碱性蛋白酶来源丰富，且具有较高的酶活力和广泛的底物特异性，但由于一般游离酶在实际工业生产中的性质多不稳定，耐酸碱、耐热性不强；并且液体酶会随着时间的延长而发生降解[1]，导致生产条件难以控制，造成酶及原料的浪费。聚电解质刷因具有丰富的官能团、三维立体空间，其与蛋白质形成的复合物不但能提高蛋白质的稳定性和酶的活性[2]，还能给酶提供支撑，影响酶的微环境[3]，避免蛋白质的团聚、沉淀和变性，在蛋白质的固定方面有很大应用前景[4-6]。球形聚电解质刷是将线性聚电解质链接枝在球形粒子表面形成的组装结构。目前对球形聚电解质刷的研究多集中在制备与表征方面[7-8]，对其作为酶的固定化载体，对酶活性影响的研究较少。本研究以自制纳米球形聚电解质刷为载体，制备合成固定化碱性蛋白酶，并对其酶学性质进行表征，以期为固定化酶的工业发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
光引发剂Irgacure 2959，巴斯夫(中国)有限公司；丙酮，国药集团化学试剂有限公司；吡啶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基丙烯酰氯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；氯仿，国药集团化学试剂有限公司；过硫酸钾、苯乙烯、亚硫酸氢钠，西陇科学股份有限公司；丙烯酸，上海麦克林生化科技有限公司；硅胶，国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。碱性蛋白酶(生化试剂)，上海源叶生物科技有限公司；氮气(高纯)，北京氧利来科技发展有限公司；十二烷基磺酸钠(优级纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；薄层层析板(Silica 60)，德国默克公司。其他试剂均为分析纯。过硫酸钾、十二烷基磺酸钠经重结晶处理，丙酮、丙烯酸经旋蒸提纯处理，均保存于4 ℃冰箱。
1.2 仪器与设备
自制紫外光反应器，北京泊菲莱科技有限公司；TSD01-1型微量注射泵，保定雷弗流体科技有限公司；Nicolet iS50型傅立叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司；JEM-2100型透射电子显微镜，日本电子株式会社；Zetasizer Nano ZS型激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；R300型旋转蒸发仪，瑞士步琦有限公司；DHZ-DA型全温振荡器，苏州培英实验设备有限公司；iMark型酶标仪,美国Bio-Rad公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Sigma1-14型台式离心机，美国Sigma公司。
1.3 纳米球形聚电解质刷的制备
1.3.1 疏水型光引发剂的合成
称取30g的光引发剂、丙酮150 mL，30 ℃搅拌至溶解。体系冷却后，加入10 mL吡啶,搅拌均匀。称取13.6g甲基丙烯酰氯，溶解于50 mL丙酮中，使用微量注射泵以0.8 mL/min的速度滴加至反应体系。滴加完毕后，在冰水浴下继续搅拌30 min，除去冰水浴，在30 ℃水浴下反应12 h。反应完毕后，获得浅黄色产物，将其过滤除杂,25 ℃避光旋蒸，得到黄色油状产物。
利用硅胶柱对旋蒸产物进行避光纯化，洗脱液丙酮及氯仿体积比为1∶5。通过层析点板确定并收集纯化后产物，得到疏水型光引发剂2-(对2-羟基-2甲基苯丙酮)-甲基丙烯酸羟乙酯(HMEM)。将产物与丙酮以质量比1∶8混合溶解，密封避光保存于4 ℃冰箱中。
1.3.2 聚苯乙烯核的合成
称取0.74 g 过硫酸钾、0.24 g 十二烷基磺酸钠、9.8 g苯乙烯及200 mL去离子水，先后加入到500 mL三口烧瓶中，340 r/min、35 ℃，在氮气保护下进行反应。将0.14 g亚硫酸氢钠溶于50 mL去离子水中，加入烧瓶。反应结束后，得到球形聚苯乙烯核乳液，并对反应体系装置进行避光处理。称取9.0 g光引发剂，通过微量注射泵以0.05 mL/min的流速加入到反应体系内。滴加完毕后,反应继续进行2.5 h。反应结束后,关闭加热器，冷却10 min，得到聚苯乙烯核(PS)。
1.3.3 光乳液聚合法制备纳米球形聚电解质刷
测定聚苯乙烯核乳液的固体含量。称取100 g乳液，加入一定量的丙烯酸单体，加入容积约为500 mL的光反应器中，加纯水至整个反应体系总质量为500 g。对该系统抽真空再充氮气循环4次，以保证整个反应在氮气的保护下完成，并用铝箔进行全面避光处理。反应进行40 min后，得到纳米球形聚电解质刷(PS-HMEM-AA)乳液。
1.4 纳米球形聚电解质刷的表征
采用透射电子显微镜(TEM)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、激光粒度仪和核磁共振氢谱(1HNMR)对纳米球形聚电解质刷及固定化酶的形貌进行表征。采用FT-IR对Irgacure 2959、HMEM、PS和包裹引发剂的纳米微球(PS-HMEM)的化学结构进行分析，扫描区间为 4 000～400 cm-1；采用核磁共振氢谱对光引发剂的化学结构进行分析，使用氘代丙酮作为溶剂，以四甲基硅烷为内标液，室温下检测；采用马尔文激光粒度仪对载体的粒径进行测定。
1.5 酶的固定化
称取1 mg载体，加入酶液，漩涡混匀，4 ℃，180 r/min，震荡吸附。吸附结束后，离心、沉淀即为固定化酶。
1.5.1 酶的固定化条件的确定
其他条件不变，分别以固定化碱性蛋白酶的固定化pH值 (7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、酶添加量 (0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL) 、固定化时间 (2、3、4、5、6、7、8 h) 作为单一变量，进行单因素实验，得到最佳固定化酶条件。
1.5.2 固定化酶性质研究
1.5.2.1 最适反应温度和pH值的确定
分别在不同温度和不同pH值条件下测定固定化酶和游离酶的酶活力，酶活力以最高酶活力的相对百分数来表示。
1.5.2.2 热稳定性和酸碱稳定性的确定
取一定量的固定化酶和游离酶在同一pH值下处理3 h，在不同温度下测定游离酶和固定化酶的活力；在相同温度下保温3 h，在不同 pH 值下测定游离酶和固定化酶的活力。残余酶活力以相对于处理前酶活力的百分数来表示。
1.6 测定方法
1.6.1 酶活力测定
在 40 ℃、pH值 8.0 的条件下，将单位质量(g)固定化酶在单位时间(min)内水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需的酶量作为一个酶活力单位，以U/g表示[9]。
酶的相对活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值，%。
1.6.2 蛋白含量的测定
采用BCA法进行蛋白含量测定，标准蛋白为牛血清蛋白，测定蛋白样品在595 nm下的吸收值，根据标准曲线计算其中的蛋白含量。
2 结果与分析
2.1 纳米球形聚电解质刷化学结构分析
2.1.1 核磁共振氢谱分析结果
引发剂Irgacure是一种高效的紫外光引发剂，可用于和单体的紫外聚合反应，但由于Irgacure 2959中存在羟基，表现出一定的亲水性，不利于在疏水的聚苯乙烯微球表面引发聚合。按Schotten-Baumann反应原理，使用甲基丙烯酰氯对引发剂进行改性，使得引发剂末端得到疏水的亚甲基和甲基，并同时具有C
C双键，可以通过共聚方式发生化学键合而接枝在聚苯乙烯分子链上，从而制备疏水型可聚合光引发剂HMEM[10]。
分别对Irgacure 2959与HMEM进行核磁共振氢谱分析，使用氘代丙酮为溶剂，结果如图1。图1(b)中位移在5.69×10-6与6.10×10-6的特征峰为双键的特征峰，说明乙烯基被成功引入到光引发剂中，验证了CC的存在，表明已成功地把甲基丙烯酰氯当中的CC接枝Irgacure2959末端。
图1 Irgacure 2959和HMEM的1HNMR谱
Fig.1 1HNMR spectrum of Irgacure 2959 and HMEM
2.1.2 红外光谱分析结果
分别对Irgacure 2959与HMEM进行FT-IR分析，结果如图2。图中HMEM在1 636 cm-1和1 713 cm-1处比Irgacure 2959多出两个吸收峰，正是CC双键的伸缩振动和—COOH上的CO双键的伸缩振动峰，验证了HMEM分子中CC双键及甲基丙烯酰基的存在，Irgacure2959已被成功改性。
因为HMEM光引发剂的末端CC双键的存在，在乳液聚合反应后期，使其能够与苯乙烯进行自由基共聚，HMEM将以化学键合的方式接枝在PS微球表面，形成PS-HMEM纳米微球，结果如图3。图3中PS微球和 PS-HMEM纳米微球具有类似的化学结构，红外特征吸收峰相近，然而在PS-HMEM纳米微球的红外光谱中，出现了两个新的吸收峰。在1 731 cm-1处的吸收峰，对应为HMEM分子上与酯基相连的CO伸缩振动；另一个在1 255 cm-1、1 163 cm-1处的吸收峰，与叔醇上的C—O的伸缩振动相对应。这个结果说明，光引发剂HMEM和PS纳米微球通过化学键合作用相连接，然而由于HMEM在PS-HMEM纳米微粒中含量不高，因此HMEM红外特征峰的强度不强，红外谱图整体仍与PS相似。
图2 Irgacure 2959和HMEM的红外光谱
Fig.2 Infrared spectra of Irgacure 2959 and HMEM
图3 PS和PS-HMEM的红外光谱
Fig.3 Infrared spectra of PS and PS-HMEM
2.1.3 透射电子显微镜分析结果
图4 样品的TEM图像
Fig.4 TEM images of samples
对PS、PS-HMEM、PS-HMEM-AA进行TEM分析，结果如图4。由于引发剂在聚苯乙烯微球表面的接枝厚度只有1～2 nm，因此很难从透射电镜照片中区别。聚丙烯酸的电子云密度小，在透射电镜下的对比度较弱，同时聚电解质链在高速电子冲击下会产生降解，因此很难观察到纳米球形聚电解质刷的核壳结构[11];但通过透射电镜的表征可以清楚看到纳米球形聚电解质刷颗粒具有良好的单分散性，粒径分布均匀，且呈现规整的球形。
2.2 聚电解质刷固定化碱性蛋白酶条件优化研究
图5 pH值对酶固定化效果的影响
Fig.5 Effect of pH values on phospholipase immobilization
图6 酶液添加量对酶固定化效果的影响
Fig.6 Effect of enzyme dosages on phospholipase immobilization
图7 固定化时间对酶固定化效果的影响
Fig.7 Effect of reaction time on phospholipase immobilization
碱性蛋白酶固定化条件的单因素实验结果见图5到图7。聚电解质对于pH值非常敏感，不同 pH值条件下聚电解质间的相互作用及控制聚电解质的有效电荷密度不同[12]。从图5可以看出，pH值为9.0时酶活力达到最高。从图6可以看出，在加酶量较低时，酶活力随着加酶量的增加而提高，当加酶量达到1.2 mg/mL后，继续加大酶量，固定化酶的酶活反而会下降。这是由于一定量的载体可以固定的酶量是一定的，当载体固定化位点达到饱和，再继续添加酶反而会使酶分子聚集成团，使酶分子之间的活性位点彼此覆盖，空间位阻增大，对酶活产生抑制作用,使酶的利用率下降。从图7可以看出，酶活力在初始阶段随着时间的增加而提高，在6 h时达到最高，继续增加固定化时间，酶活力基本保持不变。原因是在初始阶段随着时间的推移，酶分子不断固定到载体上，当载体上活性基团连接的酶分子达到饱和后，继续增加时间，酶分子与载体也不会发生有效的固定化反应，酶活力和蛋白固载率基本保持不变。综合分析结果，选择pH值为9.0，加酶量1.2 mg/mL，固定化6 h作为优化的固定化碱性蛋白酶条件。
2.3 游离酶及固定化酶酶学性质对比分析
2.3.1 温度对酶活性的影响
在不同温度下测定游离酶和固定化酶的酶活性，以酶活力最大的组为100%，其余各组的酶活力与最大酶活力之比即为相对酶活力，结果见图8。由图8可知，碱性蛋白酶游离酶的最适反应温度为 45 ℃，固定化酶的最适反应温度为 60 ℃，最适温度提高15 ℃。温度继续升高，由于酶活性部位受到高温破坏导致酶活力下降，而游离酶酶活力的下降速度明显比固定酶快。聚电解质能防止热力学诱导的蛋白质变性，从而保证蛋白质的稳定性。固定化使酶的结构更稳定，蛋白的变性温度升高，使其对温度的耐受程度得到提高[12]。
图8 温度与游离酶和固定化酶活性的关系
Fig.8 Effect of temperature on activity of free enzymes and immobilized enzymes
2.3.2 pH值对酶活性的影响
在不同pH值条件下测定游离酶和固定化酶的活性，结果见图9。聚电解质刷链层中反离子的富集和释放使聚合物刷的空间结构发生改变，导致聚合物链的伸展和塌陷，弱聚电解质刷的链伸展随pH值变化[13]。束缚于聚电解质刷中的反离子产生高渗透压使聚合物刷“溶胀”，可为反离子富集和生物分子固定提供空间。球形聚电解质刷内部能保持pH值相对稳定，吸附大量的生物分子后能极大地保留生物分子的功能和活性[14]。由图9可知，游离酶的最适反应pH值为11.0，固定化酶的最适反应pH值为9.0，分析可能是固定化载体材料使酶的微观环境发生变化。固定化酶相对于游离酶可在较宽酸碱范围内保持较高活性，表明固定化酶 pH值适用范围更加宽泛，酸碱稳定性比游离酶更好。说明酶固定在载体上后，酶分子的构象更加稳定，使得酶对pH值的敏感性降低。
图9 pH值与游离酶和固定化酶活性的关系
Fig.9 Effect of pH values on activity of free enzymes and immobilized enzymes
2.3.3 热稳定性分析
对处理后的固定化酶和游离酶进行酶活性测定，观察其酶活力的变化规律，结果见图10。从图10中可以看出：经 60 ℃热处理后，游离酶、固定化酶几乎完全失活，但固定化酶的热稳定性在很宽的温度范围内均呈现升高趋势。图10表明，载体表面的柔性聚合物链对酶蛋白的包裹，增加了酶的紧密度，有效地避免了酶蛋白与刚性的载体表面接触发生构型变化而导致酶活性丧失[15]。聚合物链与酶蛋白分子活性中心的相互作用更加稳定了酶分子构象[16]，从而减少了其高热致构象变化的可能，对保持蛋白活性、提高酶分子的抗热失活的能力起着重要作用。
图10 游离酶和固定化酶的热稳定性
Fig.10 Thermal stabilities of free and immobilized enzymes
2.3.4 酸碱稳定性分析
对处理后的固定化酶和游离酶进行酶活性测定，观察其酶活力的变化规律，结果见图11。从图11中可以看出：固定化酶在pH 值为7.5～11.0时，酶活力均在90%以上，固定化酶相对于游离酶可在较宽酸碱范围内保持较高活性。球形聚电解质刷能极大地保留酶的活性[17]，酶蛋白被聚电解质链包裹后，其分子构象更加牢固，提高了酶的刚性，减少酸碱变化过程中构象的变化，从而提高了酸碱稳定性。
图11 游离酶和固定化酶的酸碱稳定性
Fig.11 Acid-base stabilities of free and immobilized enzymes
3 结 论
通过 TEM、FT-IR、1HNMR对纳米球形聚电解质刷的形貌、结构等进行了表征。微球呈规则圆形，单分散性良好。用FT-IR、1H NMR分析微球的特征官能团结构，结果表明：引发剂成功改性为疏水型光引发剂，丙烯酸单体成功接枝到聚苯乙烯微球表面，得到纳米球形聚电解质刷载体。球刷固定化碱性蛋白酶最适温度提高15 ℃，热稳定性、酸碱稳定性均有所提高；相对于游离酶，经纳米球形聚电解质刷固定化后，酶的活性中心构象更稳固，削弱了不利因素对酶活性的影响，增加了固定化酶的稳定性，有利于其工业化应用。今后，在固定化酶的研究方面还需要不断对固定化酶的载体和固定化方法加以创新，寻找到经济合理、稳定性高、固定化效果好的酶固定化方法，减少对游离酶的浪费，降低其工业生产成本。
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