF、HDMF比抗坏血酸的抗氧化效果更好，其活性分别为抗坏血酸的1.52倍和1.28倍；Chen等[69]通过分离纯化大豆蛋白水解物和硫氰酸铁法将多肽Leu-Leu-Pro-His-His判定为抗氧化肽；Yang等[70]发现酱糟蛋白水解物的抗氧化活性较佳，可能与其抗氧化氨基酸Try、Met、His、Lys和Trp含量较高有关。
酱油中活性成分的抗癌作用与抗氧化作用具有相关性[82]，如异黄酮和呋喃酮等。大豆苷被发现对ZR-75-1乳癌具有抗增殖的作用，而染料木苷与哺乳动物肿瘤减少有着极大的相关性[83]；酱油中含有的呋喃酮类化合物也具有抗癌作用，Nagahara等[8]早在1991年便验证了HEMF能抑制BP 诱导老鼠胃瘤形成，此后Kataoka等[68]在1997年证实了HMF和HDMF具有同样的效果，其中HDMF是抗癌能力最强的成分。此外，威斯康星大学食品研究所发现酱油中含有的缀合亚油酸能有效地抑制皮肤癌和胃癌[84]；李莹等[7]采用柱层析色谱分离技术从发酵酱油弱极性部分中分离鉴定出了4种具有醌还原酶(QR)诱导活性的化合物，进而诱导Ⅱ相酶从而实现对癌症的预防作用[85]，主要包括儿茶酚、大豆苷元、flazin和perlolyrin。
对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制效果为评估降血压活性的常用指标。黄骊虹[72]研究表明大豆多肽可抑制ACE的作用；Hata等[86]和Kawasaki等[73]陆续发现无盐酱油中部分肽段如Ile-Pro-Pro、Val-Pro-Pro和Val-Tyr对于轻度高血压患者具有降压作用。此外，Kinoshita等[9]在酱油中发现了具有ACE抑制活性的成分——烟酰胺。
Li等[74]发现酱油(1.8 mL/kg)可以有效降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠血清中的尿酸水平，并认为降低血清尿酸水平的机制之一可能是抑制了血清黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性。随后其以XOD抑制活性为导向，通过硅胶柱层析、凝胶柱层析及半制备HPLC分离等一系列的方法从酱油中分离纯化得到10种活性化合物，其中flazin的XOD抑制活性最强，且为首次报道，IC50值为0.51 mM，其次，邻苯二酚、染料木素和3,4-二羟基肉桂酸乙酯均有较强的XOD抑制活性，作者还进一步揭示了这些关键活性化合物的作用机制和相互作用。
Kobayashi[10]发现酱油多糖具有抗过敏的作用；Sasaki等[75]发现HEMF、HDMF和HMF在具有抗氧化和抗癌作用的同时，还兼具抗白内障的作用。除此之外，酱油中的活性成分还具有促进胃液分泌、抗贫血及降血脂的作用。
整体而言，关于酱油的风味物质和功能活性已有大量研究报道，关键物质的揭示将为其品质调控提供明确的目标和方向，如何全面地解析这些成分、确定关键活性化合物，并对其进行有效的调控，一直是调味品行业的研究热点。同时，未来仍有许多值得深入探索的地方，如酱油鲜味的秘密，如何进一步挖掘增鲜肽等鲜味物质基础并定向调控富集，风味的交互作用如何影响酱油的产品品质，以及酱油风味功能菌的分离鉴定、交互研究和开发应用，都是酱油企业及传统发酵行业需要继续关注的研究方向。相信随着检测技术和分析方法的不断发展，基于多组学技术联合的酿造工艺升级和品质定向调控将不断突破，更有利于系统解密酱油酿造，进一步增强发酵产品品质的调控效果。
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